Name: isolation of soluble and insoluble prp oligomers in the normal human brain
Uploaded: 2012-10-03T12:00:00
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Die Autoren danken dem menschlichen Gehirn und Rückenmarksflüssigkeit Resource Center (Los Angeles, CA) für die Bereitstellung von normalen Gehirn Muster. Diese Studie wurde von den National Institutes of Health (NIH) R01NS062787, der CJD-Stiftung, Alliance biologisch sicher, sowie die University Center on Aging und Gesundheit mit Unterstützung der McGregor-Stiftung und des Präsidenten Discretionary Fund (Case Western Reserve University) unterstützt .

Ein. Vorbereitung der Hirnhomogenat und Waschmittel-Soluble (S2) und-unlöslich (P2) Fraktionen <ol><li> Nehmen 100 mg gefrorenes menschliches Gehirngewebe und 100 ul Lysepuffer (10 mM Tris, 150 mM NaCl, 0,5% Nonidet P-40 (NP-40), 0,5% EDTA, pH 7,4). </li><li> Homogenisieren auf Eis mit Pistill durch ein schnurloses angetrieben, frieren sie in Trockeneis für 5 min und homogenisieren Sie es erneut mit Pistill durch die Hände und dann durch einen Motor angetrieben, und 300 ul oder 800 ul Lysepuffer (dies ist entweder ...

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	<li>Prusiner, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prions.+Proc.">Prions. Proc.</a> Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 13363-13383 (1998).</li><li>Oesch, B., Westaway, D., W&#228;lchli, M., McKinley, M. P., Kent, S. B. H., Aebersold, R., Barry, R. A., Tempst, P., Teplow, D. B., Hood, L. E., Prusiner, S. B., Weissmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cellular+gene+encodes+scrapie+PrP+27-30+protein.">A cellular gene encodes scrapie PrP 27-30 protein.</a> Cell. 40, 735-746 (1985).</li><li>Bolton, D. C., McKinley, M. P., Prusiner, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+protein+that+purifies+with+the+scrapie+prion.">Identification of a protein that purifies with the scrapie prion.</a> Science. 218, 1309-1311 (1982).</li><li>Prusiner, S. B., McKinley, M. P., Bowman, K. A., Bolton, D. C., Bendheim, P. E., Groth, D. F., Glenner, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scrapie+prions+aggregate+to+form+amyloid-like+birefringent+rods.">Scrapie prions aggregate to form amyloid-like birefringent rods.</a> Cell. 35, 349-358 (1983).</li><li>Hope, J., Morton, L. J., Farquhar, C. F., Multhaup, G., Beyreuther, K., Kimberlin, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+major+polypeptide+of+scrapie-associated+fibrils+(SAF)+has+the+same+size,+charge+distribution+and+N-terminal+protein+sequence+as+predicted+for+the+normal+brain+protein+(PrP).">The major polypeptide of scrapie-associated fibrils (SAF) has the same size, charge distribution and N-terminal protein sequence as predicted for the normal brain protein (PrP).</a> EMBO J. 5, 2591-2597 (1986).</li><li>Prusiner, S. B., Groth, D. F., Bolton, D. C., Kent, S. B., Hood, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+structural+studies+of+a+major+scrapie+prion+protein.">Purification and structural studies of a major scrapie prion protein.</a> Cell. 38, 127-134 (1984).</li><li>Hall, D., Edskes, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silent+prions+lying+in+wait:+a+two-hit+model+of+prion/amyloid+formation+and+infection.">Silent prions lying in wait: a two-hit model of prion/amyloid formation and infection.</a> J. Mol. Biol. 336, 775-786 (2004).</li><li>Yuan, J., Xiao, X., McGeehan, J., Dong, Z., Cali, I., Fujioka, H., Kong, Q., Kneale, G., Gambetti, P., Zou, W. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insoluble+aggregates+and+protease-resistant+conformers+of+prion+protein+in+uninfected+human+brains.">Insoluble aggregates and protease-resistant conformers of prion protein in uninfected human brains.</a> J. Biol. Chem. 281, 34848-34858 (2006).</li><li>Yuan, J., Dong, Z., Guo, J. P., McGeehan, J., Xiao, X., Wang, J., Cali, I., McGeer, P. L., Cashman, N. R., Bessen, R., Surewicz, W. K., Kneale, G., Petersen, R. B., Gambetti, P., Zou, W. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accessibility+of+a+critical+prion+protein+region+involved+in+strain+recognition+and+its+implications+for+the+early+detection+of+prions.">Accessibility of a critical prion protein region involved in strain recognition and its implications for the early detection of prions.</a> Cell. Mol. Life Sci. 65, 631-643 (2008).</li><li>Zou, W. Q., Zheng, J., Gray, D. M., Gambetti, P., Chen, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+to+DNA+detects+scrapie+but+not+normal+prion+protein.">Antibody to DNA detects scrapie but not normal prion protein.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 1380-1385 (2004).</li><li>Gambetti, P., Dong, Z., Yuan, J., Xiao, X., Zheng, M., Alshekhlee, A., Castellani, R., Cohen, M., Barria, M. A., Gonzalez-Romero, D., Belay, E. D., Schonberger, L. B., Marder, K., Harris, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+human+disease+with+abnormal+prion+protein+sensitive+to+protease.">A novel human disease with abnormal prion protein sensitive to protease.</a> Ann. Neurol. 63, 697-708 (2008).</li><li>Zou, W. Q., Puoti, G., Xiao, X., Yuan, J., Qing, L., Cali, I., Shimoji, M., Langeveld, J. P., Castellani, R., Notari, S., Crain, B., Schmidt, R. E., Geschwind, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variably+protease-sensitive+prionopathy:+A+new+sporadic+disease+of+the+prion+protein.">Variably protease-sensitive prionopathy: A new sporadic disease of the prion protein.</a> Ann. Neurol. 68, 162-172 (2010).</li><li>Zou, W. Q., Xiao, X., Yuan, J., Puoti, G., Fujioka, H., Wang, X., Richardson, S., Zhou, X., Zou, R., Li, S., Zhu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid-beta42+interacts+mainly+with+insoluble+prion+protein+in+the+Alzheimer+brain.">Amyloid-beta42 interacts mainly with insoluble prion protein in the Alzheimer brain.</a> J. Biol. Chem. 286, 15095-15105 (2011).</li><li>Zou, W. Q., Colucci, M., Gambetti, P., Chen, S. G., Potter, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+prion+proteins.">Characterization of prion proteins.</a> Methods in Molecular Biology-Neurogenetics: Methods and Protocols. , 305-314 (2002).</li><li>Tzaban, S., Friedlander, G., Schonberger, O., Horonchik, L., Yedidia, Y., Shaked, G., Gabizon, R., Taraboulos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protease-sensitive+scrapie+prion+protein+in+aggregates+of+heterogeneous+sizes.">Protease-sensitive scrapie prion protein in aggregates of heterogeneous sizes.</a> Biochemistry. 41, 12868-12875 (2002).</li></ol>

Die Kombination von Ansätzen über die hier berichtet isoliert konsequent unlöslichen PrP C Aggregate und löslichen PrP C Oligomere aus dem normalen menschlichen Gehirns. Ultrazentrifugation bei 100.000 × g für eine Stunde ist eine klassische Methode, die in großem Maße für die Trennung der unlöslichen PrP Sc von der löslichen PrP C 14 verwendet. Während es effizient ist, eine der Verwarnung ist, um eine Verunreinigung während des Ziehens den Überstand (S2) nach d...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare (optional) </td></tr><tr><td> Phenylmethylsulfonylfluorid </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P7626 </td><td> 72 mM in 2-Propanol </td></tr><tr><td> Proteinase K </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P2308 </td><td> 2 mg / ml in H 2 O </td></tr><tr><td> PNGase F </td><td> New England Biolabs </td><td> MWGF200 </td><td></td></tr><tr><td> Ultrazentrifuge LE-80K, SW55 Rotor </td><td> Beckman Coulter </td><td> Art.-Nr. 365668, 356860 </td><td></td></tr><tr><td> Superdex 200 HR Kügelchen </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-1088-01 </td><td></td></tr><tr><td> AKTA FPLC-System </td><td> GE Healthcare </td><td> 18-1900-26 </td><td></td></tr><tr><td> Molekulargewichtsmarker </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> MWGF200 </td><td> Variiert </td></tr><tr><td> Dynabeads M-280 Magnetkügelchen </td><td> Invitrogen </td><td> 143-01 </td><td></td></tr><tr><td> 3F4 Antikörper </td><td> Covance </td><td> SIG-39600 </td><td></td></tr><tr><td> 1E4-Antikörper </td><td> Cell Sciences </td><td> M1840 </td><td></td></tr><tr><td> Gel bereit 15% Tris-HCl vorgegossenen Gelen </td><td> Bio-Rad </td><td> 345-0020 </td><td></td></tr></tbody></table>

isolation of soluble and insoluble prp oligomers in the normal human brain

Das zentrale Ereignis in der Pathogenese von Prion-Erkrankungen umfasst eine Umwandlung des Host-kodierten zellulären Prionen-Proteins PrP C in seine pathogene Isoform PrP Sc ein. PrP C ist Detergenz-löslichen und empfindlich gegenüber Proteinase K (PK)-Verdau, während PrP Sc bildet Detergens-unlöslichen Aggregaten und ist teilweise resistent gegen PK 2-6. Die Umwandlung von PrP C zu PrP Sc ist bekannt, einen Konformationswechsel α-Helix zu β-Faltblatt-Strukturen des Proteins beinhalten. Jedoch ist die in vivo-Weg noch wenig verstanden. Eine vorläufige endogenen PrP Sc-, Zwischen-PrP * oder &quot;silent Prion&quot;, muss noch in der nicht infizierten Gehirn 7 identifiziert werden. Mit einer Kombination von biophysikalischen und biochemischen Ansätzen haben wir festgestellt, unlösliche PrP C Aggregate (benannt IPRP C) von nicht infizierten Säugetieren Gehirn und kultivierten neuronalenZellen 8, 9. Hier beschreiben wir detaillierter Verfahren dieser Methoden, einschließlich Ultrazentrifugation in Detergenspuffer, Saccharose Stufengradienten Sedimentation, Größenausschlusschromatographie, IPRP Anreicherung durch Gen-5-Protein (g5p), die spezifisch an PrP strukturell veränderten Formen 10 und PK-Behandlung. Die Kombination dieser Ansätze isoliert nicht nur unlösliche PrP Sc und PrP C Aggregate aber auch lösliche Oligomere PrP C von der normalen menschlichen Gehirns. Da die Protokolle hier beschrieben wurden verwendet, um sowohl PrP Sc aus infizierten Gehirnen und IPRP C von nicht infizierten Gehirn zu isolieren, geben sie uns die Möglichkeit, Unterschiede in der physikalisch-chemischen Eigenschaften, Neurotoxizität und Infektiosität zwischen den beiden Isoformen zu vergleichen. Eine solche Studie wird deutlich verbessern unser Verständnis der infektiösen proteinhaltigen Krankheitserreger. Die Physiologie und Pathophysiologie der IPRP C sind derzeit unklar. Insbesondere in einem neu-identified menschlichen Prion-Erkrankung bezeichnet variabel Protease-sensitive prionopathy, fanden wir ein neues PrP Sc, die immunreaktiven Verhalten und Fragmentierung mit IPRP C 11, 12 Aktien. Darüber hinaus haben wir kürzlich gezeigt, dass IPRP C die wichtigsten Arten, die mit Amyloid-β-Protein in Alzheimer-Krankheit 13 zusammenwirkt. In derselben Studie wurden diese Methoden zur Abeta Aggregate und Oligomere in Alzheimer 13 isolieren, was nahelegt, deren Anwendung auf nicht-Prionprotein Aggregate in anderen neurodegenerativen Erkrankungen involviert.

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Isolation of Soluble and Insoluble PrP Oligomers in the Normal Human Brain

Eine neue Art der zellulären Prion-Protein (PrP<sup&gt; C</sup&gt;) Wurde kürzlich in infizierten menschlichen Gehirnen mit den hier beschriebenen Methoden identifiziert worden. Diese Methoden können verwendet werden, um verschiedene PrP-Spezies zu isolieren, während einige von ihnen sind auch nützlich, um anderen fehlgefalteten Proteinaggregate aus menschlichen Gehirnen.

Isolierung von löslicher und unlöslicher PrP Oligomere in das normale menschliche Gehirn

The central event in the pathogenesis of prion diseases involves a conversion of the host-encoded cellular prion protein PrPC into its pathogenic isoform ...

Research

JoVE Journal

Medicine

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