Name: isolation of soluble and insoluble prp oligomers in the normal human brain
Uploaded: 2012-10-03T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Soluble and Insoluble PrP Oligomers in the Normal Human Brain at JoVE.com

ザ 著者らは、正常な脳のサンプルを提供するための人間の脳と脊髄液リソースセンター（ロサンゼルス、カリフォルニア州）に感謝しています。この研究は、マクレガー財団の支援や、大統領の裁量基金（ケース·ウェスタン·リザーブ大学）と米国立衛生研究所（NIH）R01NS062787、CJD財団、アライアンスBioSecure、ならびに大学の老化センターと健康によってサポートされていました。

1。脳ホモジネートおよび（S2）界面活性剤可溶性と不溶性（P2）の画分の調製<ol><li> 100mgの凍結ヒト脳組織を取り、100μlの溶解緩衝液（10mMトリス、150mMのNaCl、0.5％ノニデットP-40（NP-40）、0.5％のEDTA、pH7.4）を追加します。 </li><li>コー​​ドレスモータにより駆動乳棒を用いて氷上でホモジナイズし、これはどちらか20で5分間ドライアイスでそれを凍結し、モータによって最初にして、手に?...

<ol>
	<li>Prusiner, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prions.+Proc.">Prions. Proc.</a> Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 13363-13383 (1998).</li><li>Oesch, B., Westaway, D., W&#228;lchli, M., McKinley, M. P., Kent, S. B. H., Aebersold, R., Barry, R. A., Tempst, P., Teplow, D. B., Hood, L. E., Prusiner, S. B., Weissmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cellular+gene+encodes+scrapie+PrP+27-30+protein.">A cellular gene encodes scrapie PrP 27-30 protein.</a> Cell. 40, 735-746 (1985).</li><li>Bolton, D. C., McKinley, M. P., Prusiner, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+protein+that+purifies+with+the+scrapie+prion.">Identification of a protein that purifies with the scrapie prion.</a> Science. 218, 1309-1311 (1982).</li><li>Prusiner, S. B., McKinley, M. P., Bowman, K. A., Bolton, D. C., Bendheim, P. E., Groth, D. F., Glenner, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scrapie+prions+aggregate+to+form+amyloid-like+birefringent+rods.">Scrapie prions aggregate to form amyloid-like birefringent rods.</a> Cell. 35, 349-358 (1983).</li><li>Hope, J., Morton, L. J., Farquhar, C. F., Multhaup, G., Beyreuther, K., Kimberlin, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+major+polypeptide+of+scrapie-associated+fibrils+(SAF)+has+the+same+size,+charge+distribution+and+N-terminal+protein+sequence+as+predicted+for+the+normal+brain+protein+(PrP).">The major polypeptide of scrapie-associated fibrils (SAF) has the same size, charge distribution and N-terminal protein sequence as predicted for the normal brain protein (PrP).</a> EMBO J. 5, 2591-2597 (1986).</li><li>Prusiner, S. B., Groth, D. F., Bolton, D. C., Kent, S. B., Hood, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+structural+studies+of+a+major+scrapie+prion+protein.">Purification and structural studies of a major scrapie prion protein.</a> Cell. 38, 127-134 (1984).</li><li>Hall, D., Edskes, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silent+prions+lying+in+wait:+a+two-hit+model+of+prion/amyloid+formation+and+infection.">Silent prions lying in wait: a two-hit model of prion/amyloid formation and infection.</a> J. Mol. Biol. 336, 775-786 (2004).</li><li>Yuan, J., Xiao, X., McGeehan, J., Dong, Z., Cali, I., Fujioka, H., Kong, Q., Kneale, G., Gambetti, P., Zou, W. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insoluble+aggregates+and+protease-resistant+conformers+of+prion+protein+in+uninfected+human+brains.">Insoluble aggregates and protease-resistant conformers of prion protein in uninfected human brains.</a> J. Biol. Chem. 281, 34848-34858 (2006).</li><li>Yuan, J., Dong, Z., Guo, J. P., McGeehan, J., Xiao, X., Wang, J., Cali, I., McGeer, P. L., Cashman, N. R., Bessen, R., Surewicz, W. K., Kneale, G., Petersen, R. B., Gambetti, P., Zou, W. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accessibility+of+a+critical+prion+protein+region+involved+in+strain+recognition+and+its+implications+for+the+early+detection+of+prions.">Accessibility of a critical prion protein region involved in strain recognition and its implications for the early detection of prions.</a> Cell. Mol. Life Sci. 65, 631-643 (2008).</li><li>Zou, W. Q., Zheng, J., Gray, D. M., Gambetti, P., Chen, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+to+DNA+detects+scrapie+but+not+normal+prion+protein.">Antibody to DNA detects scrapie but not normal prion protein.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 1380-1385 (2004).</li><li>Gambetti, P., Dong, Z., Yuan, J., Xiao, X., Zheng, M., Alshekhlee, A., Castellani, R., Cohen, M., Barria, M. A., Gonzalez-Romero, D., Belay, E. D., Schonberger, L. B., Marder, K., Harris, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+human+disease+with+abnormal+prion+protein+sensitive+to+protease.">A novel human disease with abnormal prion protein sensitive to protease.</a> Ann. Neurol. 63, 697-708 (2008).</li><li>Zou, W. Q., Puoti, G., Xiao, X., Yuan, J., Qing, L., Cali, I., Shimoji, M., Langeveld, J. P., Castellani, R., Notari, S., Crain, B., Schmidt, R. E., Geschwind, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variably+protease-sensitive+prionopathy:+A+new+sporadic+disease+of+the+prion+protein.">Variably protease-sensitive prionopathy: A new sporadic disease of the prion protein.</a> Ann. Neurol. 68, 162-172 (2010).</li><li>Zou, W. Q., Xiao, X., Yuan, J., Puoti, G., Fujioka, H., Wang, X., Richardson, S., Zhou, X., Zou, R., Li, S., Zhu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid-beta42+interacts+mainly+with+insoluble+prion+protein+in+the+Alzheimer+brain.">Amyloid-beta42 interacts mainly with insoluble prion protein in the Alzheimer brain.</a> J. Biol. Chem. 286, 15095-15105 (2011).</li><li>Zou, W. Q., Colucci, M., Gambetti, P., Chen, S. G., Potter, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+prion+proteins.">Characterization of prion proteins.</a> Methods in Molecular Biology-Neurogenetics: Methods and Protocols. , 305-314 (2002).</li><li>Tzaban, S., Friedlander, G., Schonberger, O., Horonchik, L., Yedidia, Y., Shaked, G., Gabizon, R., Taraboulos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protease-sensitive+scrapie+prion+protein+in+aggregates+of+heterogeneous+sizes.">Protease-sensitive scrapie prion protein in aggregates of heterogeneous sizes.</a> Biochemistry. 41, 12868-12875 (2002).</li></ol>

ここで報告アプローチの組み合わせは、通常の人間の脳から一貫して不溶性のPrP Cの集合体と水溶性のPrP Cのオリゴマーを分離します。 1時間100,000×gで遠心分離は広く水溶性PrP Cが14から不溶性のPrP Scの分離のために使用されてきた古典的な方法です。それが効率的ですが、注意事項の一つは、遠心分離後の上澄み液（S2）を引っ張る時の汚染を避けるためです?...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント（オプション） </td></tr><tr><td>フッ化フェニルメチルスルホニル</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> P7626 </td><td> 2 - プロパノールで72 mMの</td></tr><tr><td>プロテイナーゼK </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> P2308 </td><td> H 2 O中の2 mg / mlの</td></tr><tr><td> PNGアーゼF </td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td> MWGF200 </td><td></td></tr><tr><td>超遠心のLE-80K、ローターSW55 </td><td>ベックマン·コールター</td><td>部品番号365668、356860 </td><td></td></tr><tr><td>たSuperdex 200 HRのビーズ</td><td> GEヘルスケア</td><td> 17-1088-01 </td><td></td></tr><tr><td> AKTA FPLCシステム</td><td> GEヘルスケア</td><td> 18-1900-26 </td><td></td></tr><tr><td>分子量マーカー</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> MWGF200 </td><td>多様な</td></tr><tr><td>ダイナビーズM-280磁気ビーズ</td><td>インビトロジェン</td><td> 143から01 </td><td></td></tr><tr><td> 3F4抗体</td><td> Covance </td><td> SIG-39600 </td><td></td></tr><tr><td> 1E4抗体</td><td>セルサイエンス</td><td> M1840 </td><td></td></tr><tr><td>レディゲル15パーセントのトリス-HClプレキャストゲル</td><td>バイオ·ラッド</td><td> 345-0020 </td><td></td></tr></tbody></table>

isolation of soluble and insoluble prp oligomers in the normal human brain

プリオン病の病因において中心的なイベントには、その病原性のイソ型の PrP Sc 1にホストでエンコードされた細胞プリオンタンパク質PrP Cをの変換を伴う。 PrP Sc は界面活性剤不溶性の凝集体を形成し、PKの2月6日に部分的に耐性であるのに対し、PrP Cのは 、界面活性剤可溶性およびプロテイナーゼK（PK）消化に敏感です。 PrP ScのためにPRP Cの変換はタンパク質のβシート構造へのα-ヘリックスの構造転移を伴うことが知られている。しかし、in vivo経路でまだよくわかっていない。暫定的な内因性のPrP Scは、中間のPrP *または&quot;サイレントプリオン&quot;は、感染していない脳7で特定されていない。 生物物理学的および生化学的なアプローチの組み合わせを使用して、我々は感染していない哺乳動物の脳や神経細胞培養から不溶性のPrP Cの集計（指定IPRP C）が同定されセル8,9。ここでは、洗剤液、スクロースステップ勾配沈降、サイズ排除クロマトグラフィー、具体的には、構造的に変更されたPrPのフォーム10とPK-治療にバインド遺伝子5タンパク質（g5p）によるIPRP濃縮度の超遠心分離を含め、これらの方法の詳細な手順を説明します。これらの方法の組み合わせで不溶性の PrP ScとPrP Cの集合体でなく、通常の人間の脳からの可溶性PrP Cのオリゴマーだけを分離します。ここに記載されているプロトコルは、感染していない脳から感染した脳からの PrP ScとIPRP Cの両方を分離するために使用されているので、それらは物理化学的特徴、神経毒性、そして二つのアイソフォーム間で感染性の違いを比較する機会を提供してくれる。そのような研究は大幅に感染性病原体のタンパク質性の我々の理解を向上させます。 IPRP Cの生理および病態生理学は、現時点では不明である。特に、新たに-idのentifiedヒトプリオン病はプロテアーゼ感受性prionopathy可変と呼ばれる、私たちはIPRP C 11、12と免疫反応挙動およびフラグメンテーションを共有する新しいPrP Sc を発見した。また、我々は最近、IPRP Cがアルツハイマー病13のアミロイドβタンパク質と相互作用する主要な種であることを実証した。同じ研究では、これらのメソッドは、他の神経変性疾患に関与する非プリオンタンパク質の凝集体への応用を示唆し、アルツハイマー病13安部田集合体およびオリゴマーを分離するために使用されていました。

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Soluble and Insoluble PrP Oligomers in the Normal Human Brain at JoVE.com

Isolation of Soluble and Insoluble PrP Oligomers in the Normal Human Brain

細胞プリオンタンパク質の新種（PRP<sup&gt; C</sup&gt;）は最近、ここで説明する方法を使用して、感染していない人間の脳で確認されています。そのうちのいくつかはまた、人間の脳から他のミスフォールドしたタンパク質凝集体を単離するのに有用であるが、これらの方法は、様々な種のPrPを単離することができる。

正常なヒト脳内の可溶性および不溶性のPrPオリゴマーの分離

The central event in the pathogenesis of prion diseases involves a conversion of the host-encoded cellular prion protein PrPC into its pathogenic isoform ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Identification and Isolation of Slow-Dividing Cells in Human Glioblastoma Using Carboxy Fluorescein Succinimidyl Ester (CFSE)

Identification and Isolation of Slow-Dividing Cells in Human Glioblastoma Using Carboxy Fluorescein Succinimidyl Ester CFSE

カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（CFSE）を用いてヒト神経膠芽腫のスロー非分裂細胞の同定および単離

Tumor heterogeneity represents a fundamental feature supporting tumor robustness and presents a central obstacle to the development of therapeutic ...

The Use of Primary Human Fibroblasts for Monitoring Mitochondrial Phenotypes in the Field of Parkinson's Disease

パーキンソン病の分野におけるミトコンドリアの表現型を監視するための主要ヒト線維芽細胞の使用

Parkinson's disease (PD) is the second most  common movement disorder and affects 1% of people over the age of 60 1. Because ageing is  the most important ...

Lesion Explorer: A Video-guided, Standardized Protocol for Accurate and Reliable MRI-derived Volumetrics in Alzheimer's Disease and Normal Elderly

病変エクスプローラ：アルツハイマー病における正確で信頼性のMRI誘導Volumetrics用ビデオガイド下、標準化されたプロトコルおよび標準高齢者

Obtaining in vivo human brain tissue volumetrics from MRI is often complicated by various technical and biological issues. These challenges are ...

In Vivo Optical Imaging of Brain Tumors and Arthritis Using Fluorescent SapC-DOPS Nanovesicles

In Vivo Optical Imaging of Brain Tumors and Arthritis Using Fluorescent SapC-DOPS Nanovesicles

蛍光SAPC-DOPSナノベシクルを用いて脳腫瘍、関節炎のin vivo光イメージング中

We describe a multi-angle rotational optical imaging (MAROI) system for in vivo monitoring of physiopathological processes labeled with a fluorescent ...

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

脳Microslicesの興奮毒性刺激<em&gt;インビトロ</em&gt;脳卒中のモデル

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As ...

Multi-electrode Array Recordings of Human Epileptic Postoperative Cortical Tissue

人間のてんかん術後皮質組織の多電極アレイ録音

Epilepsy, affecting about 1% of the population, comprises a group of neurological disorders characterized by the periodic occurrence of seizures, which ...

Isolation, Cryopreservation and Culture of Human Amnion Epithelial Cells for Clinical Applications

臨床応用のためのヒト羊膜上皮細胞の単離、凍結保存と文化

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a ...

Isolation of Human Lymphatic Endothelial Cells by Multi-parameter Fluorescence-activated Cell Sorting

マルチパラメータ蛍光活性化細胞選別によるヒトリンパ内皮細胞の単離

Lymphatic system disorders such as primary lymphedema, lymphatic malformations and lymphatic tumors are rare conditions that cause significant morbidity ...

Using Saccadometry with Deep Brain Stimulation to Study Normal and Pathological Brain Function

正常および病的脳機能を研究するために脳深部刺激でSaccadometryを使用します

The oculomotor system involves a large number of brain areas including parts of the basal ganglia, and various neurodegenerative diseases including ...

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

リン-31磁気共鳴分光法：測定するためのツール<em&gt;インビボ</emヒト骨格筋における&gt;ミトコンドリア酸化的リン酸化能力

Skeletal muscle mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) capacity, which is critically important in health and disease, can be measured in vivo ...