Name: isolation of soluble and insoluble prp oligomers in the normal human brain
Uploaded: 2012-10-03T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Soluble and Insoluble PrP Oligomers in the Normal Human Brain at JoVE.com

De auteurs zijn dank verschuldigd aan het menselijk brein en Spinal Fluid Resource Center (Los Angeles, Californië) voor het verstrekken van normale hersenen monsters. Dit onderzoek werd ondersteund door de National Institutes of Health (NIH) R01NS062787, de CJD Foundation, Alliance biologisch veilig, evenals het Universitair Centrum on Aging en Gezondheid met de steun van de McGregor Foundation en de President&#39;s Discretionary Fund (Case Western Reserve University) .

1. Bereiding van hersenhomogenaat en Detergent oplosbaar (S2) en onoplosbaar (P2) Fractions <ol><li> Neem 100 mg bevroren menselijk hersenweefsel en voeg 100 ul lysis buffer (10 mM Tris, 150 mM NaCl, 0,5% Nonidet P-40 (NP-40), 0,5% EDTA, pH 7,4). </li><li> Meng op ijs met stamper aangedreven door een motor draadloze, bevriezen in droog ijs gedurende 5 minuten en opnieuw gehomogeniseerd met behulp stamper aangedreven door handen en vervolgens door een motor, en voeg 300 ul of 800 ul lysis buffer (dit is ofwel de 20 % o...

<ol>
	<li>Prusiner, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prions.+Proc.">Prions. Proc.</a> Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 13363-13383 (1998).</li><li>Oesch, B., Westaway, D., W&#228;lchli, M., McKinley, M. P., Kent, S. B. H., Aebersold, R., Barry, R. A., Tempst, P., Teplow, D. B., Hood, L. E., Prusiner, S. B., Weissmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cellular+gene+encodes+scrapie+PrP+27-30+protein.">A cellular gene encodes scrapie PrP 27-30 protein.</a> Cell. 40, 735-746 (1985).</li><li>Bolton, D. C., McKinley, M. P., Prusiner, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+protein+that+purifies+with+the+scrapie+prion.">Identification of a protein that purifies with the scrapie prion.</a> Science. 218, 1309-1311 (1982).</li><li>Prusiner, S. B., McKinley, M. P., Bowman, K. A., Bolton, D. C., Bendheim, P. E., Groth, D. F., Glenner, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scrapie+prions+aggregate+to+form+amyloid-like+birefringent+rods.">Scrapie prions aggregate to form amyloid-like birefringent rods.</a> Cell. 35, 349-358 (1983).</li><li>Hope, J., Morton, L. J., Farquhar, C. F., Multhaup, G., Beyreuther, K., Kimberlin, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+major+polypeptide+of+scrapie-associated+fibrils+(SAF)+has+the+same+size,+charge+distribution+and+N-terminal+protein+sequence+as+predicted+for+the+normal+brain+protein+(PrP).">The major polypeptide of scrapie-associated fibrils (SAF) has the same size, charge distribution and N-terminal protein sequence as predicted for the normal brain protein (PrP).</a> EMBO J. 5, 2591-2597 (1986).</li><li>Prusiner, S. B., Groth, D. F., Bolton, D. C., Kent, S. B., Hood, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+structural+studies+of+a+major+scrapie+prion+protein.">Purification and structural studies of a major scrapie prion protein.</a> Cell. 38, 127-134 (1984).</li><li>Hall, D., Edskes, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silent+prions+lying+in+wait:+a+two-hit+model+of+prion/amyloid+formation+and+infection.">Silent prions lying in wait: a two-hit model of prion/amyloid formation and infection.</a> J. Mol. Biol. 336, 775-786 (2004).</li><li>Yuan, J., Xiao, X., McGeehan, J., Dong, Z., Cali, I., Fujioka, H., Kong, Q., Kneale, G., Gambetti, P., Zou, W. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insoluble+aggregates+and+protease-resistant+conformers+of+prion+protein+in+uninfected+human+brains.">Insoluble aggregates and protease-resistant conformers of prion protein in uninfected human brains.</a> J. Biol. Chem. 281, 34848-34858 (2006).</li><li>Yuan, J., Dong, Z., Guo, J. P., McGeehan, J., Xiao, X., Wang, J., Cali, I., McGeer, P. L., Cashman, N. R., Bessen, R., Surewicz, W. K., Kneale, G., Petersen, R. B., Gambetti, P., Zou, W. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accessibility+of+a+critical+prion+protein+region+involved+in+strain+recognition+and+its+implications+for+the+early+detection+of+prions.">Accessibility of a critical prion protein region involved in strain recognition and its implications for the early detection of prions.</a> Cell. Mol. Life Sci. 65, 631-643 (2008).</li><li>Zou, W. Q., Zheng, J., Gray, D. M., Gambetti, P., Chen, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+to+DNA+detects+scrapie+but+not+normal+prion+protein.">Antibody to DNA detects scrapie but not normal prion protein.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 1380-1385 (2004).</li><li>Gambetti, P., Dong, Z., Yuan, J., Xiao, X., Zheng, M., Alshekhlee, A., Castellani, R., Cohen, M., Barria, M. A., Gonzalez-Romero, D., Belay, E. D., Schonberger, L. B., Marder, K., Harris, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+human+disease+with+abnormal+prion+protein+sensitive+to+protease.">A novel human disease with abnormal prion protein sensitive to protease.</a> Ann. Neurol. 63, 697-708 (2008).</li><li>Zou, W. Q., Puoti, G., Xiao, X., Yuan, J., Qing, L., Cali, I., Shimoji, M., Langeveld, J. P., Castellani, R., Notari, S., Crain, B., Schmidt, R. E., Geschwind, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variably+protease-sensitive+prionopathy:+A+new+sporadic+disease+of+the+prion+protein.">Variably protease-sensitive prionopathy: A new sporadic disease of the prion protein.</a> Ann. Neurol. 68, 162-172 (2010).</li><li>Zou, W. Q., Xiao, X., Yuan, J., Puoti, G., Fujioka, H., Wang, X., Richardson, S., Zhou, X., Zou, R., Li, S., Zhu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid-beta42+interacts+mainly+with+insoluble+prion+protein+in+the+Alzheimer+brain.">Amyloid-beta42 interacts mainly with insoluble prion protein in the Alzheimer brain.</a> J. Biol. Chem. 286, 15095-15105 (2011).</li><li>Zou, W. Q., Colucci, M., Gambetti, P., Chen, S. G., Potter, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+prion+proteins.">Characterization of prion proteins.</a> Methods in Molecular Biology-Neurogenetics: Methods and Protocols. , 305-314 (2002).</li><li>Tzaban, S., Friedlander, G., Schonberger, O., Horonchik, L., Yedidia, Y., Shaked, G., Gabizon, R., Taraboulos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protease-sensitive+scrapie+prion+protein+in+aggregates+of+heterogeneous+sizes.">Protease-sensitive scrapie prion protein in aggregates of heterogeneous sizes.</a> Biochemistry. 41, 12868-12875 (2002).</li></ol>

De combinatie van benaderingen hier beschreven isolaten vaste onoplosbare aggregaten PrP C en oplosbare oligomeren PrP C van de normale menselijke hersenen. Ultracentrifugatie bij 100.000 xg gedurende een uur is een klassieke methode die veelvuldig gebruikt wordt voor het afscheiden van het onoplosbare PrP Sc van de oplosbare PrP C 14. Hoewel het efficiënt een van de waarschuwingen te voorkomen tijdens het trekken van de supernatant (S2) na centrifugeren. Aangezien de gel pro...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het reagens </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Opmerkingen (optioneel) </td></tr><tr><td> Fenylmethylsulfonylfluoride </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P7626 </td><td> 72 mM in 2-propanol </td></tr><tr><td> Proteinase K </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P2308 </td><td> 2 mg / ml in H 2 O </td></tr><tr><td> PNGase F </td><td> New England Biolabs </td><td> MWGF200 </td><td></td></tr><tr><td> Ultracentrifuge LE-80K, SW55 rotor </td><td> Beckman Coulter </td><td> Part No 365668, 356860 </td><td></td></tr><tr><td> Superdex 200 HR kralen </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-1088-01 </td><td></td></tr><tr><td> AKTA FPLC systeem </td><td> GE Healthcare </td><td> 18-1900-26 </td><td></td></tr><tr><td> Molecuulgewichtmerkers </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> MWGF200 </td><td> Gevarieerd </td></tr><tr><td> Dynabeads M-280 magnetische beads </td><td> Invitrogen </td><td> 143-01 </td><td></td></tr><tr><td> 3F4 antilichaam </td><td> Covance </td><td> SIG-39600 </td><td></td></tr><tr><td> 1E4 antilichaam </td><td> Cell Sciences </td><td> M1840 </td><td></td></tr><tr><td> Ready gel 15% Tris-HCl prefab gels </td><td> Bio-Rad </td><td> 345-0020 </td><td></td></tr></tbody></table>

isolation of soluble and insoluble prp oligomers in the normal human brain

De centrale gebeurtenis in de pathogenese van prionziekten omvat een omzetting van de gastheer gecodeerde prion eiwit cellulair PrP C in zijn pathogene isovorm PrP Sc 1. PrP C is detergent-oplosbaar en gevoelig voor proteinase K (PK)-spijsvertering, terwijl PrPSc vormt detergent-onoplosbare aggregaten en is gedeeltelijk resistent tegen PK 2-6. De omzetting van PrP C PrP Sc bekend is dat conformationele overgang van α-β naar helix-sheet structuur van het eiwit omvatten. Echter, de in vivo route nog slecht begrepen. Een voorzichtige endogene PrPSc, intermediair PrP * of &quot;stille prion&quot;, moet nog worden vastgesteld in de niet-geïnfecteerde hersenen 7. Met behulp van een combinatie van biofysische en biochemische methoden, we onoplosbare PrP C aggregaten (aangeduid iPrP C) geïdentificeerd van niet-geïnfecteerde zoogdieren hersenen en gekweekte neuronalecellen 8, 9. We beschrijven gedetailleerde procedures van deze methoden, waaronder ultracentrifugatie in detergens buffer, sucrose stapgradiënt sedimentatie, size exclusion chromatografie, iPrP verrijking door gen 5-eiwit (G5p) die specifiek binden aan structureel veranderde PrP vormen 10 en PK-behandeling. De combinatie van deze methoden isolaten niet alleen onoplosbare PrP Sc en PrP C aggregaten ook oplosbare PrP C oligomeren van de normale menselijke hersenen. Aangezien de protocollen hier beschreven zijn gebruikt om zowel PrP Sc isoleren van geïnfecteerde hersenen en iPrP C uit ongeïnfecteerde hersenen, ze ons de mogelijkheid om verschillen in fysisch eigenschappen, neurotoxiciteit, en infectiviteit tussen de twee isovormen vergelijken. Een dergelijk onderzoek zal sterk verbeteren van ons begrip van de besmettelijke eiwitachtige pathogenen. De fysiologie en pathofysiologie van iPrP C zijn onduidelijk op dit moment. Met name in een nieuw identified menselijke prionziekte genoemd variabel protease-gevoelige prionopathy, vonden we een nieuwe PrPSc dat de immunoreactieve gedrag en fragmentatie met iPrP C 11, 12 deelt. Bovendien hebben we recent aangetoond dat iPrP C is de belangrijkste soorten die interageert met amyloid-β-eiwit in Alzheimer disease 13. In dezelfde studie werden deze methoden om Abeta aggregaten en oligomeren isoleren ziekte van Alzheimer 13, suggereert de toepassing ervan niet prion eiwit aggregaten betrokken bij andere neurodegeneratieve aandoeningen.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Soluble and Insoluble PrP Oligomers in the Normal Human Brain at JoVE.com

Isolation of Soluble and Insoluble PrP Oligomers in the Normal Human Brain

Een nieuwe soort cellulaire prion eiwit (PrP<sup&gt; C</sup&gt;) Is onlangs geïdentificeerd in geïnfecteerde menselijke hersenen volgens de methoden beschreven. Deze methoden kunnen worden gebruikt om verschillende PrP soorten te isoleren, terwijl sommige van hen zijn ook bruikbaar bij het isoleren andere misgevouwen proteïneaggregaten uit menselijke hersenen.

Isolatie van oplosbare en onoplosbare oligomeren in het PrP Normal Human Brain

The central event in the pathogenesis of prion diseases involves a conversion of the host-encoded cellular prion protein PrPC into its pathogenic isoform ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Identification and Isolation of Slow-Dividing Cells in Human Glioblastoma Using Carboxy Fluorescein Succinimidyl Ester (CFSE)

Identification and Isolation of Slow-Dividing Cells in Human Glioblastoma Using Carboxy Fluorescein Succinimidyl Ester CFSE

Identificatie en isolatie van Slow-delende cellen in Human Glioblastoma Met behulp van Carboxy fluoresceïne succinimidylester (CFSE)

Tumor heterogeneity represents a fundamental feature supporting tumor robustness and presents a central obstacle to the development of therapeutic ...

The Use of Primary Human Fibroblasts for Monitoring Mitochondrial Phenotypes in the Field of Parkinson's Disease

Het gebruik van primaire menselijke fibroblasten voor de monitoring van Mitochondriale fenotypes op het gebied van de ziekte van Parkinson

Parkinson's disease (PD) is the second most  common movement disorder and affects 1% of people over the age of 60 1. Because ageing is  the most important ...

Lesion Explorer: A Video-guided, Standardized Protocol for Accurate and Reliable MRI-derived Volumetrics in Alzheimer's Disease and Normal Elderly

Laesie Explorer: A-Video geleid, gestandaardiseerd protocol voor nauwkeurig en betrouwbaar MRI-afgeleide Volumetrics bij de ziekte van Alzheimer en normale Ouderen

Obtaining in vivo human brain tissue volumetrics from MRI is often complicated by various technical and biological issues. These challenges are ...

In Vivo Optical Imaging of Brain Tumors and Arthritis Using Fluorescent SapC-DOPS Nanovesicles

In Vivo Optical Imaging of Brain Tumors and Arthritis Using Fluorescent SapC-DOPS Nanovesicles

In vivo optische beeldvorming van hersentumoren en artritis met fluorescerende SAPC-DOPS nanovesicles

We describe a multi-angle rotational optical imaging (MAROI) system for in vivo monitoring of physiopathological processes labeled with a fluorescent ...

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

Excitotoxische Stimulatie van Hersenen Microslices als<em&gt; In vitro</em&gt; Model van een beroerte

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As ...

Multi-electrode Array Recordings of Human Epileptic Postoperative Cortical Tissue

Multi-electrode array Opnamen van Human Epileptische Postoperatieve Cortical Tissue

Epilepsy, affecting about 1% of the population, comprises a group of neurological disorders characterized by the periodic occurrence of seizures, which ...

Isolation, Cryopreservation and Culture of Human Amnion Epithelial Cells for Clinical Applications

Isolatie, cryopreservatie en cultuur van de mens Amnion epitheelcellen voor klinische toepassingen

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a ...

Isolation of Human Lymphatic Endothelial Cells by Multi-parameter Fluorescence-activated Cell Sorting

Isolatie van menselijke lymfatische endotheelcellen door Multi-parameter fluorescentie-geactiveerde Cell Sorting

Lymphatic system disorders such as primary lymphedema, lymphatic malformations and lymphatic tumors are rare conditions that cause significant morbidity ...

Using Saccadometry with Deep Brain Stimulation to Study Normal and Pathological Brain Function

Met behulp van Saccadometry met Deep Brain Stimulation voor normale en pathologische hersenfunctie Studie

The oculomotor system involves a large number of brain areas including parts of the basal ganglia, and various neurodegenerative diseases including ...

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

Fosfor-31 magnetische resonantie spectroscopie: een instrument voor het meten<em&gt; In Vivo</em&gt; Mitochondrial Oxydatieve Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

Skeletal muscle mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) capacity, which is critically important in health and disease, can be measured in vivo ...