Name: isolation of soluble and insoluble prp oligomers in the normal human brain
Uploaded: 2012-10-03T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Soluble and Insoluble PrP Oligomers in the Normal Human Brain at JoVE.com

מחברים מודים למוח האנושי ומרכז משאבי נוזל שדרה (לוס אנג&#39;לס, קליפורניה) למתן דגימות מוח נורמליות. מחקר זה נתמך על ידי המכון הלאומי לבריאות (NIH) R01NS062787, CJD קרן אליאנס BioSecure, כמו גם את המרכז האוניברסיטאי להזדקנות ובריאות בתמיכת מקגרגור הקרן והקרן לפי שיקול הדעת של הנשיא (אוניברסיטת Case Western Reserve) .

1. הכנת Homogenate המוח ושברים מסיסים דטרגנט-(S2) ובלתי מסיסים (P2) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח 100 מ&quot;ג רקמה קפוא מוח אנושית ולהוסיף חיץ תמוגה 100 μl (10 mM טריס, 150 mM NaCl, 0.5% Nonidet P-40 (NP-40), 0.5% EDTA, 7.4 pH). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הומוגני זה על קרח באמצעות עלי מונע ...

<ol>
	<li>Prusiner, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prions.+Proc.">Prions. Proc.</a> Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 13363-13383 (1998).</li><li>Oesch, B., Westaway, D., W&#228;lchli, M., McKinley, M. P., Kent, S. B. H., Aebersold, R., Barry, R. A., Tempst, P., Teplow, D. B., Hood, L. E., Prusiner, S. B., Weissmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cellular+gene+encodes+scrapie+PrP+27-30+protein.">A cellular gene encodes scrapie PrP 27-30 protein.</a> Cell. 40, 735-746 (1985).</li><li>Bolton, D. C., McKinley, M. P., Prusiner, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+protein+that+purifies+with+the+scrapie+prion.">Identification of a protein that purifies with the scrapie prion.</a> Science. 218, 1309-1311 (1982).</li><li>Prusiner, S. B., McKinley, M. P., Bowman, K. A., Bolton, D. C., Bendheim, P. E., Groth, D. F., Glenner, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scrapie+prions+aggregate+to+form+amyloid-like+birefringent+rods.">Scrapie prions aggregate to form amyloid-like birefringent rods.</a> Cell. 35, 349-358 (1983).</li><li>Hope, J., Morton, L. J., Farquhar, C. F., Multhaup, G., Beyreuther, K., Kimberlin, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+major+polypeptide+of+scrapie-associated+fibrils+(SAF)+has+the+same+size,+charge+distribution+and+N-terminal+protein+sequence+as+predicted+for+the+normal+brain+protein+(PrP).">The major polypeptide of scrapie-associated fibrils (SAF) has the same size, charge distribution and N-terminal protein sequence as predicted for the normal brain protein (PrP).</a> EMBO J. 5, 2591-2597 (1986).</li><li>Prusiner, S. B., Groth, D. F., Bolton, D. C., Kent, S. B., Hood, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+structural+studies+of+a+major+scrapie+prion+protein.">Purification and structural studies of a major scrapie prion protein.</a> Cell. 38, 127-134 (1984).</li><li>Hall, D., Edskes, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silent+prions+lying+in+wait:+a+two-hit+model+of+prion/amyloid+formation+and+infection.">Silent prions lying in wait: a two-hit model of prion/amyloid formation and infection.</a> J. Mol. Biol. 336, 775-786 (2004).</li><li>Yuan, J., Xiao, X., McGeehan, J., Dong, Z., Cali, I., Fujioka, H., Kong, Q., Kneale, G., Gambetti, P., Zou, W. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insoluble+aggregates+and+protease-resistant+conformers+of+prion+protein+in+uninfected+human+brains.">Insoluble aggregates and protease-resistant conformers of prion protein in uninfected human brains.</a> J. Biol. Chem. 281, 34848-34858 (2006).</li><li>Yuan, J., Dong, Z., Guo, J. P., McGeehan, J., Xiao, X., Wang, J., Cali, I., McGeer, P. L., Cashman, N. R., Bessen, R., Surewicz, W. K., Kneale, G., Petersen, R. B., Gambetti, P., Zou, W. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accessibility+of+a+critical+prion+protein+region+involved+in+strain+recognition+and+its+implications+for+the+early+detection+of+prions.">Accessibility of a critical prion protein region involved in strain recognition and its implications for the early detection of prions.</a> Cell. Mol. Life Sci. 65, 631-643 (2008).</li><li>Zou, W. Q., Zheng, J., Gray, D. M., Gambetti, P., Chen, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+to+DNA+detects+scrapie+but+not+normal+prion+protein.">Antibody to DNA detects scrapie but not normal prion protein.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 1380-1385 (2004).</li><li>Gambetti, P., Dong, Z., Yuan, J., Xiao, X., Zheng, M., Alshekhlee, A., Castellani, R., Cohen, M., Barria, M. A., Gonzalez-Romero, D., Belay, E. D., Schonberger, L. B., Marder, K., Harris, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+human+disease+with+abnormal+prion+protein+sensitive+to+protease.">A novel human disease with abnormal prion protein sensitive to protease.</a> Ann. Neurol. 63, 697-708 (2008).</li><li>Zou, W. Q., Puoti, G., Xiao, X., Yuan, J., Qing, L., Cali, I., Shimoji, M., Langeveld, J. P., Castellani, R., Notari, S., Crain, B., Schmidt, R. E., Geschwind, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variably+protease-sensitive+prionopathy:+A+new+sporadic+disease+of+the+prion+protein.">Variably protease-sensitive prionopathy: A new sporadic disease of the prion protein.</a> Ann. Neurol. 68, 162-172 (2010).</li><li>Zou, W. Q., Xiao, X., Yuan, J., Puoti, G., Fujioka, H., Wang, X., Richardson, S., Zhou, X., Zou, R., Li, S., Zhu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid-beta42+interacts+mainly+with+insoluble+prion+protein+in+the+Alzheimer+brain.">Amyloid-beta42 interacts mainly with insoluble prion protein in the Alzheimer brain.</a> J. Biol. Chem. 286, 15095-15105 (2011).</li><li>Zou, W. Q., Colucci, M., Gambetti, P., Chen, S. G., Potter, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+prion+proteins.">Characterization of prion proteins.</a> Methods in Molecular Biology-Neurogenetics: Methods and Protocols. , 305-314 (2002).</li><li>Tzaban, S., Friedlander, G., Schonberger, O., Horonchik, L., Yedidia, Y., Shaked, G., Gabizon, R., Taraboulos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protease-sensitive+scrapie+prion+protein+in+aggregates+of+heterogeneous+sizes.">Protease-sensitive scrapie prion protein in aggregates of heterogeneous sizes.</a> Biochemistry. 41, 12868-12875 (2002).</li></ol>

שילוב של גישות דיווח כאן מבודד אגרגטים עקביות מסיסים PRP C וoligomers המסיס PRP C מהמוח האנושי הרגיל. Ultracentrifugation ב100.000 XG במשך שעה אחת הוא שיטה קלסית שכבר בשימוש נרחב להפרדת PRP Sc המסיס מPRP C המסיס 14. אמנם זה יעיל, אחד הוא מזהיר כדי למנוע זיהום במהלך מו?...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם המגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td><td> תגובות (אופציונלי) </td></tr><tr><td> פלואוריד Phenylmethylsulfonyl </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> P7626 </td><td> 72 מ&quot;מ ב2-propanol </td></tr><tr><td> Proteinase K </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> P2308 </td><td> 2 מ&quot;ג / מ&quot;ל בH 2 O </td></tr><tr><td> PNGase F </td><td> ניו אינגלנד Biolabs </td><td> MWGF200 </td><td></td></tr><tr><td> Ultracentrifuge LE-80k, SW55 הרוטור </td><td> Beckman Coulter </td><td> חלק מס &#39;365668, 356860 </td><td></td></tr><tr><td> Superdex 200 חרוזי HR </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-1088-01 </td><td></td></tr><tr><td> תקטע FPLC מערכת </td><td> GE Healthcare </td><td> 18-1900-26 </td><td></td></tr><tr><td> סמני משקל מולקולריים </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> MWGF200 </td><td> מגוון </td></tr><tr><td> Dynabeads M-280 חרוזים מגנטיים </td><td> Invitrogen </td><td> 143-01 </td><td></td></tr><tr><td> נוגדן 3F4 </td><td> Covance </td><td> SIG-39600 </td><td></td></tr><tr><td> נוגדן 1E4 </td><td> מדעי התא </td><td> M1840 </td><td></td></tr><tr><td> ג&#39;ל המוכן 15% טריס-HCl ג&#39;לי טרומי </td><td> Bio-Rad </td><td> 345-0020 </td><td></td></tr></tbody></table>

isolation of soluble and insoluble prp oligomers in the normal human brain

האירוע המרכזי בפתוגנזה של מחלות Prion כרוך המרה של חלבון הפריון התאי PRP C מארח בקידוד לפתוגניים איזופורם PRP 1 Sc. PRP C היא מסיסה בחומרי ניקוי ורגיש לproteinase K (קי)-עיכול, ואילו PRP Sc יוצר אגרגטים חומרי ניקוי מסיסים ובחלקה עמידה לקי 2-6. המרה של PRP C כדי PRP Sc ידוע כרוכה מעבר קונפורמציה של סליל α למבני β מאזניות של החלבון. עם זאת, במסלול vivo הוא עדיין ממעטים להבין. אנדוגני PRP Sc מהוסס, * ביניים PRP או &quot;פריונים שקטים&quot;, טרם זוהה במוח הנגוע 7. באמצעות שילוב של גישות biophysical וביוכימיים, זיהו אגרגטים C מסיסים PRP (המיועד iPrP C) ממוח יונקים נגועים ותרבית עצביתתאים 8, 9. כאן, אנו מתארים את תהליכים מפורטים של שיטות אלה, כוללים ultracentrifugation במאגר חומרי ניקוי, שקיעה הדרגתית צעד סוכרוז, כרומטוגרפיה הדרת גודל, העשרת iPrP ב 5 חלבון הגן (g5p) כי דווקא להיקשר לצורות מבניות שינו PRP 10 ו-PK טיפול. שילוב של גישות אלה מבודד לא רק PRP PRP אגרגטים C oligomers C המסיס PRP מהמוח האנושי הרגיל Sc המסיס וגם. מאז את הפרוטוקולים מתוארים כאן שמשו לבודד שני PRP Sc ממוחות נגועים וiPrP C ממוחה נגוע, הם מספקים לנו הזדמנות להשוות הבדלים בתכונות physicochemical, רעילות עצבית, וinfectivity בין שני isoforms. מחקר כזה ישפר מאוד את ההבנה של פתוגנים חלבוניים זיהומיות שלנו. הפיסיולוגיה ופתופיזיולוגיה של iPrP C אינם ברורים כרגע. יש לציין, שבזה עתה idמחלות פריונים אנושיות entified כינו variably פרוטאז הרגיש prionopathy, מצא PRP Sc חדש שהוא בעל ההתנהגות ופיצול immunoreactive עם iPrP 11 ג, 12. יתר על כן, לאחרונה הראה כי iPrP C היא המינים העיקריים המקיימים אינטראקציה עם חלבון עמילואיד-β באלצהיימר 13. באותו המחקר, שיטות אלה שמשו לבודד אגרגטים וoligomers Abeta במחלת אלצהיימר 13, המצביע על היישום שלהם לאגרגטים חלבון אינם פריונים המעורבים בהפרעות ניווניות אחרות.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Soluble and Insoluble PrP Oligomers in the Normal Human Brain at JoVE.com

Isolation of Soluble and Insoluble PrP Oligomers in the Normal Human Brain

זן חדש של חלבון פריון תאי (PRP<sup&gt; C</sup&gt;) לאחרונה זוהה במוחות האנושיים נגועים באמצעות שיטות שתוארו כאן. שיטות אלה יכולים לשמש לבודד מיני PRP שונים, וחלק מהם שימושי גם בבידוד אגרגטים חלבון misfolded אחרים ממוחות אנושיים.

בידוד של oligomers PRP המסיס ובלתי מסיס במוח האנושי הרגיל

The central event in the pathogenesis of prion diseases involves a conversion of the host-encoded cellular prion protein PrPC into its pathogenic isoform ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Identification and Isolation of Slow-Dividing Cells in Human Glioblastoma Using Carboxy Fluorescein Succinimidyl Ester (CFSE)

Identification and Isolation of Slow-Dividing Cells in Human Glioblastoma Using Carboxy Fluorescein Succinimidyl Ester CFSE

זיהוי ובידוד של תאים מתחלקים לאט בGlioblastoma האנושי באמצעות Carboxy fluorescein Succinimidyl אסתר (CFSE)

Tumor heterogeneity represents a fundamental feature supporting tumor robustness and presents a central obstacle to the development of therapeutic ...

The Use of Primary Human Fibroblasts for Monitoring Mitochondrial Phenotypes in the Field of Parkinson's Disease

השימוש בפיברובלסטים אנושיים ראשוניים לניטור פנוטיפים מיטוכונדריאלי בתחום מחלת פרקינסון

Parkinson's disease (PD) is the second most  common movement disorder and affects 1% of people over the age of 60 1. Because ageing is  the most important ...

Lesion Explorer: A Video-guided, Standardized Protocol for Accurate and Reliable MRI-derived Volumetrics in Alzheimer's Disease and Normal Elderly

הנגע Explorer: מודרך וידאו, סטנדרטי פרוטוקול Volumetrics מדויק ואמין הנגזר-MRI במחלה אלצהיימר וקשישים רגיל

Obtaining in vivo human brain tissue volumetrics from MRI is often complicated by various technical and biological issues. These challenges are ...

In Vivo Optical Imaging of Brain Tumors and Arthritis Using Fluorescent SapC-DOPS Nanovesicles

In Vivo Optical Imaging of Brain Tumors and Arthritis Using Fluorescent SapC-DOPS Nanovesicles

בדימות אופטי Vivo של גידולים במוח ודלקת פרקים באמצעות פלורסנט SapC-DOPS nanovesicles

We describe a multi-angle rotational optical imaging (MAROI) system for in vivo monitoring of physiopathological processes labeled with a fluorescent ...

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

הפעלת יתר רעיל גירוי של המוח כMicroslices<em&gt; במבחנה</em&gt; דגם של שבץ

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As ...

Multi-electrode Array Recordings of Human Epileptic Postoperative Cortical Tissue

הקלטות מערך רב-אלקטרודה של רקמה האנושית אפילפטיים לאחר הניתוח בקליפת המוח

Epilepsy, affecting about 1% of the population, comprises a group of neurological disorders characterized by the periodic occurrence of seizures, which ...

Isolation, Cryopreservation and Culture of Human Amnion Epithelial Cells for Clinical Applications

בידוד, Cryopreservation ותרבות של תאי אפיתל amnion אדם ליישומים קליניים

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a ...

Isolation of Human Lymphatic Endothelial Cells by Multi-parameter Fluorescence-activated Cell Sorting

בידוד של תאי האנדותל אדם הלימפה על ידי מיון תא הקרינה המופעל Multi-פרמטר

Lymphatic system disorders such as primary lymphedema, lymphatic malformations and lymphatic tumors are rare conditions that cause significant morbidity ...

Using Saccadometry with Deep Brain Stimulation to Study Normal and Pathological Brain Function

שימוש Saccadometry עם דיפ גירוי המוח לחקר תפקוד מוח נורמלי ופתולוגיים

The oculomotor system involves a large number of brain areas including parts of the basal ganglia, and various neurodegenerative diseases including ...

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

זרחן-31 ספקטרוסקופיה תהודה מגנטית: כלי למדידת<em&gt; In vivo</em&gt; קיבולת זרחון חמצוני מיטוכונדריאלי של שריר שלד אדם

Skeletal muscle mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) capacity, which is critically important in health and disease, can be measured in vivo ...