Name: generation of induced regulatory t cells from primary human na&iuml;ve and memory t cells
Uploaded: 2012-04-16T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human NaÃ¯ve and Memory T Cells at JoVE.com

<p class="jove_content"&gt; Författarna vill tacka Jennifer Strange och Greg Bauman för deras hjälp med flödescytometri analys och sortering. Detta arbete stöddes av NIH licensnummer 2P20 RR020171 från NCRR och University of Kentucky start medel till FM, GIE erkänner stöd av presidentens Graduate Fellowship och Kentucky Opportunity Fellowship.</p

1. Isolering av humana perifera mononukleära blodkroppar (PBMC) från buffy coat <ol><li> Skaffa en enhet av buffy coat från sjukhus eller i närheten blod centrum. Vårt blod center ger oss cirka 40-60 ml buffy coat per enhet erhålls från normala blodgivare. </li><li> Häll in blod i en autoklaverad 500 ml glasflaska som innehåller steril PBS för att späda buffy coat. Den slutliga volymen av PBS + lättcellskoncentratet bör vara 250 ml. </li><li> Fylla tio 50 ml koniska rör med vardera 20 ml Lymphoprep-lösn...

<ol>
	<li>Powrie, F., Correa-Oliveira, R., Mauze, S., Coffman, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+interactions+between+CD45RBhigh+and+CD45RBlow+CD4++T+cells+are+important+for+the+balance+between+protective+and+pathogenic+cell-mediated+immunity.">Regulatory interactions between CD45RBhigh and CD45RBlow CD4+ T cells are important for the balance between protective and pathogenic cell-mediated immunity.</a> The Journal of Experimental Medicine. 179, 589-600 (1994).</li><li>Tarbell, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cell-expanded,+islet-specific+CD4++CD25++CD62L++regulatory+T+cells+restore+normoglycemia+in+diabetic+NOD+mice.">Dendritic cell-expanded, islet-specific CD4+ CD25+ CD62L+ regulatory T cells restore normoglycemia in diabetic NOD mice.</a> The Journal of Experimental Medicine. 204, 191-201 (2007).</li><li>Morgan, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+treatment+of+collagen-induced+arthritis+by+adoptive+transfer+of+CD25++regulatory+T+cells.">Effective treatment of collagen-induced arthritis by adoptive transfer of CD25+ regulatory T cells.</a> Arthritis and Rheumatism. 52, 2212-2221 (2005).</li><li>Taylor, P. A., Lees, C. J., Blazar, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+infusion+of+ex+vivo+activated+and+expanded+CD4(+)CD25(+)+immune+regulatory+cells+inhibits+graft-versus-host+disease+lethality.">The infusion of ex vivo activated and expanded CD4(+)CD25(+) immune regulatory cells inhibits graft-versus-host disease lethality.</a> Blood. 99, 3493-3493 (2002).</li><li>Ziegler, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FOXP3:+of+mice+and+men.">FOXP3: of mice and men.</a> Annual Review of Immunology. 24, 209-226 (2006).</li><li>Riley, J. L., June, C. H., Blazar, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+T+regulatory+cell+therapy:+take+a+billion+or+so+and+call+me+in+the+morning.">Human T regulatory cell therapy: take a billion or so and call me in the morning.</a> Immunity. 30, 656-6565 (2009).</li><li>Morgan, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+FOXP3+mRNA+is+not+confined+to+CD4+CD25++T+regulatory+cells+in+humans.">Expression of FOXP3 mRNA is not confined to CD4+CD25+ T regulatory cells in humans.</a> Human Immunology. 66, 13-20 (2005).</li><li>Wang, J., Huizinga, T. W. J., Toew, R. E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+Novo+Generation+and+Enhanced+Suppression+of+Human+CD4+CD25++Regulatory+T+Cells+by+Retinoic+Acid.">De Novo Generation and Enhanced Suppression of Human CD4+CD25+ Regulatory T Cells by Retinoic Acid.</a> Journal of Immunology. 183, 4119-4126 (2009).</li><li>Hori, S., Nomura, T., Sakaguchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+regulatory+T+cell+development+by+the+transcription+factor+Foxp3.">Control of regulatory T cell development by the transcription factor Foxp3.</a> Science (New York, N.Y.). 299, 1057-1061 (2003).</li><li>McHugh, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD4(+)CD25(+)+immunoregulatory+T+cells:+gene+expression+analysis+reveals+a+functional+role+for+the+glucocorticoid-induced+TNF+receptor.">CD4(+)CD25(+) immunoregulatory T cells: gene expression analysis reveals a functional role for the glucocorticoid-induced TNF receptor.</a> Immunity. 16, 311-323 (2002).</li><li>Takahashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunologic+Self-Tolerance+Maintained+by+Cd25+Cd4+Regulatory+T+Cells+Constitutively+Expressing+Cytotoxic+T+Lymphocyte-Associated+Antigen+4.">Immunologic Self-Tolerance Maintained by Cd25+Cd4+Regulatory T Cells Constitutively Expressing Cytotoxic T Lymphocyte-Associated Antigen 4.</a> The Journal of Experimental Medicine. 192, 303-310 (2000).</li><li>Liu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD127+expression+inversely+correlates+with+FoxP3+and+suppressive+function+of+human+CD4++T+reg+cells.">CD127 expression inversely correlates with FoxP3 and suppressive function of human CD4+ T reg cells.</a> The Journal of Experimental Medicine. 203, 1701-1711 (2006).</li><li>Schraven, B., Kalinke, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD28+superagonists:+what+makes+the+difference+in+humans.">CD28 superagonists: what makes the difference in humans.</a> Immunity. 28, 591-595 (2008).</li><li>Reneer, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripherally+induced+human+Regulatory+T+cells+uncouple+Kv1.3+activation+from+TCR-associated+signaling.">Peripherally induced human Regulatory T cells uncouple Kv1.3 activation from TCR-associated signaling.</a> European Journal of Immunology. , (2011).</li></ol>

Medan treg överföring har enorm terapeutisk löfte bekämpa i avstötning autoimmunitet transplantat och andra immun-eller inflammatoriskt förmedlade störningar, metoder för deras effektiva genereringen och stabilt upprätthållande har ännu inte utvecklats. Eftersom endast 1-5% av cirkulerande humana T-celler är tregs, övervinner deras kontrollerad expansion och differentiering denna brist som en viktig avskräckande genomförandet av tregs i kliniken. Å andra sidan, som vi lärt oss av TGN1412 rättegången <...

<table border="1"><tr><td> Namnet på reagens </td><td> Företaget </td><td> Katalognr </td><td> Kommentarer </td></tr><tr><td> Lymphoprep </td><td> Axis-Shield </td><td> 1114547 </td><td> Förvara i rumstemperatur </td></tr><tr><td> Kyld bänkbaserade Centrifug </td><td> Eppendorf </td><td> 5810R </td><td></td></tr><tr><td> Bright-Line hemocytometer </td><td> Hauser Scientific </td><td> 3110 </td><td></td></tr><tr><td> EasySep humana CD4 + T cell Anrikning Kit </td><td> Härrör Cell Technologies </td><td> 19.052 </td><td></td></tr><tr><td> EasySep mänskliga minnet CD4 + T cell Enrichment Kit </td><td> Härrör Cell Technologies </td><td> 19.157 </td><td></td></tr><tr><td> EasySep humana naiva CD4 + T-cell Anrikning Kit </td><td> Härrör Cell Technologies </td><td> 19.155 </td><td></td></tr><tr><td> The Big Easy EasySep Magnet </td><td> Härrör Cell Technologies </td><td> 18.001 </td><td> Silver </td></tr><tr><td> 5 ml rundbottnad polystyrenrör </td><td> BD Falcon </td><td> 352.008 </td><td></td></tr><tr><td> 15 ml Polypropylen Centrifugrör </td><td> VWR </td><td> 89004-368 </td><td></td></tr><tr><td> 14 ml Polypropylen rundbottnad rör </td><td> BD Falcon </td><td> 352.059 </td><td></td></tr><tr><td> 50 ml Polypropylen Centrifugrör </td><td> VWR </td><td> 89004-364 </td><td></td></tr><tr><td> Human anti-CD3-antikropp </td><td> Bio X Cell </td><td> BE0001-2 </td><td> Klon: OKT3 </td></tr><tr><td> 24 Väl Cell Polystyren Culture Plate </td><td> BD Falcon </td><td> 353.047 </td><td></td></tr><tr><td> 96 brunnars rundbottnad vävnadsodlingsplatta </td><td> Grenier Bio-One </td><td> 650.180 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI 1640 med Glutamax-I och HEPES-buffert </td><td> Gibco </td><td> 72.400 </td><td></td></tr> &lt;tr&gt; <td> Fetalt bovint serum (FBS) </td><td> Gibco </td><td> 16 tusen </td><td></td></tr><tr><td> β-merkaptoetanol </td><td> Sigma </td><td> M7522 </td><td></td></tr><tr><td> Rekombinant human TGF-β1 </td><td> eBioscience </td><td> 14-8348-62 </td><td></td></tr><tr><td> Rekombinant humant IL-2 </td><td> eBioscience </td><td> 14-8029-63 </td><td></td></tr><tr><td> Bovint serumalbumin (BSA) </td><td> MP Biomedicals Inc. </td><td> 810.531 </td><td></td></tr><tr><td> 0,5 M EDTA </td><td> Amresco </td><td> E177 </td><td></td></tr><tr><td> Mouse Anti-Human CD25-PE </td><td> Miltenyi Biotec </td><td> 130-091-024 </td><td> Klon: 4E3 </td></tr><tr><td> Mouse Anti-Human CD45RA-PE-Cy5 </td><td> eBioscience </td><td> 15-0458-42 </td><td> Klon: HI100 </td></tr><tr><td> Mus anti-human CD127-APC </td><td> Miltenyi Biotec </td><td> 130-094-890 </td><td> Klon: MB15-18C9 </td></tr><tr><td> DNas II </td><td> MP Biomedicals Inc. </td><td> 190.370 </td><td></td></tr><tr><td> MoFlo flödescytometer </td><td> Beckman Coulter </td><td></td><td></td></tr><tr><td> FlowJo programvara </td><td> Tree Star, Inc. </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Cell Quest Pro Software </td><td> BD Biosciences </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Serum från nyfödd kalv </td><td> Gibco </td><td> 16.010 </td><td></td></tr><tr><td> L-glutamin </td><td> Gibco </td><td> 25.030 </td><td></td></tr><tr><td> AIM-V- </td><td> Gibco </td><td> 0870112 </td><td></td></tr><tr><td> CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit </td><td> Invitrogen </td><td> C34554 </td><td></td></tr><tr><td> Treg Pärlor Suppression inspektör </td><td> Miltenyi Biotec </td><td> 130-092-909 </td><td></td></tr><tr><td> Penicillin-streptomycin </td><td> Gibco </td><td> 15.140 </td><td></td></tr><tr><td> 40 | iM nylon cellstamER </td><td> BD Falcon </td><td> 352.340 </td><td></td></tr></table>

generation of induced regulatory t cells from primary human na&iuml;ve and memory t cells

Utveckling och underhåll av immunsuppressiva CD4 + regulatoriska T-celler (tregs) bidrar till perifer tolerans som behövs för att stanna kvar i immunologisk homeostas med den stora mängd själv och kommensala antigener i och på människokroppen. Störningar i balansen mellan tregs och inflammatoriska konventionella T-celler kan resultera i immunopatologi eller cancer. Även terapeutisk injektion av tregs har visat sig vara effektiva i musmodeller av kolit 1, typ I-diabetes 2, reumatoid artrit och graft versus host disease, 4 flera grundläggande skillnader i mänskligt kontra mus treg biologin 5 har hittills uteslutet klinisk användning. Bristen på tillräckligt många, renhet, stabilitet och homing specificitet av terapeutisk tregs krävde en dynamisk plattform av mänsklig treg utveckling för att optimera förutsättningarna för deras ex vivo expansion 6. Här vi Describe en metod för differentiering av inducerad tregs (iTregs) från en enda human perifert blod donator som kan brytas ned i fyra steg: isolering av perifera mononukleära celler, magnetisk selektion av CD4 + T-celler, in vitro cellkultur och fluorescens-aktiverad cellsortering (FACS) av T-cell-underuppsättningar. Sedan treg signaturen transkriptionsfaktor forkhead låda P3 (FOXP3) är en aktiveringsinducerat transkriptionsfaktor i människor 7 och ingen annan unik markör föreligger en kombinatorisk panel av markörer måste användas för att identifiera T-celler med suppressoraktivitet. Efter sex dagar i odling, kan celler i vårt system avgränsas i naiva T-celler, minnes-T-celler eller iTregs baserat på deras relativa expressionen av CD25 och CD45RA. Som minne och naiva T-celler har olika rapporterade polarisering krav och plasticities 8, pre-sortering av det ursprungliga T-cell befolkningen i CD45RA + och CD45RO + undergrupper kan bE som används för att undersöka dessa skillnader. Överensstämma med andra, vår CD25 Hi CD45RA - iTregs uttrycker höga nivåer av FOXP3 9, GITR och CTLA-4 11 och låga halter av CD127 12. Efter FACS för varje population, kan resulterande cellerna användas i en suppressor-analys som bedömer den relativa förmågan att fördröja spridningen av karboxifluorescein succinimidylester (CFSE)-märkta autologa T-celler.

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human NaÃ¯ve and Memory T Cells at JoVE.com

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Na&#239;ve and Memory T Cells

Vi beskriver ett förfarande för att generera reglerande, minnes-och naiva T-celler från en enda human blodgivare. Polariserad tregs kan sedan jämföras med andra undergrupper i olika genetiska och funktionella tillämpningar med genetiska homogenitet, inklusive en dämpning analys också beskrivet här.

Generering av Inducerade regulatoriska T-celler från primära humana naiva och minne T-celler

The development and maintenance of immunosuppressive CD4+ regulatory T cells (Tregs) contribute to the peripheral tolerance needed to remain in ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Na&iuml;ve and Memory T Cells

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

Retroviral Transduction av T-cell receptorer i Mus T-celler

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Directed Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells towards T Lymphocytes

Riktad Differentiering av inducerade pluripotenta stamceller mot T-lymfocyter

Adoptive cell transfer (ACT) of antigen-specific CD8+  cytotoxic T lymphocytes (CTLs) is a promising treatment for a variety of  malignancies 1. CTLs can  ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac transposon System Ändring av primära humana T-celler

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

New Tools to Expand Regulatory T Cells from HIV-1-infected Individuals

Nya verktyg för att expandera reglerande T-celler från HIV-1-infekterade individer

CD4+ Regulatory T cells (Tregs) are potent immune modulators and serve an important function in human immune homeostasis. Depletion of Tregs has led to ...

Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells

Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells

Härledning av T-celler<em&gt; In Vitro</em&gt; Från Mouse embryonala stamceller

The OP9/OP9-DL1 co-culture system has become a well-established method for deriving differentiated blood cell types from embryonic and hematopoietic ...

Generation of Human Alloantigen-specific T Cells from Peripheral Blood

Generering av Human Alloantigen-specifika T-celler från perifert blod

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide ...

T Cells Capture Bacteria by Transinfection from Dendritic Cells

T-celler Fånga Bakterier från Transinfection från dendritiska celler

Recently, we have shown, contrary to what is described, that CD4+ T cells, the paradigm of adaptive immune cells, capture bacteria from infected dendritic ...

Phenotypic and Functional Analysis of Activated Regulatory T Cells Isolated from Chronic Lymphocytic Choriomeningitis Virus-infected Mice

Fenotypisk och funktionell analys av aktiverade regulatoriska T-celler isolerade från kronisk lymfatisk koriomeningitvirus-infekterade möss

Regulatory T (Treg) cells, which express Foxp3 as a transcription factor, are subsets of CD4+ T cells. Treg cells play crucial roles in immune tolerance ...

Development of Stem Cell-derived Antigen-specific Regulatory T Cells Against Autoimmunity

Utveckling av stamcellshärledda antigen-specifika regulatoriska T-celler mot autoimmunitet

Autoimmune diseases arise due to the loss of immunological self-tolerance. Regulatory T cells (Tregs) are important mediators of immunologic ...

In Vitro Differentiation of Human CD4+FOXP3+ Induced Regulatory T Cells (iTregs) from Na&#239;ve CD4+ T Cells Using a TGF-&#946;-containing Protocol

In vitro-differentiering av humana CD4 + Foxp3 + Induced regulatoriska T-celler (iTregs) från naiva CD4 + -T-celler med ett TGF-β-innehållande protokoll

Regulatory T cells (Tregs) are an integral part of peripheral tolerance, suppressing immune reactions against self-structures and thus preventing ...