Name: generation of induced regulatory t cells from primary human na&iuml;ve and memory t cells
Uploaded: 2012-04-16T12:00:00
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<p class="jove_content"&gt; Gli autori desiderano ringraziare Jennifer Strange and Greg Bauman per la loro assistenza con l&#39;analisi di Citometria a Flusso e smistamento. Questo lavoro è stato sostenuto dal numero di sovvenzione del NIH 2P20 RR020171 dal NCRR e dalla University of Kentucky di avvio dei fondi di FM; GIE riconosce il sostegno della Compagnia Presidenziale e il Graduate Fellowship Opportunity Kentucky.</p

1. Isolamento di cellule mononucleari del sangue periferico (PBMC) provenienti da Buffy Coat <ol><li> Acquisire una unità di buffy coat dall&#39;ospedale e dintorni posizione centrale sangue. Il nostro centro di sangue ci fornisce circa il 40-60 mL di buffy coat per unità ottenute da donatori di sangue normali. </li><li> Versare il sangue in una bottiglia di vetro sterilizzato 500 mL contenente PBS sterile per diluire buffy coat. Il volume finale di PBS + buffy coat deve essere di 250 mL. </li><li> Riempire dieci pr...

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	<li>Powrie, F., Correa-Oliveira, R., Mauze, S., Coffman, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+interactions+between+CD45RBhigh+and+CD45RBlow+CD4++T+cells+are+important+for+the+balance+between+protective+and+pathogenic+cell-mediated+immunity.">Regulatory interactions between CD45RBhigh and CD45RBlow CD4+ T cells are important for the balance between protective and pathogenic cell-mediated immunity.</a> The Journal of Experimental Medicine. 179, 589-600 (1994).</li><li>Tarbell, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cell-expanded,+islet-specific+CD4++CD25++CD62L++regulatory+T+cells+restore+normoglycemia+in+diabetic+NOD+mice.">Dendritic cell-expanded, islet-specific CD4+ CD25+ CD62L+ regulatory T cells restore normoglycemia in diabetic NOD mice.</a> The Journal of Experimental Medicine. 204, 191-201 (2007).</li><li>Morgan, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+treatment+of+collagen-induced+arthritis+by+adoptive+transfer+of+CD25++regulatory+T+cells.">Effective treatment of collagen-induced arthritis by adoptive transfer of CD25+ regulatory T cells.</a> Arthritis and Rheumatism. 52, 2212-2221 (2005).</li><li>Taylor, P. A., Lees, C. J., Blazar, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+infusion+of+ex+vivo+activated+and+expanded+CD4(+)CD25(+)+immune+regulatory+cells+inhibits+graft-versus-host+disease+lethality.">The infusion of ex vivo activated and expanded CD4(+)CD25(+) immune regulatory cells inhibits graft-versus-host disease lethality.</a> Blood. 99, 3493-3493 (2002).</li><li>Ziegler, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FOXP3:+of+mice+and+men.">FOXP3: of mice and men.</a> Annual Review of Immunology. 24, 209-226 (2006).</li><li>Riley, J. L., June, C. H., Blazar, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+T+regulatory+cell+therapy:+take+a+billion+or+so+and+call+me+in+the+morning.">Human T regulatory cell therapy: take a billion or so and call me in the morning.</a> Immunity. 30, 656-6565 (2009).</li><li>Morgan, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+FOXP3+mRNA+is+not+confined+to+CD4+CD25++T+regulatory+cells+in+humans.">Expression of FOXP3 mRNA is not confined to CD4+CD25+ T regulatory cells in humans.</a> Human Immunology. 66, 13-20 (2005).</li><li>Wang, J., Huizinga, T. W. J., Toew, R. E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+Novo+Generation+and+Enhanced+Suppression+of+Human+CD4+CD25++Regulatory+T+Cells+by+Retinoic+Acid.">De Novo Generation and Enhanced Suppression of Human CD4+CD25+ Regulatory T Cells by Retinoic Acid.</a> Journal of Immunology. 183, 4119-4126 (2009).</li><li>Hori, S., Nomura, T., Sakaguchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+regulatory+T+cell+development+by+the+transcription+factor+Foxp3.">Control of regulatory T cell development by the transcription factor Foxp3.</a> Science (New York, N.Y.). 299, 1057-1061 (2003).</li><li>McHugh, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD4(+)CD25(+)+immunoregulatory+T+cells:+gene+expression+analysis+reveals+a+functional+role+for+the+glucocorticoid-induced+TNF+receptor.">CD4(+)CD25(+) immunoregulatory T cells: gene expression analysis reveals a functional role for the glucocorticoid-induced TNF receptor.</a> Immunity. 16, 311-323 (2002).</li><li>Takahashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunologic+Self-Tolerance+Maintained+by+Cd25+Cd4+Regulatory+T+Cells+Constitutively+Expressing+Cytotoxic+T+Lymphocyte-Associated+Antigen+4.">Immunologic Self-Tolerance Maintained by Cd25+Cd4+Regulatory T Cells Constitutively Expressing Cytotoxic T Lymphocyte-Associated Antigen 4.</a> The Journal of Experimental Medicine. 192, 303-310 (2000).</li><li>Liu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD127+expression+inversely+correlates+with+FoxP3+and+suppressive+function+of+human+CD4++T+reg+cells.">CD127 expression inversely correlates with FoxP3 and suppressive function of human CD4+ T reg cells.</a> The Journal of Experimental Medicine. 203, 1701-1711 (2006).</li><li>Schraven, B., Kalinke, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD28+superagonists:+what+makes+the+difference+in+humans.">CD28 superagonists: what makes the difference in humans.</a> Immunity. 28, 591-595 (2008).</li><li>Reneer, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripherally+induced+human+Regulatory+T+cells+uncouple+Kv1.3+activation+from+TCR-associated+signaling.">Peripherally induced human Regulatory T cells uncouple Kv1.3 activation from TCR-associated signaling.</a> European Journal of Immunology. , (2011).</li></ol>

Mentre il trasferimento Treg detiene un enorme promessa terapeutica nella lotta contro il rigetto del trapianto autoimmunità e altri disturbi del sistema immunitario o infiammatorio-mediata, i metodi per la loro generazione efficiente e stabile di mantenimento non sono ancora state sviluppate. Poiché solo il 1-5% delle cellule T circolanti sono Tregs, la loro espansione e la differenziazione controllata supera questa carenza come un deterrente importante di attuazione del Tregs nella clinica. D&#39;altra parte, come a...

<table border="1"><tr><td> Nome del reattivo </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Comments </td></tr><tr><td> Lymphoprep </td><td> Axis-Shield </td><td> 1114547 </td><td> Conservare a temperatura ambiente </td></tr><tr><td> Refrigerato da banco Centrifuga </td><td> Eppendorf </td><td> 5810R </td><td></td></tr><tr><td> Brillante-Line emocitometro </td><td> Hausser Scientific </td><td> 3110 </td><td></td></tr><tr><td> EasySep CD4 + Kit cellule umane T Enrichment </td><td> Stem Cell Technologies </td><td> 19052 </td><td></td></tr><tr><td> CD4 + di memoria EasySep umani Kit cellule T Enrichment </td><td> Stem Cell Technologies </td><td> 19157 </td><td></td></tr><tr><td> EasySep umani CD4 + naive Kit cellule T Enrichment </td><td> Stem Cell Technologies </td><td> 19155 </td><td></td></tr><tr><td> The Big Easy EasySep Magrete </td><td> Stem Cell Technologies </td><td> 18001 </td><td> Argento </td></tr><tr><td> 5 mL di fondo in polistirolo Tubes </td><td> BD Falcon </td><td> 352008 </td><td></td></tr><tr><td> 15 ml in polipropilene provette da centrifuga; </td><td> VWR </td><td> 89004-368 </td><td></td></tr><tr><td> 14 ml in polipropilene a fondo rotondo Tubes </td><td> BD Falcon </td><td> 352059 </td><td></td></tr><tr><td> 50 ml in polipropilene provette da centrifuga; </td><td> VWR </td><td> 89004-364 </td><td></td></tr><tr><td> Umana anti-CD3 Antibody </td><td> Bio X cella </td><td> BE0001-2 </td><td> Clone: ​​OKT3 </td></tr><tr><td> 24 Beh piastra di coltura cellulare in polistirolo </td><td> BD Falcon </td><td> 353047 </td><td></td></tr><tr><td> 96 Beh fondo sferico Tissue piastra di coltura </td><td> Grenier Bio-One </td><td> 650180 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI 1640 con Glutamax-I e tampone HEPES </td><td> Gibco </td><td> 72400 </td><td></td></tr> &lt;tr&gt; <td> Siero bovino fetale (FBS) </td><td> Gibco </td><td> 16000 </td><td></td></tr><tr><td> β-mercaptoetanolo </td><td> Sigma </td><td> M7522 </td><td></td></tr><tr><td> Ricombinante umano TGF-β1 </td><td> eBioscience </td><td> 14-8348-62 </td><td></td></tr><tr><td> Umano ricombinante IL-2 </td><td> eBioscience </td><td> 14-8029-63 </td><td></td></tr><tr><td> Albumina sierica bovina (BSA) </td><td> MP Biomedicals Inc. </td><td> 810531 </td><td></td></tr><tr><td> 0,5 M EDTA </td><td> Amresco </td><td> E177 </td><td></td></tr><tr><td> Mouse Anti-Human CD25-PE </td><td> Miltenyi Biotec </td><td> 130-091-024 </td><td> Clone: ​​4E3 </td></tr><tr><td> Mouse Anti-Human CD45RA-PE-Cy5 </td><td> eBioscience </td><td> 15-0458-42 </td><td> Clone: ​​HI100 </td></tr><tr><td> Mouse Anti-Human CD127-APC </td><td> Miltenyi Biotec </td><td> 130-094-890 </td><td> Clone: ​​MB15-18C9 </td></tr><tr><td> DNasi II </td><td> MP Biomedicals Inc. </td><td> 190370 </td><td></td></tr><tr><td> MoFlo Citofluorimetro </td><td> Beckman Coulter </td><td></td><td></td></tr><tr><td> FlowJo Software </td><td> Albero Star, Inc. </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Cella Quest Software Pro </td><td> BD Biosciences </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Newborn di siero di vitello </td><td> Gibco </td><td> 16010 </td><td></td></tr><tr><td> L-glutammina </td><td> Gibco </td><td> 25030 </td><td></td></tr><tr><td> AIM-V </td><td> Gibco </td><td> 0870112 </td><td></td></tr><tr><td> CellTrace CFSE Kit proliferazione cellulare </td><td> Invitrogen </td><td> C34554 </td><td></td></tr><tr><td> Treg Beads Inspector soppressione </td><td> Miltenyi Biotec </td><td> 130-092-909 </td><td></td></tr><tr><td> Penicillina-Streptomicina </td><td> Gibco </td><td> 15140 </td><td></td></tr><tr><td> 40 micron Nylon ceppo cellulareer </td><td> BD Falcon </td><td> 352340 </td><td></td></tr></table>

generation of induced regulatory t cells from primary human na&iuml;ve and memory t cells

Lo sviluppo e la manutenzione di immunosoppressori CD4 + cellule T regolatorie (Tregs) contribuiscono alla tolleranza periferica necessario per rimanere in omeostasi immunologica con la grande quantità di antigeni self e commensali nel e sul corpo umano. Perturbazioni in bilico tra Tregs e infiammatorie cellule T convenzionali può portare a immunopatologia o il cancro. Sebbene iniezione terapeutico di Tregs ha dimostrato di essere efficace in modelli murini di colite 1, diabete di tipo I 2, artrite reumatoide e malattia dell&#39;innesto verso l&#39;ospite, 4 varie differenze fondamentali umano contro topo Treg biologia 5 ha finora precluso l&#39;uso clinico. La mancanza di numero sufficiente, la purezza, la stabilità e la specificità di homing terapeutica Tregs necessaria una piattaforma dinamica di sviluppo umano su cui Treg per ottimizzare le condizioni per la loro espansione ex vivo 6. Qui D TuttoEscribe un metodo per la differenziazione di indotto Tregs (iTregs) da un singolo donatore di sangue periferico umano che può essere suddiviso in quattro fasi: isolamento di cellule mononucleate del sangue periferico, selezione magnetico di cellule T CD4 +, in coltura cellulare in vitro e fluorescenza attivato di separazione delle cellule (FACS) di sottoinsiemi di cellule T. Poiché la firma fattore di trascrizione Treg P3 forkhead scatola (FoxP3) è una attivazione indotta da fattore di trascrizione nell&#39;uomo 7 e nessun altro marcatore unico esiste, un pannello combinatoria di marcatori devono essere utilizzati per identificare cellule T con attività soppressiva. Dopo sei giorni di coltura, le cellule del nostro sistema può essere delimitato in ingenui cellule T, cellule T di memoria o iTregs in base alla loro relativa espressione di CD25 e CD45RA. Mentre le cellule T di memoria e ingenuo hanno diversi requisiti di polarizzazione segnalati e plasticities 8, pre-selezione della popolazione iniziale delle cellule T in CD45RA + e + CD45RO sottoinsiemi possono be utilizzato per esaminare queste discrepanze. Coerentemente con gli altri, il nostro CD25 Hi CD45RA - iTregs esprimono alti livelli di FoxP3 9, GITR e CTLA-4 11 e bassi livelli di CD127 12. Dopo FACS di ciascuna popolazione, le cellule risultanti possono essere utilizzati in un saggio soppressore che valuta la relativa capacità di ritardare la proliferazione di carbossifluoresceina succinimmidil estere (CFSE)-marcato cellule T autologhe.

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Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Na&#239;ve and Memory T Cells

Noi descriviamo un metodo per generare le cellule T normativo, di memoria e naif da un singolo donatore di sangue umano. Polarizzato Tregs può essere quindi confrontato con altri sottoinsiemi in una varietà di applicazioni genetiche e funzionali con omogeneità genetica, comprendente un saggio di soppressione anche dettagliati qui.

Generazione di cellule T regolatrici indotte da cellule primarie umane T naive e memoria

The development and maintenance of immunosuppressive CD4+ regulatory T cells (Tregs) contribute to the peripheral tolerance needed to remain in ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Na&iuml;ve and Memory T Cells

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

Trasduzione retrovirale di recettori delle cellule T nel topo le cellule T

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Directed Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells towards T Lymphocytes

Differenziazione Regia di cellule staminali pluripotenti indotte verso Linfociti T

Adoptive cell transfer (ACT) of antigen-specific CD8+  cytotoxic T lymphocytes (CTLs) is a promising treatment for a variety of  malignancies 1. CTLs can  ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon modifica del sistema di cellule primarie umane T

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

New Tools to Expand Regulatory T Cells from HIV-1-infected Individuals

Nuovi strumenti per espandere cellule T regolatorie di individui HIV-1-infetti

CD4+ Regulatory T cells (Tregs) are potent immune modulators and serve an important function in human immune homeostasis. Depletion of Tregs has led to ...

Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells

Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells

Derivazione di cellule T<em&gt; In Vitro</em&gt; Da cellule staminali embrionali di topo

The OP9/OP9-DL1 co-culture system has become a well-established method for deriving differentiated blood cell types from embryonic and hematopoietic ...

Generation of Human Alloantigen-specific T Cells from Peripheral Blood

Generazione di Human alloantigene-specifiche cellule T da sangue periferico

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide ...

T Cells Capture Bacteria by Transinfection from Dendritic Cells

Cellule T Capture batteri da Transinfection da cellule dendritiche

Recently, we have shown, contrary to what is described, that CD4+ T cells, the paradigm of adaptive immune cells, capture bacteria from infected dendritic ...

Phenotypic and Functional Analysis of Activated Regulatory T Cells Isolated from Chronic Lymphocytic Choriomeningitis Virus-infected Mice

Fenotipica e analisi funzionale di cellule T regolatorie attivati ​​Isolato dal linfocitica cronica coriomeningite topi infettati da virus

Regulatory T (Treg) cells, which express Foxp3 as a transcription factor, are subsets of CD4+ T cells. Treg cells play crucial roles in immune tolerance ...

Development of Stem Cell-derived Antigen-specific Regulatory T Cells Against Autoimmunity

Lo sviluppo di cellule staminali derivate antigene-specifiche cellule T regolatorie contro autoimmunità

Autoimmune diseases arise due to the loss of immunological self-tolerance. Regulatory T cells (Tregs) are important mediators of immunologic ...

In Vitro Differentiation of Human CD4+FOXP3+ Induced Regulatory T Cells (iTregs) from Na&#239;ve CD4+ T Cells Using a TGF-&#946;-containing Protocol

La differenziazione in vitro di cellule CD4 + umana FOXP3 + indotta da T regolatorie (iTregs) da cellule T CD4 Naïve utilizzando un protocollo TGF-β contenenti

Regulatory T cells (Tregs) are an integral part of peripheral tolerance, suppressing immune reactions against self-structures and thus preventing ...