Name: lateral diffusion and exocytosis of membrane proteins in cultured neurons assessed using fluorescence recovery and fluorescence-loss photobleaching
Uploaded: 2012-02-29T13:00:00
Duration: 11 min 58 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Lateral Diffusion and Exocytosis of Membrane Proteins in Cultured Neurons Assessed using Fluorescence Recovery and Fluorescence-loss Photobleaching at JoVE.co

ونحن ممتنون لويلكوم ترست والمنسق للدعم المالي. IMGG هو زميل EMBO. KLH وهو طالب دكتوراه BBSRC التي تمولها. نشكر فيليب روبين وTidball باتريك لدعم الثقافة الفنية والخلية، والدكتور أندرو دوهرتي للصيانة والمساعدة مع المجاهر.

<ol>
	<li>Sankaranarayanan, S., De Angelis, D., Rothman, J. E., Ryan, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+pHluorins+for+optical+measurements+of+presynaptic+activity.">The use of pHluorins for optical measurements of presynaptic activity.</a> Biophys. J. 79, 2199-2208 (2000).</li><li>Ashby, M. C., Ibaraki, K., Henley, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=It's+green+outside:+tracking+cell+surface+proteins+with+pH-sensitive+GFP.">It's green outside: tracking cell surface proteins with pH-sensitive GFP.</a> Trends Neurosci. 27, 257-261 (2004).</li><li>Swaminathan, R., Hoang, C. P., Verkman, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photobleaching+recovery+and+anisotropy+decay+of+green+fluorescent+protein+GFP-S65T+in+solution+and+cells:+cytoplasmic+viscosity+probed+by+green+fluorescent+protein+translational+and+rotational+diffusion.">Photobleaching recovery and anisotropy decay of green fluorescent protein GFP-S65T in solution and cells: cytoplasmic viscosity probed by green fluorescent protein translational and rotational diffusion.</a> Biophys. J. 72, 1900-1907 (1997).</li><li>Patterson, G. H., Knobel, S. M., Sharif, W. D., Kain, S. R., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+the+green+fluorescent+protein+and+its+mutants+in+quantitative+fluorescence+microscopy.">Use of the green fluorescent protein and its mutants in quantitative fluorescence microscopy.</a> Biophys. J. 73, 2782-2790 (1997).</li><li>Wiedenmann, J., Oswald, F., Nienhaus, G. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+proteins+for+live+cell+imaging:+opportunities,+limitations,+and+challenges.">Fluorescent proteins for live cell imaging: opportunities, limitations, and challenges.</a> IUBMB Life. 61, 1029-1042 (2009).</li><li>Ashby, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Removal+of+AMPA+receptors+(AMPARs)+from+synapses+is+preceded+by+transient+endocytosis+of+extrasynaptic+AMPARs.">Removal of AMPA receptors (AMPARs) from synapses is preceded by transient endocytosis of extrasynaptic AMPARs.</a> J. Neurosci. 24, 5172-5176 (2004).</li><li>Bouschet, T., Martin, S., Henley, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor-activity-modifying+proteins+are+required+for+forward+trafficking+of+the+calcium-sensing+receptor+to+the+plasma+membrane.">Receptor-activity-modifying proteins are required for forward trafficking of the calcium-sensing receptor to the plasma membrane.</a> J. Cell. Sci. 118, 4709-4720 (2005).</li><li>Ashby, M. C., Maier, S. R., Nishimune, A., Henley, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lateral+diffusion+drives+constitutive+exchange+of+AMPA+receptors+at+dendritic+spines+and+is+regulated+by+spine+morphology.">Lateral diffusion drives constitutive exchange of AMPA receptors at dendritic spines and is regulated by spine morphology.</a> J. Neurosci. 26, 7046-7055 (2006).</li><li>Martin, S., Bouschet, T., Jenkins, E. L., Nishimune, A., Henley, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bidirectional+regulation+of+kainate+receptor+surface+expression+in+hippocampal+neurons.">Bidirectional regulation of kainate receptor surface expression in hippocampal neurons.</a> J. Biol. Chem. 283, 36435-36440 (2008).</li><li>Jaskolski, F., Mayo-Martin, B., Jane, D., Henley, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamin-dependent+membrane+drift+recruits+AMPA+receptors+to+dendritic+spines.">Dynamin-dependent membrane drift recruits AMPA receptors to dendritic spines.</a> J. Biol. Chem. 284, 12491-12503 (2009).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

وصفنا ووضع استراتيجية مبتكرة لتصور مكونات غشاء البلازما الاتجار البروتين. النهج التوافقي من photobleaching التقنيات مع بروتين سبتمبر الموسومة تمكن بشكل انتقائي على أن يقسم الأحداث البلازما الإدراج غشاء. بواسطة photobleaching باستمرار بروتينات غشاء في المناطق المحيطة أثناء الانتعاش، وهي طريقة &quot;FRAP-FLIP &#39;يقيم مساهمة الاتجار حويصلي إلى انتعاش مضان. هذا النهج الجديد يسمح للتسجيل المباشر لإدخال غشاء من البروتين، وتمكين كل من عدد من الغرف الفرعية حيث لوحظ انتعاش واتساع الانتعاش (ΔF) في حالة مستقرة يحدد لاحقا. كذلك، مقارنة مع FRAP ودون FLIP يسمح نسبة الانتعاش يعزى إلى انتشار الأفقي يتم حسابها. وعلاوة على ذلك، في التجربة ذاتها، ويمكن مناطق غير photobleached التغصنات المتاخمة للمناطق المحيطة photobleached تكونتقييم نوعيا خلال الانتعاش، وفقدان مضان لوحظ في هذه المناطق سوف يكون راجعا إلى نشر الوحشي للمستقبلات photobleached في هذه القطاعات غير photobleached من التغصنات. ويمكن استخدام هذا البروتوكول انتقائي photobleaching للتحقيق في مجموعة متنوعة من العمليات الخلوية مثل الاتجار تميز excocytosis في غشاء البلازما في المناطق الفرعية محددة (على سبيل المثال التشعبات أو العمود الفقري،) FRAP أو تقييم مساهمة الجانبي نشر الإدراج مقابل عن طريق إجراء FRAP متوازية و&#39; -FLIP &#39;البروتوكولات على طول التشعبات المجاورة (الشكل 3). بوضوح، في حين تم تقديم مبادئ توجيهية محددة، وسوف تحتاج إلى كل مختبر تحسين المعلمات التصوير وفقا لنماذج محددة والمعدات. الأهم من ذلك، كل المستقبلات السطحية في العائد على الاستثمار تحتاج إلى أن تكون photobleached، مستقلة عن الطائرة Z-محور التركيز، ولكن دون وقوع خسائر كبيرة الضوئية أو photobleaching غير محددة. لناوينبغي توخي الحذر المتطلبات البيئية عند محاولة هذا البروتوكول في وسوما الخلية، حيث أن نسبة عالية من مقصورات درجة الحموضة منخفضة نسبيا داخل الخلايا عادة النتائج في مضان خلفية عالية في هذه المناطق. وعلاوة على ذلك، في حين أننا أظهرنا كيف يمكن تطبيق هذه التقنية في تختلف طرق، قبل البدء انتقائية التجارب photobleaching على جديد سبتمبر الموسومة بناء، فإننا ننصح أن تتم أولا إلى توصيف الأولي للمستقبلات المفتاحية، كما وصفها آشبي وآخرون 2. وعموما، هذا الأسلوب هو التكيف مع قوة وتنوعا من بروتوكول FRAP القياسية، تمكن أحداث الإدراج في غشاء البلازما التي يتم تقييمها في الوقت الحقيقي القريب.

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td<strong&gt; اسم كاشف</strong</td&gt;<td<strong&gt; شركة</strong</td&gt;<td<strong&gt; فهرس العدد</strong</td&gt;<td<strong&gt; تعليقات (اختياري)</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; coverslips زجاج 24MM</td&gt;<td&gt; VWR الدولية</td&gt;<td&gt; 631-0161</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; بولي-L-يسين</td&gt;<td&gt; سيجما</td&gt;<td&gt; P2636</td&gt;<td&gt; 1mg/ml في عازلة بورات إلى coverslips معطف</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; متوسطة Neurobasal</td&gt;<td&gt; إينفيتروجن</td&gt;<td&gt; 21103</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; B27</td&gt;<td&gt; إينفيتروجن</td&gt;<td&gt; 17504-044</td&gt;<td&gt; 2٪ في تصفيح العصبية وتغذية المتوسطة</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; البنسلين الستربتوميسين</td&gt;<td&gt; سيجما</td&gt;<td&gt; P0781</td&gt;<td&gt; متوسط ​​1٪ في تصفيح العصبية وتغذية</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; L-الجلوتامين</td&gt;<td&gt; إينفيتروجن</td&gt;<td&gt; 25030</td&gt;<td&gt; 2MM / 0.8mM في طلاء / تغذية المتوسطة</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; حصان المصل</td&gt;<td&gt; Biosera</td&gt;<td&gt; DH-291H</td&gt;<td&gt; 10٪ في وسائل الاعلام طلاء الخلايا العصبية فقط</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; pSIN ناقلات الاستنساخ ReP5</td&gt;<td&gt; إينفيتروجن</td&gt;<td&gt; K75001</td&gt;<td&gt; للحصول على إنتاج فيروس سندبيس</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; LSM510 نظام META مبائر</td&gt;<td&gt; زييس</td&gt;<td&gt;</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; صورة J برامج</td&gt;<td&gt; المعاهد الوطنية للصحة</td&gt;<td&gt;</td&gt;<td&gt; برامج الوصول المفتوحة. جميع الإضافات الموصوفة هنا متاحة في<a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/"&gt; http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/</a</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table

lateral diffusion and exocytosis of membrane proteins in cultured neurons assessed using fluorescence recovery and fluorescence-loss photobleaching

<p class="jove_content"بروتينات الغشاء&gt; مثل المستقبلات والقنوات الأيونية يخضع الاتجار نشط في الخلايا العصبية، والتي هي مستقطبة للغاية ومعقدة شكليا. هذا الاتجار الموجهة له أهمية أساسية لتقديم وصيانة أو إزالة البروتينات متشابك.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; سوبر مسير الشمس pHluorin (سبتمبر) هو مشتق درجة الحموضة حساسة من eGFP التي استخدمت على نطاق واسع لتصوير الخلايا الحية للبروتينات غشاء البلازما<sup&gt; 1-2</sup&gt;. في انخفاض الرقم الهيدروجيني، بروتوناتيون من سبتمبر يقلل امتصاص الفوتون ويزيل الانبعاثات مضان. كما أحداث الاتجار معظم الخلايا يحدث في مقصورات مع انخفاض الرقم الهيدروجيني، حيث طغت سبتمبر مضان، في إشارة مضان من سبتمبر الموسومة البروتينات هي في الغالب من غشاء البلازما التي تعرض سبتمبر في بيئة درجة الحموضة محايد خارج الخلية. عندما تضاء في سبتمبر الكثافة العالية، مثل كل صبغة الفلورسنت، هو photodamaged لا رجعة فيه (photobleached)<sup&gt; 3-5</sup&gt;. الأهم من ذلك، أعرب عن سطح فقط بسبب انخفاض الرقم الهيدروجيني يروي امتصاص الفوتون، يمكن photobleached سبتمبر في حين سبتمبر الخلايا لا تتأثر الإضاءة عالية الكثافة<sup&gt; 6-10</sup&gt;.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; FRAP (استرداد مضان بعد photobleaching) من سبتمبر الموسومة البروتينات هي تقنية مريحة وقوية لتقييم ديناميات البروتين في غشاء البلازما. عندما يتم photobleached البروتينات الموسومة fluorescently في المنطقة ذات الاهتمام (ROI) الانتعاش في مضان يحدث نتيجة لحركة غير مقصور البروتينات سبتمبر الموسومة في المنطقة المبيض. وهذا يمكن أن يحدث عن طريق نشر الجانبية و / أو من الإيماس غير photobleached مستقبلات الموردة إما عن طريق<em&gt; من جديد</em&gt; تخليق أو إعادة التدوير (انظر الشكل 1). يمكن تحديد جزء من بروتين غير متحركة ومتنقلة، ويمكن استجوابه في التنقل والحركية للجزء قابل للانتشار في ظل ظروف القاعدية وحفزت مثل تطبيق ناهض أو محفزات تنشيط الخلايا العصبية مثل NMDA أو تطبيق بوكل<sup&gt; 8،10</sup&gt;.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; نحن وصف تقنيات photobleaching تهدف إلى تصور انتقائي استعادة مضان تعزى إلى الإيماس. لفترة وجيزة، وعائد استثمار photobleached مرة واحدة كما هو الحال مع بروتوكولات FRAP قياسي، ثم، بعد انتعاش قصير، عن طريق تكرار تبييض المناطق المحيطة. وقد استخدم هذا البروتوكول &quot;FRAP-FLIP &#39;، التي وضعت في المختبر، لتوصيف أمبا الاتجار مستقبلات في العمود الفقري شجيري<sup&gt; 10</sup&gt;، وقابلة للتطبيق على مجموعة واسعة من الدراسات لتقييم الاتجار الاتجار داخل والإيماس.</p

Watch this Scientific Journal Video about Lateral Diffusion and Exocytosis of Membrane Proteins in Cultured Neurons Assessed using Fluorescence Recovery and Fluorescence-loss Photobleaching at JoVE.co

Lateral Diffusion and Exocytosis of Membrane Proteins in Cultured Neurons Assessed using Fluorescence Recovery and Fluorescence-loss Photobleaching

هذا التقرير وصفا للاستخدام التصوير الخلية الحية وتقنيات photobleach لتحديد التعبير السطح، ومسارات النقل وحركية الاتجار خارجيا أعرب GFP الموسومة درجة الحموضة حساسة، والبروتينات في الغشاء البلازمي للخلايا العصبية.

المقررة الإنتشار الأفقي والإيماس من غشاء بروتينات في الخلايا العصبية مثقف باستخدام الاسترداد الإسفار وPhotobleaching الإسفار الخسارة

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

Fluorescence Recovery After Photobleaching FRAP of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

مضان الانتعاش بعد Photobleaching (FRAP) من البروتينات المرتبطة دلاليا الإسفار في العمود الفقري شجيري الخلايا العصبية الحصين مثقف

FRAP has been used to quantify the mobility of GFP-tagged proteins. Using a strong excitation laser, the fluorescence of a GFP-tagged protein is bleached ...

Determination of Mitochondrial Membrane Potential and Reactive Oxygen Species in Live Rat Cortical Neurons

تحديد أنواع غشاء الميتوكوندريا المحتملة والأوكسجين التفاعلي في الخلايا العصبية الفئران الحية القشرية

Mitochondrial membrane potential (&Delta;&Psi;m) is critical for maintaining the physiological function of the respiratory chain to generate ATP.  A ...

Analysis of Dendritic Spine Morphology in Cultured CNS Neurons

تحليل الصرف العمود الفقري شجيري الخلايا العصبية في الجهاز العصبي المركزي لؤلؤ

Dendritic spines are the sites of the majority of excitatory connections within the brain, and form the post-synaptic 
compartment of synapses. These ...

Quantitative Analysis of Synaptic Vesicle Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Granule Neurons using FM Dyes

تحليل كمي متشابك الحويصلة التجديد حمام سباحة في الخلايا العصبية مثقف الحبيبية للدماغ باستخدام الأصباغ FM

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis.  Retrieved SVs are then refilled with ...

Inducing Dendritic Growth in Cultured Sympathetic Neurons

حفز النمو في الخلايا العصبية شجيري متعاطف مثقف

The shape of the dendritic arbor determines the total synaptic input a neuron can receive 1-3, and influences the types and distribution of these inputs ...

Imaging pHluorin-tagged Receptor Insertion to the Plasma Membrane in Primary Cultured Mouse Neurons

التصوير pHluorin الموسومة الإدراج مستقبلات غشاء البلازما إلى الخلايا العصبية في الابتدائية الماوس مثقف

A better understanding of the mechanisms governing receptor trafficking between the plasma membrane (PM) and intracellular compartments requires an ...

Differential Labeling of Cell-surface and Internalized Proteins after Antibody Feeding of Live Cultured Neurons

وصفها الفرق من سطح الخلية والمنضوية البروتينات الأجسام المضادة بعد تغذية الخلايا العصبية مثقف لايف

In order to demonstrate the cell-surface localization of a putative transmembrane receptor in cultured neurons, we labeled the protein on the surface of ...

Preparation of Synaptic Plasma Membrane and Postsynaptic Density Proteins Using a Discontinuous Sucrose Gradient

إعداد متشابك غشاء البلازما والبروتينات الكثافة بعد المشبكي باستخدام التدرج السكروز متقطع

Neuronal subcellular fractionation techniques allow the quantification of proteins that are trafficked to and from the synapse. As originally described in ...

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

مضان وتلألؤ بيولوجي التصوير من التحت خلوية كا<sup&gt; 2+</sup&gt; في المسنين الحصين الخلايا العصبية

Susceptibility to neuron cell death associated to neurodegeneration and ischemia are exceedingly increased in the aged brain but mechanisms responsible ...

Quantification of Endosome and Lysosome Motilities in Cultured Neurons Using Fluorescent Probes

كمي من إندوسوم و ليسوسوم التحركات في الخلايا العصبية المستزرعة باستخدام تحقيقات الفلورسنت

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, ...