Name: isolation of soluble and insoluble prp oligomers in the normal human brain
Uploaded: 2012-10-03T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Soluble and Insoluble PrP Oligomers in the Normal Human Brain at JoVE.com

La auteurs tiennent à remercier le cerveau humain et de la moelle Centre de ressources fluide (Los Angeles, CA) pour fournir des échantillons de cerveaux normaux. Cette étude a été financée par le National Institutes of Health (NIH) R01NS062787, la Fondation de la MCJ, Alliance BioSecure, ainsi que le Centre de l&#39;Université sur le vieillissement et la santé, avec le soutien de la Fondation McGregor et Fonds discrétionnaire du Président (Case Western Reserve University) .

1. Préparation d&#39;homogénat de cerveau et de la détergence soluble (S2) et insoluble (P2) Fractions <ol><li> Prenez 100 mg de tissu congelé cerveau humain et ajouter 100 ul de tampon de lyse (10 mM Tris, 150 mM NaCl, 0,5% de Nonidet P-40 (NP-40), 0,5% d&#39;EDTA, pH 7,4). </li><li> Homogénéiser le mélange sur de la glace en utilisant un pilon entraîné par un moteur sans fil, le congeler dans de la glace sèche pendant 5 min et l&#39;homogénéiser à nouveau en utilisant un pilon tirée par la main d&#39;a...

<ol>
	<li>Prusiner, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prions.+Proc.">Prions. Proc.</a> Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 13363-13383 (1998).</li><li>Oesch, B., Westaway, D., W&#228;lchli, M., McKinley, M. P., Kent, S. B. H., Aebersold, R., Barry, R. A., Tempst, P., Teplow, D. B., Hood, L. E., Prusiner, S. B., Weissmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cellular+gene+encodes+scrapie+PrP+27-30+protein.">A cellular gene encodes scrapie PrP 27-30 protein.</a> Cell. 40, 735-746 (1985).</li><li>Bolton, D. C., McKinley, M. P., Prusiner, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+protein+that+purifies+with+the+scrapie+prion.">Identification of a protein that purifies with the scrapie prion.</a> Science. 218, 1309-1311 (1982).</li><li>Prusiner, S. B., McKinley, M. P., Bowman, K. A., Bolton, D. C., Bendheim, P. E., Groth, D. F., Glenner, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scrapie+prions+aggregate+to+form+amyloid-like+birefringent+rods.">Scrapie prions aggregate to form amyloid-like birefringent rods.</a> Cell. 35, 349-358 (1983).</li><li>Hope, J., Morton, L. J., Farquhar, C. F., Multhaup, G., Beyreuther, K., Kimberlin, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+major+polypeptide+of+scrapie-associated+fibrils+(SAF)+has+the+same+size,+charge+distribution+and+N-terminal+protein+sequence+as+predicted+for+the+normal+brain+protein+(PrP).">The major polypeptide of scrapie-associated fibrils (SAF) has the same size, charge distribution and N-terminal protein sequence as predicted for the normal brain protein (PrP).</a> EMBO J. 5, 2591-2597 (1986).</li><li>Prusiner, S. B., Groth, D. F., Bolton, D. C., Kent, S. B., Hood, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+structural+studies+of+a+major+scrapie+prion+protein.">Purification and structural studies of a major scrapie prion protein.</a> Cell. 38, 127-134 (1984).</li><li>Hall, D., Edskes, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silent+prions+lying+in+wait:+a+two-hit+model+of+prion/amyloid+formation+and+infection.">Silent prions lying in wait: a two-hit model of prion/amyloid formation and infection.</a> J. Mol. Biol. 336, 775-786 (2004).</li><li>Yuan, J., Xiao, X., McGeehan, J., Dong, Z., Cali, I., Fujioka, H., Kong, Q., Kneale, G., Gambetti, P., Zou, W. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insoluble+aggregates+and+protease-resistant+conformers+of+prion+protein+in+uninfected+human+brains.">Insoluble aggregates and protease-resistant conformers of prion protein in uninfected human brains.</a> J. Biol. Chem. 281, 34848-34858 (2006).</li><li>Yuan, J., Dong, Z., Guo, J. P., McGeehan, J., Xiao, X., Wang, J., Cali, I., McGeer, P. L., Cashman, N. R., Bessen, R., Surewicz, W. K., Kneale, G., Petersen, R. B., Gambetti, P., Zou, W. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accessibility+of+a+critical+prion+protein+region+involved+in+strain+recognition+and+its+implications+for+the+early+detection+of+prions.">Accessibility of a critical prion protein region involved in strain recognition and its implications for the early detection of prions.</a> Cell. Mol. Life Sci. 65, 631-643 (2008).</li><li>Zou, W. Q., Zheng, J., Gray, D. M., Gambetti, P., Chen, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+to+DNA+detects+scrapie+but+not+normal+prion+protein.">Antibody to DNA detects scrapie but not normal prion protein.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 1380-1385 (2004).</li><li>Gambetti, P., Dong, Z., Yuan, J., Xiao, X., Zheng, M., Alshekhlee, A., Castellani, R., Cohen, M., Barria, M. A., Gonzalez-Romero, D., Belay, E. D., Schonberger, L. B., Marder, K., Harris, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+human+disease+with+abnormal+prion+protein+sensitive+to+protease.">A novel human disease with abnormal prion protein sensitive to protease.</a> Ann. Neurol. 63, 697-708 (2008).</li><li>Zou, W. Q., Puoti, G., Xiao, X., Yuan, J., Qing, L., Cali, I., Shimoji, M., Langeveld, J. P., Castellani, R., Notari, S., Crain, B., Schmidt, R. E., Geschwind, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variably+protease-sensitive+prionopathy:+A+new+sporadic+disease+of+the+prion+protein.">Variably protease-sensitive prionopathy: A new sporadic disease of the prion protein.</a> Ann. Neurol. 68, 162-172 (2010).</li><li>Zou, W. Q., Xiao, X., Yuan, J., Puoti, G., Fujioka, H., Wang, X., Richardson, S., Zhou, X., Zou, R., Li, S., Zhu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid-beta42+interacts+mainly+with+insoluble+prion+protein+in+the+Alzheimer+brain.">Amyloid-beta42 interacts mainly with insoluble prion protein in the Alzheimer brain.</a> J. Biol. Chem. 286, 15095-15105 (2011).</li><li>Zou, W. Q., Colucci, M., Gambetti, P., Chen, S. G., Potter, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+prion+proteins.">Characterization of prion proteins.</a> Methods in Molecular Biology-Neurogenetics: Methods and Protocols. , 305-314 (2002).</li><li>Tzaban, S., Friedlander, G., Schonberger, O., Horonchik, L., Yedidia, Y., Shaked, G., Gabizon, R., Taraboulos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protease-sensitive+scrapie+prion+protein+in+aggregates+of+heterogeneous+sizes.">Protease-sensitive scrapie prion protein in aggregates of heterogeneous sizes.</a> Biochemistry. 41, 12868-12875 (2002).</li></ol>

La combinaison des approches présentées ici isole toujours insolubles PrP C et agrégats solubles PrP C oligomères du cerveau humain normal. Ultracentrifugation à 100.000 xg pendant une heure est une méthode classique qui a été largement utilisé pour la séparation de l&#39;insoluble PrP Sc de la PrP C soluble 14. Bien qu&#39;il soit efficace, l&#39;une des mises en garde est d&#39;éviter la contamination lors du tirage du surnageant (S2) après centrifugat...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires (optionnel) </td></tr><tr><td> Fluorure de phénylméthylsulfonyle </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P7626 </td><td> 72 mM de 2-propanol </td></tr><tr><td> Protéinase K </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P2308 </td><td> 2 mg / ml dans du H 2 O </td></tr><tr><td> PNGase F </td><td> New England Biolabs </td><td> MWGF200 </td><td></td></tr><tr><td> Ultracentrifugeuse LE-80K, SW55 rotor </td><td> Beckman Coulter </td><td> Référence 365668, 356860 </td><td></td></tr><tr><td> Superdex 200 billes RH </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-1088-01 </td><td></td></tr><tr><td> AKTA FPLC système </td><td> GE Healthcare </td><td> 18-1900-26 </td><td></td></tr><tr><td> Marqueurs de poids moléculaire </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> MWGF200 </td><td> Varié </td></tr><tr><td> Dynabeads M-280 billes magnétiques </td><td> Invitrogen </td><td> 143-01 </td><td></td></tr><tr><td> Anticorps 3F4 </td><td> Covance </td><td> SIG-39600 </td><td></td></tr><tr><td> Anticorps 1E4 </td><td> Cell Sciences </td><td> M1840 </td><td></td></tr><tr><td> Prêt gel 15% Tris-HCl préfabriqués gels </td><td> Bio-Rad </td><td> 345-0020 </td><td></td></tr></tbody></table>

isolation of soluble and insoluble prp oligomers in the normal human brain

L&#39;événement central dans la pathogenèse des maladies à prions implique une conversion de l&#39;codée par l&#39;hôte cellulaire protéine prion PrP C dans son isoforme pathogène PrPSc 1. PrP C est soluble dans un détergent et sensible à la protéinase K (PK)-digestion, alors que la PrP Sc forme détergent insolubles dans les granulats et est partiellement résistante à la PK 2-6. La conversion de la PrP C et PrP Sc est connu d&#39;associer une transition conformationnelle de α-hélicoïdale de β-feuille structures de la protéine. Cependant, la voie en vivo est encore mal comprise. Une tentative endogène PrP Sc, intermédiaire PrP * ou «prion silencieuse», n&#39;a pas encore été identifié dans le cerveau infecté 7. En utilisant une combinaison d&#39;approches biophysiques et biochimiques, nous avons identifié insolubles PrP C (agrégats désigné IPRP C) à partir de cerveau des mammifères non infectés et mis en culture neuronale8, 9 cellules. Ici, nous décrivons les procédures détaillées de ces méthodes, y compris ultracentrifugation dans un tampon de détergent, de la sédimentation sur gradient de saccharose étape, chromatographie d&#39;exclusion stérique, l&#39;enrichissement IPRP par la protéine du gène 5 (G5p) qui se lient spécifiquement à des formes de PrP structurellement modifiés 10 et PK-traitement. La combinaison de ces approches isole non seulement insoluble PrP Sc et agrégats de PrP C, mais aussi solubles PrP C oligomères du cerveau humain normal. Étant donné que les protocoles décrits ici ont été utilisés pour isoler les deux PrP Sc de cerveaux infectés et le RPIB C à partir de cerveaux sains, ils nous donnent l&#39;occasion de comparer les différences dans les caractéristiques physico-chimiques, neurotoxicité, et l&#39;infectivité entre les deux isoformes. Une telle étude permettra d&#39;améliorer grandement notre compréhension des agents pathogènes infectieux protéiniques. La physiologie et la physiopathologie des IPRP C ne sont pas claires à l&#39;heure actuelle. Notamment, dans un nouveau-identified maladies humaines à prion appelée variable sensible à une protéase prionopathy, nous avons trouvé une nouvelle PrP Sc qui partage le comportement immunologique et la fragmentation des IPRP C 11, 12. En outre, nous avons récemment démontré que IPRP C est la principale espèce qui interagit avec la protéine amyloïde β-dans la maladie d&#39;Alzheimer 13. Dans la même étude, ces méthodes ont été utilisées pour isoler des agrégats et des oligomères Abeta dans la maladie d&#39;Alzheimer 13, ce qui suggère leur application aux agrégats de protéines prion non impliqués dans d&#39;autres maladies neurodégénératives.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Soluble and Insoluble PrP Oligomers in the Normal Human Brain at JoVE.com

Isolation of Soluble and Insoluble PrP Oligomers in the Normal Human Brain

Une nouvelle espèce de protéine prion cellulaire (PrP<sup&gt; C</sup&gt;) A été récemment identifié dans les cerveaux humains non infectés en utilisant les méthodes décrites ici. Ces méthodes peuvent être utilisées pour isoler des espèces différentes PrP, alors que certains d&#39;entre eux sont également utile pour isoler des agrégats de protéines mal repliées autres à partir de cerveaux humains.

Isolement des oligomères de PrP solubles et insolubles dans le cerveau humain normal

The central event in the pathogenesis of prion diseases involves a conversion of the host-encoded cellular prion protein PrPC into its pathogenic isoform ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Identification and Isolation of Slow-Dividing Cells in Human Glioblastoma Using Carboxy Fluorescein Succinimidyl Ester (CFSE)

Identification and Isolation of Slow-Dividing Cells in Human Glioblastoma Using Carboxy Fluorescein Succinimidyl Ester CFSE

Identification et isolement des cellules ne se divisant lentement dans le glioblastome humain Utilisation carboxy fluorescéine succinimidyl ester (CFSE)

Tumor heterogeneity represents a fundamental feature supporting tumor robustness and presents a central obstacle to the development of therapeutic ...

Recherche

Médecine

The Use of Primary Human Fibroblasts for Monitoring Mitochondrial Phenotypes in the Field of Parkinson's Disease

L&#39;utilisation de fibroblastes humains primaires pour la surveillance des phénotypes mitochondriales dans le domaine de la maladie de Parkinson

Parkinson's disease (PD) is the second most  common movement disorder and affects 1% of people over the age of 60 1. Because ageing is  the most important ...

Lesion Explorer: A Video-guided, Standardized Protocol for Accurate and Reliable MRI-derived Volumetrics in Alzheimer's Disease and Normal Elderly

Lésion Explorer: Un Protocole de vidéo-guidée standardisé pour Volumetrics IRM dérivées exactes et fiables dans la maladie d&#39;Alzheimer et normale personnes âgées

Obtaining in vivo human brain tissue volumetrics from MRI is often complicated by various technical and biological issues. These challenges are ...

In Vivo Optical Imaging of Brain Tumors and Arthritis Using Fluorescent SapC-DOPS Nanovesicles

In Vivo Optical Imaging of Brain Tumors and Arthritis Using Fluorescent SapC-DOPS Nanovesicles

In Vivo L&#39;imagerie optique de tumeurs cérébrales et l&#39;arthrite Utilisation fluorescent SAPC-DOPS nanovésicules

We describe a multi-angle rotational optical imaging (MAROI) system for in vivo monitoring of physiopathological processes labeled with a fluorescent ...

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

Excitotoxiques stimulation de Microslices cerveau comme un<em&gt; In vitro</em&gt; Modèle de l&#39;AVC

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As ...

Multi-electrode Array Recordings of Human Epileptic Postoperative Cortical Tissue

Multi-réseau d&#39;électrodes enregistrements des droits de l&#39;épilepsie post-opératoire corticale tissus

Epilepsy, affecting about 1% of the population, comprises a group of neurological disorders characterized by the periodic occurrence of seizures, which ...

Isolation, Cryopreservation and Culture of Human Amnion Epithelial Cells for Clinical Applications

Isolement, cryoconservation et de la culture des droits de cellules épithéliales Amnion pour des applications cliniques

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a ...

Isolation of Human Lymphatic Endothelial Cells by Multi-parameter Fluorescence-activated Cell Sorting

Isolement des cellules endothéliales humaines lymphatique par multi-paramètres fluorescence tri cellulaire activé

Lymphatic system disorders such as primary lymphedema, lymphatic malformations and lymphatic tumors are rare conditions that cause significant morbidity ...

Using Saccadometry with Deep Brain Stimulation to Study Normal and Pathological Brain Function

Utilisation de Saccadometry avec la stimulation cérébrale profonde pour l&#39;étude normale et pathologique fonction cérébrale

The oculomotor system involves a large number of brain areas including parts of the basal ganglia, and various neurodegenerative diseases including ...

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

Phosphore-31 Spectroscopie par résonance magnétique: un outil de mesure<em&gt; In Vivo</em&gt; Capacité mitochondrial phosphorylation oxydative dans le muscle squelettique humain

Skeletal muscle mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) capacity, which is critically important in health and disease, can be measured in vivo ...