Name: infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens
Uploaded: 2012-03-15T12:00:00
Duration: 11 min 18 s
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लेखकों के लिए चाओ कुई का शुक्रिया अदा करना, चित्रा 4, Ulrike Nehrdich और डेवी डे विट में मछली की देखभाल के लिए छवियों, और उपयोगी विचार विमर्श के लिए अन्य प्रयोगशाला के सदस्यों के लिए तल डे Kort, एस्तेर नवना की और राल्फ कार्वाल्हो. इस काम नीदरलैंड्स आर्थिक मामलों के मंत्रालय के स्मार्ट मिक्स कार्यक्रम और शिक्षा, संस्कृति और विज्ञान, यूरोपीय आयोग 7 ढांचा परियोजना ZF स्वास्थ्य (स्वास्थ्य-F4-2010-२,४२,०४८) के, यूरोपीय मैरी क्यूरी के मंत्रालय द्वारा समर्थित है प्रारंभिक प्रशिक्षण नेटवर्क (PITN - GA-2011-+२८९२०९) FishForPharma और ऑस्ट्रेलियाई NHMRC (637,394). ऑस्ट्रेलियाई पुनर्योजी चिकित्सा संस्थान विक्टोरिया और ऑस्ट्रेलियाई सरकार की राज्य सरकार से अनुदान द्वारा समर्थित है.

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	<li>Meijer, A. H., Spaink, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host-pathogen+interactions+made+transparent+with+the+zebrafish+model.">Host-pathogen interactions made transparent with the zebrafish model.</a> Curr. Drug Targets. 12, 1000-1017 (2011).</li><li>Davis, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+visualization+of+mycobacterium-macrophage+interactions+leading+to+initiation+of+granuloma+formation+in+zebrafish+embryos.">Real-time visualization of mycobacterium-macrophage interactions leading to initiation of granuloma formation in zebrafish embryos.</a> Immunity. 17, 693-702 (2002).</li><li>vander Sar, A. 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N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+tolerance+in+replicating+mycobacteria+mediated+by+a+macrophage-induced+efflux+mechanism.">Drug tolerance in replicating mycobacteria mediated by a macrophage-induced efflux mechanism.</a> Cell. 145, 39-53 (2011).</li><li>Ellett, F. L., Lieschke, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computational+quantification+of+fluorescent+leukocyte+numbers+in+zebrafish+embryos.">Computational quantification of fluorescent leukocyte numbers in zebrafish embryos.</a> Methods in Enzymology. , (2011).</li><li>Yuan, S., Sun, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+mRNA+and+Morpholino+Antisense+Oligonucleotides+in+Zebrafish+Embryos.">Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.</a> J. Vis. Exp. (27), e1113-e1113 (2009).</li><li>Mathias, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolution+of+inflammation+by+retrograde+chemotaxis+of+neutrophils+in+transgenic+zebrafish.">Resolution of inflammation by retrograde chemotaxis of neutrophils in transgenic zebrafish.</a> J. Leukoc. Biol. 80, 1281-1288 (2006).</li><li>Hall, C., Flores, M. V., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+lysozyme+C+promoter+drives+myeloid-specific+expression+in+transgenic+fish.">The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish.</a> BMC Dev. Biol. 7, 42-42 (2007).</li><li>Gray, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+intravital+imaging+of+macrophage+and+neutrophil+behaviour+during+inflammation+using+a+novel+transgenic+zebrafish.">Simultaneous intravital imaging of macrophage and neutrophil behaviour during inflammation using a novel transgenic zebrafish.</a> Thromb. Haemost. 105, 811-819 (2011).</li></ol>

लेखकों का खुलासा करने के लिए के लिए कुछ भी नहीं है.

संक्रमण के इस आलेख में वर्णित तरीकों अक्सर मेजबान सहज रोगक्षमता जीन या बैक्टीरियल विषैलापन जीन 1 समारोह का अध्ययन किया जाता है. नसों सूक्ष्म इंजेक्शन तरीकों (5 प्रोटोकॉल और 6.1) सबसे अक्सर इस तरह के अध्ययन के लिए उपयोग किया जाता है. पीछे रक्त द्वीप पर दुम का नस 1 दिन पुराने भ्रूण की नसों में इंजेक्शन के लिए सबसे सुविधाजनक स्थान है. दुम का नस और बाद के चरणों में घुसना मुश्किल हो जाता है, हम 2-3 DPF में भ्रूण के लिए अंतःशिरा इंजेक्शन साइट के रूप में कुवियर की वाहिनी पसंद करते हैं. सभी मामलों में यह जीवाणुओं की लगातार संख्या, जो CFU गिनती लिए इंजेक्शन inocula चढ़ाना द्वारा जाँच की जानी चाहिए साथ भ्रूण इंजेक्षन करने के लिए महत्वपूर्ण है. निम्नलिखित पहलुओं प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य इंजेक्शन प्राप्त करने के लिए विचार किया जाना चाहिए. सबसे पहले, यह आवश्यक है के लिए उच्च गुणवत्ता वाले गिलास microcapillary इंजेक्शन सुई है. यदि सुई टिप बहुत बड़ी है, इंजेक्शन घटित खून बह रहा करने के लिए एक पंचर छेद काफी बड़ा बनाने और होगाइंजेक्शन बैक्टीरिया रक्त परिसंचरण के बाहर प्रवाह होगा. दूसरे, बैक्टीरिया रक्त परिसंचरण में सीधे इंजेक्शन चाहिए. यदि सुई टिप नस के अंदर या यदि इंजेक्शन की जर्दी थैली विस्तार में तरल पदार्थ फैलता नहीं है, भ्रूण के प्रयोग से खारिज किया जाना चाहिए. तीसरा, एक कैरियर के रूप में एम. के इंजेक्शन लगाने के लिए PVP40 का उपयोग marinum गिलास सुई में डूब से बैक्टीरिया को रोकने में सहायता करेगा. PVP40 निलंबन की एकरूपता में सुधार, इंजेक्शन की अवधि में और अधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य inocula में जिसके परिणामस्वरूप. PVP40 भी एस के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है typhimurium इंजेक्शन, लेकिन यहाँ यह कम महत्वपूर्ण है क्योंकि बड़े आकार और बैक्टीरिया के उज्ज्वल प्रतिदीप्ति प्रयोगों के दौरान इंजेक्शन inoculum पर एक दृश्य नियंत्रण की अनुमति देता है. हम इंजेक्शन अभ्यास के लिए phenol के लाल डाई (1% v / v) या 1 फ्लोरोसेंट (Invitrogen) अलग अलग रंग में उपलब्ध क्षेत्रों माइक्रोन के उपयोग की सलाह देते हैं. एक बार इस तकनीक में महारत हासिल है, यह लगभग 30 minut लेतातों 50-100 भ्रूण इंजेक्षन करने के लिए agarose प्लेटों पर भ्रूण aligning और बैक्टीरिया इंजेक्शन की मात्रा का समायोजन करने के लिए आवश्यक समय सहित. जबकि रक्त द्वीप (5 प्रोटोकॉल) में या नसों में इंजेक्शन कुवियर (6.1 प्रोटोकॉल) वाहिनी में सबसे अधिक उपयोग किया जाता है, इस वीडियो लेख में वर्णित संक्रमण की वैकल्पिक मार्गों बृहतभक्षककोशिका और न्युट्रोफिल chemotaxis अध्ययन के लिए उपयोगी (6.2 प्रोटोकॉल, 6.3 साबित कर दिया है , और 6.4), तनु जीवाणु उपभेदों (6.5 प्रोटोकॉल) के विकास का अध्ययन करने के लिए, और उच्च throughput (6.6 प्रोटोकॉल) अनुप्रयोगों 4-8 के लिए zebrafish संक्रमण मॉडल अनुकूलन. वर्णित सूक्ष्म इंजेक्शन तरीकों वायरस 18, 19, कवक spores 14, 20 या प्रोटोजोआ परजीवी (मारिया Forlenza, व्यक्तिगत संचार) के इंजेक्शन के लिए भी लागू किया जा सकता है. इंजेक्शन इस वीडियो लेख में वर्णित प्रक्रियाओं के लिए एक उपयोगी इसके अलावा जीवाणुओं की zebr में चमड़े के नीचे इंजेक्शन के लिए एक हाल ही में वर्णित प्रक्रिया हैभ्रूण afish 21. इस प्रक्रिया बैक्टीरिया की phagocytosis के न्युट्रोफिल, जो ऊतक सतहों पर कुशलता से निगल जाना बैक्टीरिया पाए गए, लेकिन अध्ययन के लिए लागू किया गया था, मैक्रोफेज करने के लिए इसके विपरीत में, लगभग इंजेक्शन पर रक्त में या तरल पदार्थ से भरे शरीर cavities में बैक्टीरिया phagocytose करने में असमर्थ थे. चमड़े के नीचे इंजेक्शन भ्रूण के लिए पूंछ पेशी इंजेक्शन के लिए इस वीडियो लेख में वर्णित के रूप में इसी तरह तैनात हैं, लेकिन सुई सिर्फ त्वचा के नीचे डाला जाता है विखंड पर बैक्टीरिया इंजेक्षन. यह महत्वपूर्ण है पर विचार करने के लिए है कि सूक्ष्म इंजेक्शन अनिवार्य रूप से संक्रमण के एक कृत्रिम मार्ग है. हालांकि, जल्दी भ्रूण अत्यधिक बैक्टीरियल रोगज़नक़ों के लिए बाहरी जोखिम के लिए प्रतिरोधी रहे हैं. वास्तव में, जहां भ्रूण एक बैक्टीरियल निलंबन में स्नान कर रहे हैं विसर्जन, assays, 22 हाथों में प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य नहीं हैं. जबकि कुछ भ्रूण विसर्जन पर संक्रमित हो सकते हैं, हम मृत्यु दर में और एक्सप्रेस में एक बड़े बदलाव मनाया हैऐसे assays में व्यक्तिगत भ्रूण के बीच भड़काऊ मार्कर जीन आयन. सूक्ष्म इंजेक्शन इस आलेख में वर्णित तरीकों में प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य संक्रमण प्राप्त करने के लिए और विशेष रूप से मेजबान सहज प्रतिरक्षा कोशिकाओं के साथ बातचीत बैक्टीरिया का अध्ययन करने के लिए उपयोगी होते हैं. एक कुशल व्यक्ति भ्रूण में जीवाणु संक्रमण यों दृष्टिकोण करने के लिए कस्टम, समर्पित पिक्सेल मात्रा का ठहराव 17 सॉफ्टवेयर, 23 के साथ संक्रमित भ्रूण के फ्लोरोसेंट छवियों का विश्लेषण है. इस दृष्टिकोण अच्छी तरह से करने के लिए संक्रमित भ्रूण के चढ़ाना के बाद CFU गिनती के परिणामों के साथ सहसंबंधी दिखाया गया है. इसी प्रकार, भ्रूण प्रति ल्युकोसैट संख्या में रिश्तेदार परिवर्तन ट्रांसजेनिक ल्युकोसैट की fluorophore संवाददाता लाइनों में डिजिटल छवि विश्लेषण के द्वारा मात्रा निर्धारित किया गया है, इस दृष्टिकोण मेजबान 24 संक्रमण के leukopoietic प्रतिक्रिया बढ़ाता लागू होगा. मेजबान सहज प्रतिरक्षा जीनों के समारोह vivo में कुशलता से किया जा सकता है वर्णित संक्रमण मॉडल के संयोजन के द्वारा जांचmorpholino पछाड़ना के साथ. Morpholinos सिंथेटिक antisense oligonucleotides है कि विशिष्ट RNAs के लक्ष्य और जीन उत्पादों की अभिव्यक्ति को कम जब एक सेल चरण zebrafish भ्रूण में इंजेक्शन के रूप में इस पत्रिका 10, 25 में अन्य वीडियो लेख में दिखाया गया हैं. Morpholino पछाड़ना अध्ययन में, यह काफी महत्व की है कि सभी भ्रूण समूहों की तुलना में सही ढंग से मंचन कर रहे हैं जीवाणु इंजेक्शन से पहले. यह विशेष रूप से महत्वपूर्ण है क्योंकि भ्रूण एक विकासशील प्रतिरक्षा प्रणाली है कि तेजी से समय पर सक्षम हो जाता है. वहाँ कई ट्रांसजेनिक संवाददाता लाइनों वर्तमान प्रमुख सहज प्रतिरक्षा सबसेट, zebrafish भ्रूण में मैक्रोफेज और neutrophils, भेद के लिए उपलब्ध हैं. MPX और lyz प्रमोटरों न्युट्रोफिल रिपोर्टर 16 लाइनों, 26, 27 उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया गया है, और csf1r (एफएमएस) और MPEG1 प्रमोटरों बृहतभक्षककोशिका संवाददाताओं से 14, 28 का उत्पादन किया गया. जबकि सी.एस.एफ.में 1R (एफएमएस) को अतिरिक्त xanthophores में व्यक्त किया है, MPEG1 अभिव्यक्ति मैक्रोफेज में विशेष रूप है. जैसा कि इस वीडियो लेख में दिखाया गया है, हाल ही में विकसित MPEG1 संवाददाता लाइनों इमेजिंग मैक्रोफेज द्वारा जीवाणु phagocytosis के लिए बहुत उपयोगी हैं.

<table border="1"><tbody><tr><td> अभिकर्मक </td><td> प्रदायक </td><td> सूचीपत्र संख्या </td></tr><tr><td> Phenol लाल </td><td> सिग्मा </td><td> P0290 </td></tr><tr><td> ग्लिसरॉल </td><td> सिग्मा Aldrich </td><td> २२८२१० </td></tr><tr><td> Difco Middlebrook 7H10 अगर </td><td> Becton Dickenson, और कंपनी </td><td> 262,710 </td></tr><tr><td> बीबीएल Middlebrook OADC संवर्धन </td><td> Becton Dickenson, और कंपनी </td><td> 211,886 </td></tr><tr><td> Difco Middlebrook 7H9 शोरबा </td><td> Becton Dickenson, और कंपनी </td><td> +२,७१,३१० </td></tr><tr><td> बीबीएल Middlebrook एडीसी संवर्धन </td><td> Becton Dickenson, और कंपनी </td><td> 211,887 </td></tr><tr><td> 80 के बीच </td><td> सिग्मा Aldrich </td><td> P1754 </td></tr><tr><td> Polyvinylpyrrolidone (PVP40) </td><td> Calbiochem, मर्क KGaA </td><td> 529,504 </td></tr><tr><td> एन &lt;/ Em&gt; के Phenylthiourea (पी टी यू) </td><td> सिग्मा Aldrich </td><td> P7629 </td></tr><tr><td> एथिल 3 aminobenzoate methanesulfonate नमक (Tricaine) </td><td> सिग्मा Aldrich </td><td> A5040 </td></tr><tr><td> मिथाइल सेलूलोज़ </td><td> सिग्मा Aldrich </td><td> M0387 </td></tr><tr><td> SeaPlaque agarose (कम पिघलने बिंदु agarose) </td><td> LONZA इंक </td><td> 50,100 </td></tr><tr><td> FluoSpheres (1.0 माइक्रोन, लाल फ्लोरोसेंट (605/580)) </td><td> Invitrogen </td><td> F8821 </td></tr><tr><td> FluoSpheres (1.0 माइक्रोन, पीले, हरे रंग का फ्लोरोसेंट (515/505)) </td><td> Invitrogen </td><td> F8823 </td></tr></tbody></table>

infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as a model for studying the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen interactions 1. The major cell types of the innate immune system, macrophages and neutrophils, develop during the first days of embryogenesis prior to the maturation of lymphocytes that are required for adaptive immune responses. The ease of obtaining large numbers of embryos, their accessibility due to external development, the optical transparency of embryonic and larval stages, a wide range of genetic tools, extensive mutant resources and collections of transgenic reporter lines, all add to the versatility of the zebrafish model. Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. typhimurium) and Mycobacterium marinum can reside intracellularly in macrophages and are frequently used to study host-pathogen interactions in zebrafish embryos. The infection processes of these two bacterial pathogens are interesting to compare because S. typhimurium infection is acute and lethal within one day, whereas M. marinum infection is chronic and can be imaged up to the larval stage 2, 3. The site of micro-injection of bacteria into the embryo (Figure 1) determines whether the infection will rapidly become systemic or will initially remain localized. A rapid systemic infection can be established by micro-injecting bacteria directly into the blood circulation via the caudal vein at the posterior blood island or via the Duct of Cuvier, a wide circulation channel on the yolk sac connecting the heart to the trunk vasculature. At 1 dpf, when embryos at this stage have phagocytically active macrophages but neutrophils have not yet matured, injecting into the blood island is preferred. For injections at 2-3 dpf, when embryos also have developed functional (myeloperoxidase-producing) neutrophils, the Duct of Cuvier is preferred as the injection site. To study directed migration of myeloid cells towards local infections, bacteria can be injected into the tail muscle, otic vesicle, or hindbrain ventricle 4-6. In addition, the notochord, a structure that appears to be normally inaccessible to myeloid cells, is highly susceptible to local infection 7. A useful alternative for high-throughput applications is the injection of bacteria into the yolk of embryos within the first hours after fertilization 8. Combining fluorescent bacteria and transgenic zebrafish lines with fluorescent macrophages or neutrophils creates ideal circumstances for multi-color imaging of host-pathogen interactions. This video article will describe detailed protocols for intravenous and local infection of zebrafish embryos with S. typhimurium or M. marinum bacteria and for subsequent fluorescence imaging of the interaction with cells of the innate immune system.

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Infection of Zebrafish Embryos with Intracellular Bacterial Pathogens

पारदर्शी zebrafish भ्रूण उपयोगी मॉडल कल्पना करने के लिए मेजबान और इस तरह के रूप में सहज प्रतिरक्षा कोशिकाओं और intracellular बैक्टीरियल रोगज़नक़ों के बीच में कार्यात्मक अध्ययन बातचीत, साबित कर दिया है<em&gt; साल्मोनेला</em&gt; और<em&gt; माइकोबैक्टीरियम marinum</em&gt;. बैक्टीरिया और बहु ​​रंग प्रतिदीप्ति इमेजिंग की माइक्रो इंजेक्शन आवश्यक तकनीक zebrafish भ्रूण संक्रमण मॉडलों के आवेदन में शामिल हैं.

Zebrafish भ्रूण की Intracellular बैक्टीरियल रोगज़नक़ों के साथ संक्रमण

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Intracellular pathogens such as legionella, mycobacteria and Chlamydia-like organisms are difficult to isolate because they often grow poorly or not at ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

जनरेशन और मल्टी-प्ररूपी उच्च सामग्री स्क्रीनिंग<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Transposon म्यूटेंट

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

Applying an Inducible Expression System to Study Interference of Bacterial Virulence Factors with Intracellular Signaling

एक inducible अभिव्यक्ति प्रणाली लागू करने Intracellular संकेतन के साथ बैक्टीरियल विषैलापन कारक के हस्तक्षेप के अध्ययन करने के लिए

The technique presented here allows one to analyze at which step a target protein, or alternatively a small molecule, interacts with the components of a ...

Identification of Rare Bacterial Pathogens by 16S rRNA Gene Sequencing and MALDI-TOF MS

-16 RRNA जीन अनुक्रमण और MALDI-TOF एमएस द्वारा दुर्लभ बैक्टीरियल रोगज़नक़ों की पहचान

There are a number of rare and, therefore, insufficiently described bacterial pathogens which are reported to cause severe infections especially in ...

Isolation of Single Intracellular Bacterial Communities Generated from a Murine Model of Urinary Tract Infection for Downstream Single-cell Analysis

एकल-कोशिकीय जीवाणु समुदायों का अलगाव जो अनुप्रवाह एकल कोशिका विश्लेषण के लिए मूत्र पथ के संक्रमण के म्यूरिन मॉडल से उत्पन्न होता है ।

In this article, we outline a procedure used to isolate individual intracellular bacterial communities from a mouse that has been experimentally infected ...

Opsonophagocytic Killing Assay to Assess Immunological Responses Against Bacterial Pathogens

बैक्टीरियल रोगजनकों के खिलाफ Immunological प्रतिक्रियाओं का आकलन करने के लिए Opsonophagocytic हत्या परख

A key aspect of the immune response to bacterial colonization of the host is phagocytosis. An opsonophagocytic killing assay (OPKA) is an experimental ...

Visualization of Macrophage Lytic Cell Death During Mycobacterial Infection in Zebrafish Embryos via Intravital Microscopy

इंट्रावेटल माइक्रोस्कोपी के माध्यम से जेब्राफिश भ्रूण में माइकोबैक्टीरियल संक्रमण के दौरान मैक्रोफेज लिटिक सेल डेथ का दृश्य

Zebrafish is an excellent model organism for studying innate immune cell behavior due to its transparent nature and reliance solely on its innate immune ...

Determination of Chemical Inhibitor Efficiency against Intracellular Toxoplasma Gondii Growth Using a Luciferase-Based Growth Assay

Determination of Chemical Inhibitor Efficiency against Intracellular Toxoplasma Gondii Growth Using a Luciferase-Based Growth Assay

एक लूसिफ़ेरेज़ आधारित विकास परख का उपयोग कर इंट्रासेलर टॉक्सोप्लाज्मा गोंडी विकास के खिलाफ रासायनिक अवरोधक दक्षता का निर्धारण

Toxoplasma gondii is a protozoan pathogen that widely affects the human population. The current antibiotics used for treating clinical toxoplasmosis are ...