Name: quantification of fungal colonization, sporogenesis, and production of mycotoxins using kernel bioassays
Uploaded: 2012-04-23T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Fungal Colonization, Sporogenesis, and Production of Mycotoxins Using Kernel Bioassays at JoVE.com

Gostaríamos de agradecer Brandon Hassett e Carlos Ortiz por sua assistência técnica. Este trabalho foi financiado pela NSF subsídios IOB-0544428, 0951272-IOS e IOS-0925561 com o Dr. Michael Kolomiets, e pelo USDA Instituto Nacional de Alimentação e Agricultura (Nifa), Melhoramento de Plantas DRFA e Grant Educação # 2010-85117 -20539 para os drs. Seth Murray, Thomas Isakeit e Kolomiets Michael.

1. Bioensaio Kernel milho <ol><li> Duas semanas antes da cultura, os fungos patogénicos em Agar de Batata Dextrose (PDA) a 28 ° C. </li><li> Seleccione grãos com tamanho e forma semelhantes, de preferência achatada assim que colocam em nível com a parte inferior de frascos de bioensaio, e colocar em tubos de 50 ml Falcon. Kernels seleccionados devem ter sido produzidos simultaneamente em mesmo ambiente para garantir a idade de sementes semelhante e composição metabolito. </li><li> Tona esterilizar miolo por agi...

<ol>
	<li>Tsitsigiannis, D. I., Keller, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxylipins+as+developmental+and+host-fungal+communication+signals.">Oxylipins as developmental and host-fungal communication signals.</a> Trends Microbiol. 15, 109-118 (2007).</li><li>Gao, X., Shim, W. -. B., G&#246;bel, C., Kunze, S., Feussner, I., Meeley, R., Balint-Kurti, P., Kolomiets, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+a+maize+9-lipoxygenase+results+in+increased+resistance+to+fungal+pathogens+and+reduced+levels+of+contamination+with+mycotoxin+fumonisin.">Disruption of a maize 9-lipoxygenase results in increased resistance to fungal pathogens and reduced levels of contamination with mycotoxin fumonisin.</a> Mol. Plant-Microbe Interact. 20, 922-933 (2007).</li><li>Brodhagen, M., Tsitsigiannis, D. I., Hornung, E., Goebel, C., Feussner, I., Keller, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reciprocal+oxylipin-mediated+cross-talk+in+the+Aspergillus+-+seed+pathosystem.">Reciprocal oxylipin-mediated cross-talk in the Aspergillus - seed pathosystem.</a> Mol. Microbiol. 67, 378-391 (2008).</li><li>Gao, X., Brodhagen, M., Isakeit, T., Brown, S. H., G&#246;bel, C., Betran, J., Feussner, I., Keller, N. P., Kolomiets, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inactivation+of+the+lipoxygenase+ZmLOX3+increases+susceptibility+of+maize+to+Aspergillus+spp.">Inactivation of the lipoxygenase ZmLOX3 increases susceptibility of maize to Aspergillus spp.</a> Mol. Plant-Microbe Interact. 22, 222-231 (2009).</li><li>Gao, X. Q., Kolomiets, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host-derived+lipids+and+oxylipins+are+crucial+signals+in+modulating+mycotoxin+production+by+fungi.">Host-derived lipids and oxylipins are crucial signals in modulating mycotoxin production by fungi.</a> Toxin Rev. 28, 79-88 (2009).</li><li>Mukherjee, M., Kim, J. -. E., Park, Y. -. S., Kolomiets, M. V., Shim, W. -. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulators+of+G+protein+signaling+in+F.+verticillioides+mediate+differential+host-pathogen+responses+on+non-viable+versus+viable+maize+kernels.">Regulators of G protein signaling in F. verticillioides mediate differential host-pathogen responses on non-viable versus viable maize kernels.</a> Mol. Plant Pathol. 12, 479-491 (2011).</li><li>Zheng, M. Z., Richard, J. L., Binder, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+rapid+methods+for+the+analysis+of+mycotoxins.">A review of rapid methods for the analysis of mycotoxins.</a> Mycopathologia. 161, 261-273 (2006).</li><li>Bacon, C. W., Bennett, R. M., Hinton, D. M., Voss, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scanning+electron+microscopy+of+Fusarium+moniliforme+within+asymptomatic+maize+kernels+and+kernels+associated+with+equine+leukoencephalomalacia.">Scanning electron microscopy of Fusarium moniliforme within asymptomatic maize kernels and kernels associated with equine leukoencephalomalacia.</a> Plant Dis. 76, 144-148 (1992).</li><li>Munkvold, G. P., Hellmich, R. L., Rice, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+fumonisin+concentrations+in+kernels+of+transgenic+Bt+maize+hybrids+and+nontransgenic+hybrids.">Comparison of fumonisin concentrations in kernels of transgenic Bt maize hybrids and nontransgenic hybrids.</a> Plant Dis. 83, 130-138 (1999).</li><li>Sagaram, U. S., Shaw, B. D., Shim, W. -. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fusarium+verticillioides+GAP!,+a+gene+encoding+a+putative+glycolipid-anchored+surface+protein,+participates+in+conidiation+and+cell+wall+structure+but+not+virulence.">Fusarium verticillioides GAP!, a gene encoding a putative glycolipid-anchored surface protein, participates in conidiation and cell wall structure but not virulence.</a> Microbiol. 153, 2850-2861 (2007).</li><li>Shim, W. -. B., Flaherty, J. E., Woloshuk, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Fumonisin+B1+biosynthesis+in+maize+germ+and+degermed+kernels+by+Fusarium+verticillioides.">Comparison of Fumonisin B1 biosynthesis in maize germ and degermed kernels by Fusarium verticillioides.</a> J. Food Protect. 66, 2116-2122 (2003).</li><li>Shim, W. -. B., Woloshuk, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+fumonisin+B1+biosynthesis+and+conidiation+in+Fusarium+verticillioides+by+a+cyclin-like+(C-type)+gene,+FCC1.">Regulation of fumonisin B1 biosynthesis and conidiation in Fusarium verticillioides by a cyclin-like (C-type) gene, FCC1.</a> Appl. Environ. Micrbiol. 67, 1607-1612 (2001).</li><li>Christensen, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Conversation with: Won-Bo Shim. , (2011).</li><li>Shin, J. -. H., Shim, W. -. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+PPR1+and+PPR2,+genes+encoding+regulatory+subunits+of+protein+phosphatase+2A+in+Fusarium+verticillioides.">Characterization of PPR1 and PPR2, genes encoding regulatory subunits of protein phosphatase 2A in Fusarium verticillioides.</a> Phytopathol. 99, S119 (2009).</li><li>Breivik, O. N., Owades, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectrophotometric+Semimicrodetermination+of+Ergosterol+in+Yeast.">Spectrophotometric Semimicrodetermination of Ergosterol in Yeast.</a> Yeast. Agric. and Food Chem. 5, 360-363 (1957).</li></ol>

<p class="jove_content"&gt; Os métodos descritos aqui foram testados extensivamente e provou ser robusto na geração de resultados quantificáveis ​​para a colonização de fungos, esporogênese, e produção de micotoxinas. Além disso, estes métodos devem ser aplicável a sementes de outras espécies de plantas que são susceptíveis de contaminação com fungos micotoxigênico (amendoim, por exemplo, trigo, algodão, pistácios, etc.) Para competentes análises planta-patógeno de interação, é imperativo que as sementes se manter v...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Catalogo </td></tr><tr><td> Agar Batata Dextrose </td><td> Fisher Cientificos </td><td> S71659A </td></tr><tr><td> Tween-20 </td><td> Fisher Cientificos </td><td> BP337-100 </td></tr><tr><td> Recipiente plástico de incubação </td><td> Sterilite </td><td> 1713LAB06 </td></tr><tr><td> Liqüidificador </td><td> Vicam </td><td> 20200 </td></tr><tr><td> 24 centímetros filtro de pregas Papers </td><td> Vicam </td><td> 31240 </td></tr><tr><td> 1,5 mM microfibra de vidro </td><td> Vicam </td><td> 31955 </td></tr><tr><td> Afla coluna Teste </td><td> Vicam </td><td> G1024 </td></tr><tr><td> Afrla Desenvolvedor Teste </td><td> Vicam </td><td> 32010 </td></tr><tr><td> Metanol </td><td> Vicam </td><td> 35016 </td></tr><tr><td> Acetonitrila </td><td> Fisher Cientificos </td><td> AC14952-0025 </td></tr><tr><td> Etanol </td><td> Fisher Scientifc </td><td> AC39769-0025 </td></tr><tr><td> Coluna C-18 de extracção em fase sólida (SPE Prep setembro Coluna C18) </td><td> Fisher Cientificos </td><td> 60108-304 </td></tr><tr><td> O-ftalaldeído (OPA) </td><td> Sigma Chemical Co </td><td> 79.760-5g </td></tr><tr><td> Ácido bórico </td><td> Fisher Cientificos </td><td> BP168-500 </td></tr><tr><td> Borato de sódio </td><td> Fisher Cientificos </td><td> RDCS0330500 </td></tr><tr><td> Mercaptoetanol </td><td> Fisher Cientificos </td><td> 45-000-231 </td></tr><tr><td> Shimadzu HPLC LC-20AT (Pump) </td><td> Shimadzu Scientific Instruments, Inc. </td><td> LC-20AT </td></tr><tr><td> Coluna Zorbax ODS (4.6x150mm) </td><td> Agilent Technologies </td><td> 443905-902 </td></tr><tr><td> Shimatzu detector RF-10Axl fluorescência </td><td> Shimadzu Scientific Instruments, Inc. </td><td> RF-10AXL </td></tr><tr><td> Fosfato de sódio </td><td> Fisher Cientificos </td><td> AC38987-0010 </td></tr><tr><td> FB1 padrões </td><td> Sigma Chemical Co. </td><td> F1147-1mg </td></tr><tr><td> Clorofórmio </td><td> VWR </td><td> MK444410 </td></tr><tr><td> 13 mm com filtro de seringa de 0,45 membrana de nylon UM (HPLC) </td><td> Ciências da Vida Pall </td><td> 4426 </td></tr><tr><td> Ergosterol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 45480-50G-F </td></tr><tr><td> Cintilação frascos </td><td> VWR </td><td> 66021-602 </td></tr><tr><td> Cloreto de Sódio </td><td> Vicam </td><td> G1124 </td></tr></tbody></table>

quantification of fungal colonization, sporogenesis, and production of mycotoxins using kernel bioassays

O apodrecimento de grãos por semente de fungos que infectam representa um dos maiores desafios econômicos à produção mundial de cereais, para não mencionar os riscos graves para a saúde humana e animal. Entre a produção de cereais, o milho é sem dúvida a cultura mais afetada, devido ao patógeno induzidas por perdas na integridade de grãos e sementes de contaminação por micotoxinas. As duas micotoxinas mais prevalentes e problemático para os produtores de milho e alimentos e processadores de alimentos são aflatoxina e fumonisina, produzida por Aspergillus flavus e Fusarium verticillioides, respectivamente. Recentes estudos moleculares em planta-patógeno interações têm demonstrado promessa em compreender os mecanismos específicos associados com a resposta das plantas à infecção por fungos e contaminação por micotoxinas 1,2,3,4,5,6. Porque muitos laboratórios são usando ensaios de kernel para estudar organismos patogénicos de plantas interacções, não há uma necessidade de um método padronizado para quantificar diferentes parâmetros biológicos, de modoresultados de diferentes laboratórios podem ser cross-interpretado. Para um meio robusto e reprodutível para análises quantitativas de sementes, temos desenvolvido ensaios em laboratório e os métodos do kernel posteriores a quantificar o crescimento de fungos, biomassa e contaminação com micotoxinas. Quatro grãos de milho esterilizados são inoculadas em frascos de vidro com a suspensão fúngica (10 6) e incubadas durante um período predeterminado. Frascos de amostra são então seleccionados para a enumeração de conídios por análise de biomassa hemocitómetro, ergosterol baseada por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC), a quantificação aflatoxina utilizando um método AflaTest fluorómetro, e quantificação de fumonisina por HPLC.

Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Fungal Colonization, Sporogenesis, and Production of Mycotoxins Using Kernel Bioassays at JoVE.com

Quantification of Fungal Colonization, Sporogenesis, and Production of Mycotoxins Using Kernel Bioassays

A devastação das culturas de cereais por fungos que infectam sementes de suscitou numerosos esforços de pesquisa para entender melhor planta-patógeno interações. Para estudar sementes de fungos interações em um ambiente de laboratório, nós desenvolvemos um método robusto para a quantificação de reprodução dos fungos, biomassa e contaminação por micotoxinas utilizando bioensaios de kernel.

Quantificação da colonização fúngica, esporogênese, e produção de micotoxinas Utilizando Bioensaios Kernel

The rotting of grains by seed-infecting fungi poses one of the greatest economic challenges to cereal production worldwide, not to mention serious risks ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Colonization of Euprymna scolopes Squid by Vibrio fischeri

Colonization of Euprymna scolopes Squid by Vibrio fischeri

Colonização de Euprymna scolopes Squid por Vibrio fischeri</em

Specific bacteria are found in association with animal tissue1-5. Such host-bacterial associations (symbioses) can be detrimental (pathogenic), have no ...

Imunologia e Infecção

Live-cell Video Microscopy of Fungal Pathogen Phagocytosis

Live-célula Microscopia vídeo de Fagocitose patógeno fúngico

Phagocytic clearance of fungal pathogens, and microorganisms more generally, may be considered to consist of four distinct stages: (i) migration of ...

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

Caracterização de Respostas Inflamatórias Durante Colonização Intranasal com Streptococcus pneumoniae

Nasopharyngeal colonization by Streptococcus pneumoniae is a prerequisite to invasion to the lungs or bloodstream1. This organism is capable of colonizing ...

Isolation, Purification and Labeling of Mouse Bone Marrow Neutrophils for Functional Studies and Adoptive Transfer Experiments

Isolamento, purificação e Rotulagem de neutrófilos da medula óssea do rato de Estudos funcionais e Experimentos de transferência adotiva

Neutrophils are critical effector cells of the innate immune system. They are rapidly recruited at sites of acute inflammation and exert protective or ...

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

Estabelecimento de um<em&gt; In vitro</em&gt; Sistema para estudar o comportamento intracelular de<em&gt; Candida glabrata</em&gt; Em humanos THP-1 macrófagos

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable ...

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

Investigando os efeitos dos probióticos sobre pneumocócica Colonização Usando um<em&gt; In Vitro</em&gt; Adesão Assay

Adherence of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) to the epithelial lining of the nasopharynx can result in colonization and is considered a ...

Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes

Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes

Avaliação da invasão bacteriana de células cardíacas na cultura e colonização cardíaca em camundongos infectados usando listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a Gram-positive facultative intracellular pathogen that is capable of causing serious invasive infections in immunocompromised ...

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

Um modelo murino de Grupo B<em&gt; Streptococcus</em&gt; Colonização Vaginal

Streptococcus agalactiae (group B Streptococcus, GBS), is a Gram-positive, asymptomatic colonizer of the human gastrointestinal tract and vaginal tract of ...

Histological Quantification to Determine Lung Fungal Burden in Experimental Aspergillosis

Histológica quantificação para determinar o pulmão carga fúngica em aspergilose Experimental

The quantification of lung fungal burden is critical for the determination of the relative levels of immune protection and fungal virulence in mouse ...

Real-time Imaging and Quantification of Fungal Biofilm Development Using a Two-Phase Recirculating Flow System

Imagem em tempo real e quantificação de fungos biofilme desenvolvimento usando um sistema bifásico de fluxo de recirculação

In oropharyngeal candidiasis, members of the genus Candida must adhere to and grow on the oral mucosal surface while under the effects of salivary flow. ...