Name: isolation of soluble and insoluble prp oligomers in the normal human brain
Uploaded: 2012-10-03T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Soluble and Insoluble PrP Oligomers in the Normal Human Brain at JoVE.com

저자는 정상적인 뇌 샘플을 제공하는 인간의 뇌와 척수 리소스 센터 (로스 앤젤레스, CA)에 감사하고 있습니다. 이 연구는 McGregor 재단의 지원과 대통령의 잉여 자금 기금 (케이스 웨스턴 리저브 대학)과 국립 보건원 (NIH) R01NS062787, CJD 재단, 연합 BioSecure뿐만 아니라 대학 노화에 센터와 건강에 의해 지원되었다 .

1. 뇌 Homogenate 및 세제 용해 (S2)과 불용성 (P2) 분수의 작성 <ol><li> 100 MG 냉동 인간의 뇌 조직을 타고 (10 MM 트리스, 150 MM NaCl, 0.5 % Nonidet P-40 (NP-40), 0.5 % EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 산도 7.4) 100 μl 용해 버퍼를 추가합니다. </li><li> 무선 모터에 의해 구동 유봉을 사용하여 얼음에 균질화,이 중 20 5 분에 드라이 아이스에 고정하고 모터에 의해 먼저하고 손에 의해 구동 유봉을 사용하여 다시 균?...

<ol>
	<li>Prusiner, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prions.+Proc.">Prions. Proc.</a> Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 13363-13383 (1998).</li><li>Oesch, B., Westaway, D., W&#228;lchli, M., McKinley, M. P., Kent, S. B. H., Aebersold, R., Barry, R. A., Tempst, P., Teplow, D. B., Hood, L. E., Prusiner, S. B., Weissmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cellular+gene+encodes+scrapie+PrP+27-30+protein.">A cellular gene encodes scrapie PrP 27-30 protein.</a> Cell. 40, 735-746 (1985).</li><li>Bolton, D. C., McKinley, M. P., Prusiner, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+protein+that+purifies+with+the+scrapie+prion.">Identification of a protein that purifies with the scrapie prion.</a> Science. 218, 1309-1311 (1982).</li><li>Prusiner, S. B., McKinley, M. P., Bowman, K. A., Bolton, D. C., Bendheim, P. E., Groth, D. F., Glenner, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scrapie+prions+aggregate+to+form+amyloid-like+birefringent+rods.">Scrapie prions aggregate to form amyloid-like birefringent rods.</a> Cell. 35, 349-358 (1983).</li><li>Hope, J., Morton, L. J., Farquhar, C. F., Multhaup, G., Beyreuther, K., Kimberlin, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+major+polypeptide+of+scrapie-associated+fibrils+(SAF)+has+the+same+size,+charge+distribution+and+N-terminal+protein+sequence+as+predicted+for+the+normal+brain+protein+(PrP).">The major polypeptide of scrapie-associated fibrils (SAF) has the same size, charge distribution and N-terminal protein sequence as predicted for the normal brain protein (PrP).</a> EMBO J. 5, 2591-2597 (1986).</li><li>Prusiner, S. B., Groth, D. F., Bolton, D. C., Kent, S. B., Hood, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+structural+studies+of+a+major+scrapie+prion+protein.">Purification and structural studies of a major scrapie prion protein.</a> Cell. 38, 127-134 (1984).</li><li>Hall, D., Edskes, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silent+prions+lying+in+wait:+a+two-hit+model+of+prion/amyloid+formation+and+infection.">Silent prions lying in wait: a two-hit model of prion/amyloid formation and infection.</a> J. Mol. Biol. 336, 775-786 (2004).</li><li>Yuan, J., Xiao, X., McGeehan, J., Dong, Z., Cali, I., Fujioka, H., Kong, Q., Kneale, G., Gambetti, P., Zou, W. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insoluble+aggregates+and+protease-resistant+conformers+of+prion+protein+in+uninfected+human+brains.">Insoluble aggregates and protease-resistant conformers of prion protein in uninfected human brains.</a> J. Biol. Chem. 281, 34848-34858 (2006).</li><li>Yuan, J., Dong, Z., Guo, J. P., McGeehan, J., Xiao, X., Wang, J., Cali, I., McGeer, P. L., Cashman, N. R., Bessen, R., Surewicz, W. K., Kneale, G., Petersen, R. B., Gambetti, P., Zou, W. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accessibility+of+a+critical+prion+protein+region+involved+in+strain+recognition+and+its+implications+for+the+early+detection+of+prions.">Accessibility of a critical prion protein region involved in strain recognition and its implications for the early detection of prions.</a> Cell. Mol. Life Sci. 65, 631-643 (2008).</li><li>Zou, W. Q., Zheng, J., Gray, D. M., Gambetti, P., Chen, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+to+DNA+detects+scrapie+but+not+normal+prion+protein.">Antibody to DNA detects scrapie but not normal prion protein.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 1380-1385 (2004).</li><li>Gambetti, P., Dong, Z., Yuan, J., Xiao, X., Zheng, M., Alshekhlee, A., Castellani, R., Cohen, M., Barria, M. A., Gonzalez-Romero, D., Belay, E. D., Schonberger, L. B., Marder, K., Harris, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+human+disease+with+abnormal+prion+protein+sensitive+to+protease.">A novel human disease with abnormal prion protein sensitive to protease.</a> Ann. Neurol. 63, 697-708 (2008).</li><li>Zou, W. Q., Puoti, G., Xiao, X., Yuan, J., Qing, L., Cali, I., Shimoji, M., Langeveld, J. P., Castellani, R., Notari, S., Crain, B., Schmidt, R. E., Geschwind, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variably+protease-sensitive+prionopathy:+A+new+sporadic+disease+of+the+prion+protein.">Variably protease-sensitive prionopathy: A new sporadic disease of the prion protein.</a> Ann. Neurol. 68, 162-172 (2010).</li><li>Zou, W. Q., Xiao, X., Yuan, J., Puoti, G., Fujioka, H., Wang, X., Richardson, S., Zhou, X., Zou, R., Li, S., Zhu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid-beta42+interacts+mainly+with+insoluble+prion+protein+in+the+Alzheimer+brain.">Amyloid-beta42 interacts mainly with insoluble prion protein in the Alzheimer brain.</a> J. Biol. Chem. 286, 15095-15105 (2011).</li><li>Zou, W. Q., Colucci, M., Gambetti, P., Chen, S. G., Potter, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+prion+proteins.">Characterization of prion proteins.</a> Methods in Molecular Biology-Neurogenetics: Methods and Protocols. , 305-314 (2002).</li><li>Tzaban, S., Friedlander, G., Schonberger, O., Horonchik, L., Yedidia, Y., Shaked, G., Gabizon, R., Taraboulos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protease-sensitive+scrapie+prion+protein+in+aggregates+of+heterogeneous+sizes.">Protease-sensitive scrapie prion protein in aggregates of heterogeneous sizes.</a> Biochemistry. 41, 12868-12875 (2002).</li></ol>

여기에보고 된 접근 방식의 조합은 정상적인 인간의 뇌에서 지속적으로 불용성 PRP C 집계 및 가용성 PRP C의 oligomers를 분리합니다. 1 시간 100,000 XG의 Ultracentrifugation는 널리 가용성 PRP C 14 일부터 불용성 PRP SC의 분리에 사용 된 고전적인 방법입니다. 가,주의 중 하나를 효율적이지만 원심 분리 한 후 (S2) 표면에 뜨는 당기는 동안 오염을 방지하는 것입니다. iPrP C의...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 (선택 사항) </td></tr><tr><td> Phenylmethylsulfonyl 불소 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> P7626 </td><td> 2 - 프로 파놀에서 72 MM </td></tr><tr><td> Proteinase K </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> P2308 </td><td> H 2 O 2 MG / ML </td></tr><tr><td> PNGase F </td><td> 뉴 잉글랜드 Biolabs </td><td> MWGF200 </td><td></td></tr><tr><td> LE-80K, SW55 로터를 Ultracentrifuge </td><td> Beckman 보습 바로 앞에 달린 풀 베는 날 </td><td> 부품 번호 365668, 356860 </td><td></td></tr><tr><td> Superdex 200 HR 비즈 </td><td> GE 헬스 케어 </td><td> 17-1088-01 </td><td></td></tr><tr><td> 악타 FPLC 시스템 </td><td> GE 헬스 케어 </td><td> 18-1900-26 </td><td></td></tr><tr><td> 분자량 마커 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> MWGF200 </td><td> 다양 </td></tr><tr><td> Dynabeads M-280 자성 비즈 </td><td> Invitrogen </td><td> 143-01 </td><td></td></tr><tr><td> 3F4 항체 </td><td> Covance </td><td> SIG-39600 </td><td></td></tr><tr><td> 1E4 항체 </td><td> 세포 과학 </td><td> M1840 </td><td></td></tr><tr><td> 준비 젤 15% 트리스 - HCL 사전 주조 젤 </td><td> 바이오 RAD </td><td> 345-0020 </td><td></td></tr></tbody></table>

isolation of soluble and insoluble prp oligomers in the normal human brain

prion 질환의 pathogenesis에 중심 이벤트가 병원성 이소 형 PRP SC 하나에 호스트 인코딩 세포 prion 단백질 PRP C의 전환을 포함한다. PRP SC는 세제 - 불용성 응집체를 형성하고 PK 2-6로 부분적으로 강한 반면 PRP C는 세제 - 용해와 proteinase K (PK) - 소화에 민감합니다. PRP SC에 PRP C의 변환은 단백질의 β-시트 구조로 α-나선형의 conformational 변화를 포함하는 것으로 알려져 있습니다. 그러나, 생체 경로에있는이 아직 제대로 이해된다. 임시 내생 PRP SC, 중급 PRP * 또는 &quot;자동 prion&quot;는 감염되지 않은 뇌 7에서 확인되지 않았습니다. biophysical 및 생화학 방법의 조합을 사용하여, 우리는 감염되지 않은 포유류의 두뇌와 neuronal 양식에서 불용성 PRP C 집계를 (지정 iPrP C) 확인세포 8, 9. 여기, 우리는 세제 버퍼, 자당 단계 기울기 침강, 크기 제외 크로마토 그래피, 특히 구조적으로 변경 PRP 양식 10, PK-치료에 바인딩 유전자 5 단백질 (g5p)로 iPrP 농축에 ultracentrifugation을 포함한 이러한 방법에 대한 자세한 절차를 설명합니다. 이러한 접근 방식의 조합은 불용성 PRP SC와 PRP C 합산뿐만 아니라 정상적인 인간의 뇌에서 용해 PRP C의 oligomers뿐만 아니라를 분리합니다. 프로토콜은 감염된 두뇌와 감염되지 않은 뇌의 iPrP C에서 PRP SC를 모두 분리하는 데 사용되었습니다 여기에 설명 된 이후, 사람들은 물리 기능, neurotoxicity, 두 isoforms 사이의 감염의 차이를 비교 할 수있는 기회를 제공. 이러한 연구는 크게 전염성 proteinaceous 병원균의 우리의 이해를 향상됩니다. iPrP C의 생리학과 pathophysiology는 현재 불분명합니다. 특히, 새로 이드entified 인간 prion 질환은 단백 분해 효소에 민감한 prionopathy variably이라고한다, 우리는 iPrP C 11, 12과 immunoreactive 행동과 분열을 공유하는 PRP SC를 발견했다. 또한, 우리는 최근 iPrP C는 알츠하이머 병 13 아밀로이드-β 단백질과 상호 작용의 주요 수종입니다 보여 주었다. 같은 연구에서,이 방법은 다른 neurodegenerative 장애에 관여하지 않는 prion 단백질 응집체에 자신의 응용 프로그램을 제안, 알츠하이머 병 13 Abeta 집계 및 oligomers를 분리하는 데 사용되었습니다.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Soluble and Insoluble PrP Oligomers in the Normal Human Brain at JoVE.com

Isolation of Soluble and Insoluble PrP Oligomers in the Normal Human Brain

세포 prion 단백질의 새로운 종 (PRP<sup&gt; C</sup&gt;) 최근 여기에 설명 된 방법을 사용하여 감염되지 않은 인간의 뇌에서 발견되었습니다. 그들 중 일부는 인간의 두뇌에서 다른 misfolded 단백질 응집체를 분리에 유용합니다 동안 이러한 방법은 다양한 PRP 종을 분리하는 데 사용할 수 있습니다.

보통 인간의 뇌에 용해와 불용성 PRP의 Oligomers의 절연

The central event in the pathogenesis of prion diseases involves a conversion of the host-encoded cellular prion protein PrPC into its pathogenic isoform ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Identification and Isolation of Slow-Dividing Cells in Human Glioblastoma Using Carboxy Fluorescein Succinimidyl Ester (CFSE)

Identification and Isolation of Slow-Dividing Cells in Human Glioblastoma Using Carboxy Fluorescein Succinimidyl Ester CFSE

카르복시 Fluorescein Succinimidyl 에스터 (CFSE)를 사용 인간 Glioblastoma의 속도가 느린 - 나누면 전지의 식별 및 분리

Tumor heterogeneity represents a fundamental feature supporting tumor robustness and presents a central obstacle to the development of therapeutic ...

연구

의학

The Use of Primary Human Fibroblasts for Monitoring Mitochondrial Phenotypes in the Field of Parkinson's Disease

파킨슨 병 분야에서 Mitochondrial Phenotypes을 모니터링하기위한 기본 인간 섬유 아세포의 사용

Parkinson's disease (PD) is the second most  common movement disorder and affects 1% of people over the age of 60 1. Because ageing is  the most important ...

Lesion Explorer: A Video-guided, Standardized Protocol for Accurate and Reliable MRI-derived Volumetrics in Alzheimer's Disease and Normal Elderly

병변 탐색기를 정확하고 신뢰할 수있는 MRI 유도 알츠하이머 병의 볼륨 측정 및 일반 노인을위한 영상 유도, 표준화 된 프로토콜

Obtaining in vivo human brain tissue volumetrics from MRI is often complicated by various technical and biological issues. These challenges are ...

In Vivo Optical Imaging of Brain Tumors and Arthritis Using Fluorescent SapC-DOPS Nanovesicles

In Vivo Optical Imaging of Brain Tumors and Arthritis Using Fluorescent SapC-DOPS Nanovesicles

형광 SAPC-DOPS Nanovesicles을 사용하여 뇌 종양 및 관절염의 생체 광학 이미징

We describe a multi-angle rotational optical imaging (MAROI) system for in vivo monitoring of physiopathological processes labeled with a fluorescent ...

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

같은 뇌 Microslices의 흥분 독성 자극<em&gt; 체외</em&gt; 스트로크의 모델

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As ...

Multi-electrode Array Recordings of Human Epileptic Postoperative Cortical Tissue

인간의 간질 수술 후 두피 조직의 다중 전극 어레이 레코딩

Epilepsy, affecting about 1% of the population, comprises a group of neurological disorders characterized by the periodic occurrence of seizures, which ...

Isolation, Cryopreservation and Culture of Human Amnion Epithelial Cells for Clinical Applications

분리, 냉동 보존 및 문화 임상 응용 프로그램에 대한 인간 양막 상피 세포

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a ...

Isolation of Human Lymphatic Endothelial Cells by Multi-parameter Fluorescence-activated Cell Sorting

다중 매개 변수 형광 활성화 된 셀 정렬하여 인간의 림프 내피 세포의 분리

Lymphatic system disorders such as primary lymphedema, lymphatic malformations and lymphatic tumors are rare conditions that cause significant morbidity ...

Using Saccadometry with Deep Brain Stimulation to Study Normal and Pathological Brain Function

깊은 뇌 자극과 Saccadometry를 사용하여 정상 및 병적 뇌 기능을 연구하는

The oculomotor system involves a large number of brain areas including parts of the basal ganglia, and various neurodegenerative diseases including ...

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

인-31 자기 공명 분광학 : 측정을위한 도구<em&gt; 생체</em인간의 골격 근육에&gt; 미토콘드리아 산화 적 인산화 능력

Skeletal muscle mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) capacity, which is critically important in health and disease, can be measured in vivo ...