Name: infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens
Uploaded: 2012-03-15T12:00:00
Duration: 11 min 18 s
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Os autores gostariam de agradecer Cui Chao, Andar de Kort, Stoop Esther e Ralph Carvalho de imagens na Figura 4, Nehrdich Ulrike e de Davy Witt para cuidado dos peixes, e os membros do laboratório para outras discussões úteis. Este trabalho é apoiado pelo Programa Mix inteligente do Ministério neerlandês dos Assuntos Económicos e do Ministério da Educação, Cultura e Ciência, a Comissão Europeia sétimo projeto quadro ZF-SAÚDE (SAÚDE-F4-2010-242048), o Europeu Marie-Curie Formação inicial Rede FishForPharma (PITN-GA-2011-289209), e pelo NHMRC australiano (637.394). O australiano Medicina Regenerativa Institute é suportado por concessões do Governo do Estado de Victoria e do governo australiano.

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Os autores não têm nada a revelar.

Os métodos de infecção descritas neste artigo são frequentemente usados ​​para estudar a função dos genes hospedeiros inatas imunidade ou genes de virulência bacterianos 1. Os micro-injecção intravenosa métodos (protocolos 5 e 6.1) são usados ​​com mais freqüência para tais estudos. A veia caudal no ilha de sangue posterior é o local mais conveniente para injecção intravenosa de um dia de idade embriões. Como a veia caudal torna-se mais difícil de penetrar em fases posteriores, preferimos o ducto de Cuvier como local da injeção intravenosa de embriões em 2-3 dpf. Em todos os casos é fundamental para injetar os embriões com números consistentes de bactérias, que devem ser verificados por inóculos injeção de revestimento para a contagem de ufc. Os seguintes aspectos devem ser considerados para alcançar injeções reprodutíveis. Em primeiro lugar, é essencial ter vidro de alta qualidade agulhas de injecção microcapilar. Se a ponta da agulha é muito grande, a injecção irá criar um orifício de punção grande o suficiente para que ocorra o sangramento eas bactérias injectadas fluirá para fora da circulação sanguínea. Em segundo lugar, as bactérias devem ser injectado directamente para a circulação sanguínea. Se a ponta da agulha não está dentro da veia ou se espalha injecção de fluido para a extensão saco vitelino, o embrião deve ser descartada a partir da experiência. Em terceiro lugar, usando PVP40 como um portador para injectar M. marinum irá ajudar a prevenir as bactérias de afundar-se na agulha de vidro. PVP40 melhora a homogeneidade da suspensão, resultando em inóculos mais reprodutível durante toda a duração de injecções. PVP40 pode também ser utilizado para S. injecções typhimurium, mas aqui, é menos importante, porque o tamanho maior e fluorescência brilhante das bactérias permite um controlo visual sobre o inoculo de injecção durante as experiências. Para praticar as injecções recomenda-se a utilização de fenol corante vermelho (1% v / v) ou 1 mícron esferas fluorescentes disponíveis em cores diferentes (Invitrogen). Uma vez que a técnica é dominada, leva cerca de 30 minutes para injectar 50-100 embriões, incluindo o tempo necessário para alinhar os embriões em placas de agarose e ajustando o volume de injecção bacteriana. Enquanto injeções intravenosas para a ilha de sangue (protocolo 5) ou no ducto de Cuvier (protocolo 6.1) são os mais usados, as vias alternativas de infecção descritos neste artigo de vídeo têm se mostrado úteis para estudar a quimiotaxia de macrófagos e neutrófilos (protocolos 6.2, 6.3 , e 6,4), para estudar o crescimento de estirpes bacterianas atenuadas (protocolo 6,5), e para adaptar o modelo de infecção do peixe-zebra para aplicações de alto rendimento (protocolo 6,6) 4-8. As micro-injecção descritos métodos também podem ser aplicados para injecções de vírus 18, 19, esporos de fungos 14, 20 ou parasitas protozoários (Maria Forlenza, comunicação pessoal). Uma adição útil para os procedimentos de injecção descritos neste artigo de vídeo é um procedimento recentemente descrito para a injecção subcutânea de bactérias em zebrembriões afish 21. Este procedimento foi aplicado para estudar a fagocitose de bactérias por neutrófilos, que foram encontrados para as bactérias de forma eficiente engolfam em superfícies de tecido, mas, em contraste com os macrófagos, eram virtualmente incapaz de fagocitam bactérias mediante injecção no sangue ou em cavidades cheias de fluido do corpo. Para embriões injecções subcutâneas são posicionados semelhante como para as injecções de cauda musculares descritos neste artigo de vídeo, mas a agulha é inserida debaixo da pele para injectar as bactérias durante um somito. É importante considerar que a micro-injecção é essencialmente uma rota artificial de infecção. No entanto, os embriões precoces são altamente resistentes à exposição externa para agentes patogénicos bacterianos. De facto, os ensaios de imersão, em que os embriões são banhadas numa suspensão bacteriana, não são reprodutíveis nas nossas mãos 22. Enquanto alguns embriões podem ser infectados após imersão, temos observado uma grande variação nas taxas de mortalidade e na expressaião de genes marcadores inflamatórios entre os embriões individuais em tais ensaios. Os métodos de micro-injecção descritos neste artigo atingir infecções reprodutíveis e são particularmente úteis para estudar as interacções bacterianas com hospedeiras inatos células imunes. Uma abordagem eficiente para quantificar a infecção bacteriana em embriões individuais é analisar as imagens fluorescentes de embriões infectados com custom-made software de quantificação, dedicado pixels 17, 23. Esta abordagem tem sido demonstrado que se correlacionam bem com os resultados das contagens de UFC após o plaqueamento de embriões infectados. Da mesma forma, mudanças relativas no número de leucócitos por embrião foram quantificados pela análise de imagem digital em transgênicos leucócitos linhas repórter fluoróforo; esta abordagem seria aplicável para quantificar a resposta do hospedeiro à infecção leukopoietic 24. A função do hospedeiro inatos genes imunes podem ser investigadas eficientemente in vivo através da combinação dos modelos de infecção descritascom knockdown morfolino. Morpholinos são oligonucleótidos anti-sentido sintéticos que têm como alvo RNAs específicos e reduzir a expressão dos produtos dos genes quando injectado 1 de células de embriões peixe-zebra fase, como mostrado na outros artigos de vídeo nesta revista 10, 25. Em estudos knockdown morfolino, é de grande importância que todos os grupos de embriões a serem comparadas são testados correctamente antes de injecções bacterianas. Isto é especialmente importante porque os embriões têm um desenvolvimento do sistema imunitário que se torna cada vez mais competente ao longo do tempo. Existem várias linhas transgénicas repórter actualmente disponíveis para distinguir os principais inatos subconjuntos imunes, macrófagos e neutrófilos, em embriões de peixe-zebra. A MPX e promotores LYZ têm sido usados ​​para gerar as linhas de repórter de neutrófilos 16, 26, 27, eo csf1r (SFM) e MPEG1 promotores foram usados ​​para produzir repórteres de macrófagos 14, 28. Enquanto csf1r (FMS) é adicionalmente expressa em xanthophores, mpeg1 expressão é exclusivamente nos macrófagos. Como mostrado neste artigo de vídeo, os recentemente desenvolvidos mpeg1 linhas repórter são altamente úteis para a fagocitose de imagem bacteriana por macrófagos.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagente </td><td> Fornecedor </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> Vermelho de Fenol </td><td> Sigma </td><td> P0290 </td></tr><tr><td> Glicerina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 228210 </td></tr><tr><td> Difco ágar Middlebrook 7H10 </td><td> Becton, Dickinson and Company </td><td> 262710 </td></tr><tr><td> BBL Middlebrook Enrichment OADC </td><td> Becton, Dickinson and Company </td><td> 211886 </td></tr><tr><td> Middlebrook 7H9 Broth Difco </td><td> Becton, Dickinson and Company </td><td> 271310 </td></tr><tr><td> BBL Middlebrook Enrichment ADC </td><td> Becton, Dickinson and Company </td><td> 211887 </td></tr><tr><td> Tween 80 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P1754 </td></tr><tr><td> Polivinilpirrolidona (PVP40) </td><td> Calbiochem, Merck KGaA </td><td> 529504 </td></tr><tr><td> N &lt;/ Em&gt;-Phenylthiourea (PTU) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P7629 </td></tr><tr><td> 3-aminobenzoato de etilo sal metanossulfonato (tricaina) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A5040 </td></tr><tr><td> Metil celulose </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M0387 </td></tr><tr><td> SeaPlaque Agarose (baixo ponto de fusão de agarose) </td><td> Lonza Inc. </td><td> 50100 </td></tr><tr><td> FluoSpheres (1,0 uM, vermelho fluorescente (580/605)) </td><td> Invitrogen </td><td> F8821 </td></tr><tr><td> FluoSpheres (1,0 mM, amarelo-verde fluorescente (505/515)) </td><td> Invitrogen </td><td> F8823 </td></tr></tbody></table>

infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens

Peixe-zebra (Danio rerio) embriões são cada vez mais utilizado como um modelo para estudar a função do sistema inato vertebrado imune no hospedeiro de organismos patogénicos interacções 1. Os principais tipos de células do sistema imune inato, macrófagos e neutrófilos, desenvolver-se durante os primeiros dias de embriogénese antes da maturação dos linfócitos que são necessários para as respostas imunitária adaptativa. A facilidade de obtenção de um grande número de embriões, a sua acessibilidade devido ao desenvolvimento externo, a transparência óptica de estágios embrionários e larval, uma ampla gama de ferramentas genéticas, extensos recursos mutantes e coleções de linhas repórter transgênicos, tudo isto contribui para a versatilidade do peixe-zebra modelo. Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. typhimurium) e Mycobacterium marinum pode residir intracelularmente em macrófagos e são frequentemente usados ​​para estudar interações patógeno-hospedeiro em embriões de peixe zebra. Os processos a infecção destas duaspatógenos bacterianos são interessantes para comparar porque S. infecção typhimurium é aguda e letal dentro de um dia, enquanto M. marinum infecção é crônica e pode ser trabalhada até o estágio larval 2, 3. O local de micro-injecção de bactérias no embrião (Figura 1) determina se a infecção se tornar-se rapidamente sistémica ou será inicialmente permanecer localizada. Uma infecção sistémica rápida pode ser estabelecida por micro-injecção de bactérias directamente para a circulação do sangue através da veia caudal no ilha de sangue posterior ou através do duto de Cuvier, um canal de circulação de largura no saco vitelino de ligar o coração para a vasculatura do tronco. Em 1 dpf, quando embriões nesta fase têm macrófagos phagocytically ativos, mas neutrófilos ainda não amadureceram, injetando na ilha de sangue é o preferido. Para injeções em 2-3 dpf, quando os embriões também desenvolveram funcionais (mieloperoxidase produtora) neutrófilos, o ducto de Cuvier é preferido como tele no local da injecção. Para estudar a migração dirigida de células mielóides no sentido infecções locais, as bactérias podem ser injectado no músculo da cauda, ​​vesícula ótica, ou ventrículo rombencéfalo 4-6. Além disso, o notocórdio, uma estrutura que parece ser normalmente inacessíveis às células mielóides, é altamente susceptíveis à infecção local 7. Uma alternativa útil para aplicações de alto rendimento é a injeção de bactérias na gema de embriões nas primeiras horas após a fertilização 8. Combinando as bactérias fluorescentes e linhas de zebrafish transgênicos fluorescentes com macrófagos ou neutrófilos cria condições ideais para multi-cor de imagem de sistema patógeno-hospedeiro interações. Este artigo irá descrever vídeo protocolos detalhados para a infecção por via intravenosa e local de embriões de zebrafish com S. typhimurium ou M. bactérias marinum e para imagens de fluorescência posterior da interação com células do sistema imune inato.

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Infection of Zebrafish Embryos with Intracellular Bacterial Pathogens

Embriões do zebrafish transparente provaram anfitriões modelo útil para visualizar e interações de estudo funcional entre as células imunes inatas e patógenos bacterianos intracelulares, tais como<em&gt; Salmonella typhimurium</em&gt; E<em&gt; Mycobacterium marinum</em&gt;. A micro-injecção de bactérias e de multi-cor de imagem de fluorescência são técnicas essenciais envolvidos na aplicação de modelos de infecção peixe-zebra de embriões.

A infecção de embriões de zebrafish com patógenos bacterianos intracelulares

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as a model for studying the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

'Bioluminescent' Reporter Phage for the Detection of Category A Bacterial Pathogens

&quot;Bioluminescent &#39;Phage Reporter para a detecção de patógenos bacterianos Categoria A

Yersinia pestis and Bacillus anthracis are Category A bacterial pathogens that are the causative agents of the plague and anthrax, respectively 1. ...

Imunologia e Infecção

Single Cell Measurements of Vacuolar Rupture Caused by Intracellular Pathogens

Medidas de ruptura vacuolar única célula causadas por patógenos intracelulares

Shigella flexneri are pathogenic bacteria that invade host cells entering into an endocytic vacuole. Subsequently, the rupture of this membrane-enclosed ...

Discovery of New Intracellular Pathogens by Amoebal Coculture and Amoebal Enrichment Approaches

Descoberta de Novos intracelulares Patógenos por amebas Coculture e Abordagens de amebas de enriquecimento

Intracellular pathogens such as legionella, mycobacteria and Chlamydia-like organisms are difficult to isolate because they often grow poorly or not at ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Geração e Multi-fenotípica rastreio de alto teor de<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; mutantes por transposões

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

Applying an Inducible Expression System to Study Interference of Bacterial Virulence Factors with Intracellular Signaling

Aplicando um sistema de expressão induzível para estudar interferência de fatores de virulência bacteriana com Sinalização Intracelular

The technique presented here allows one to analyze at which step a target protein, or alternatively a small molecule, interacts with the components of a ...

Identification of Rare Bacterial Pathogens by 16S rRNA Gene Sequencing and MALDI-TOF MS

Identificação de patógenos bacterianos raras, seqüência do gene 16rRNA e MALDI-TOF MS

There are a number of rare and, therefore, insufficiently described bacterial pathogens which are reported to cause severe infections especially in ...

Isolation of Single Intracellular Bacterial Communities Generated from a Murine Model of Urinary Tract Infection for Downstream Single-cell Analysis

Isolamento de comunidades de bacterianas intracelulares único gerado a partir de um modelo murino de infecção do trato urinário para análise de célula única a jusante

In this article, we outline a procedure used to isolate individual intracellular bacterial communities from a mouse that has been experimentally infected ...

Opsonophagocytic Killing Assay to Assess Immunological Responses Against Bacterial Pathogens

Ensaio de matar Opsonophagocytic para avaliar as respostas imunológicas contra patógenos bacterianos

A key aspect of the immune response to bacterial colonization of the host is phagocytosis. An opsonophagocytic killing assay (OPKA) is an experimental ...

Visualization of Macrophage Lytic Cell Death During Mycobacterial Infection in Zebrafish Embryos via Intravital Microscopy

Visualização da morte de células ticas de macrófago durante infecção micobacteriana em embriões de zebrafish via microscopia intravital

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Determination of Chemical Inhibitor Efficiency against Intracellular Toxoplasma Gondii Growth Using a Luciferase-Based Growth Assay

Determination of Chemical Inhibitor Efficiency against Intracellular Toxoplasma Gondii Growth Using a Luciferase-Based Growth Assay

Determinação da eficiência do inibidor químico contra o crescimento intracelular toxoplasma Gondii usando um ensaio de crescimento baseado em luciferase

Toxoplasma gondii is a protozoan pathogen that widely affects the human population. The current antibiotics used for treating clinical toxoplasmosis are ...