Name: isolation of soluble and insoluble prp oligomers in the normal human brain
Uploaded: 2012-10-03T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Soluble and Insoluble PrP Oligomers in the Normal Human Brain at JoVE.com

Den Forfatterne er takknemlige for den menneskelige hjerne og spinalvæske Resource Center (Los Angeles, CA) for å gi normal hjerne prøver. Denne studien ble støttet av National Institutes of Health (NIH) R01NS062787, den CJD Foundation, Alliance BioSecure, samt University Center on Aging og helse med støtte fra McGregor Foundation og presidentens Konjunkturfølsomme Fund (Case Western Reserve University) .

1. Fremstilling av Brain homogenat og vaskemiddel-oppløselige (S2) og-uoppløselig (P2) Fraksjoner <ol><li> Ta 100 mg frossen menneskelige hjernevev og tilsett 100 pl lysebuffer (10 mM Tris, 150 mM NaCl, 0,5% Nonidet P-40 (NP-40), 0,5% EDTA, pH 7,4). </li><li> Homogenisere det på is ved hjelp av støter drevet av en batteridrevet motor, fryse den i tørris i 5 min og homogenisere det igjen ved hjelp av støter drevet av hendene først og deretter ved motor, og legge 300 pl eller 800 pl lysebuffer (dette er enten 20 ...

<ol>
	<li>Prusiner, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prions.+Proc.">Prions. Proc.</a> Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 13363-13383 (1998).</li><li>Oesch, B., Westaway, D., W&#228;lchli, M., McKinley, M. P., Kent, S. B. H., Aebersold, R., Barry, R. A., Tempst, P., Teplow, D. B., Hood, L. E., Prusiner, S. B., Weissmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cellular+gene+encodes+scrapie+PrP+27-30+protein.">A cellular gene encodes scrapie PrP 27-30 protein.</a> Cell. 40, 735-746 (1985).</li><li>Bolton, D. C., McKinley, M. P., Prusiner, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+protein+that+purifies+with+the+scrapie+prion.">Identification of a protein that purifies with the scrapie prion.</a> Science. 218, 1309-1311 (1982).</li><li>Prusiner, S. B., McKinley, M. P., Bowman, K. A., Bolton, D. C., Bendheim, P. E., Groth, D. F., Glenner, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scrapie+prions+aggregate+to+form+amyloid-like+birefringent+rods.">Scrapie prions aggregate to form amyloid-like birefringent rods.</a> Cell. 35, 349-358 (1983).</li><li>Hope, J., Morton, L. J., Farquhar, C. F., Multhaup, G., Beyreuther, K., Kimberlin, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+major+polypeptide+of+scrapie-associated+fibrils+(SAF)+has+the+same+size,+charge+distribution+and+N-terminal+protein+sequence+as+predicted+for+the+normal+brain+protein+(PrP).">The major polypeptide of scrapie-associated fibrils (SAF) has the same size, charge distribution and N-terminal protein sequence as predicted for the normal brain protein (PrP).</a> EMBO J. 5, 2591-2597 (1986).</li><li>Prusiner, S. B., Groth, D. F., Bolton, D. C., Kent, S. B., Hood, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+structural+studies+of+a+major+scrapie+prion+protein.">Purification and structural studies of a major scrapie prion protein.</a> Cell. 38, 127-134 (1984).</li><li>Hall, D., Edskes, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silent+prions+lying+in+wait:+a+two-hit+model+of+prion/amyloid+formation+and+infection.">Silent prions lying in wait: a two-hit model of prion/amyloid formation and infection.</a> J. Mol. Biol. 336, 775-786 (2004).</li><li>Yuan, J., Xiao, X., McGeehan, J., Dong, Z., Cali, I., Fujioka, H., Kong, Q., Kneale, G., Gambetti, P., Zou, W. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insoluble+aggregates+and+protease-resistant+conformers+of+prion+protein+in+uninfected+human+brains.">Insoluble aggregates and protease-resistant conformers of prion protein in uninfected human brains.</a> J. Biol. Chem. 281, 34848-34858 (2006).</li><li>Yuan, J., Dong, Z., Guo, J. P., McGeehan, J., Xiao, X., Wang, J., Cali, I., McGeer, P. L., Cashman, N. R., Bessen, R., Surewicz, W. K., Kneale, G., Petersen, R. B., Gambetti, P., Zou, W. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accessibility+of+a+critical+prion+protein+region+involved+in+strain+recognition+and+its+implications+for+the+early+detection+of+prions.">Accessibility of a critical prion protein region involved in strain recognition and its implications for the early detection of prions.</a> Cell. Mol. Life Sci. 65, 631-643 (2008).</li><li>Zou, W. Q., Zheng, J., Gray, D. M., Gambetti, P., Chen, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+to+DNA+detects+scrapie+but+not+normal+prion+protein.">Antibody to DNA detects scrapie but not normal prion protein.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 1380-1385 (2004).</li><li>Gambetti, P., Dong, Z., Yuan, J., Xiao, X., Zheng, M., Alshekhlee, A., Castellani, R., Cohen, M., Barria, M. A., Gonzalez-Romero, D., Belay, E. D., Schonberger, L. B., Marder, K., Harris, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+human+disease+with+abnormal+prion+protein+sensitive+to+protease.">A novel human disease with abnormal prion protein sensitive to protease.</a> Ann. Neurol. 63, 697-708 (2008).</li><li>Zou, W. Q., Puoti, G., Xiao, X., Yuan, J., Qing, L., Cali, I., Shimoji, M., Langeveld, J. P., Castellani, R., Notari, S., Crain, B., Schmidt, R. E., Geschwind, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variably+protease-sensitive+prionopathy:+A+new+sporadic+disease+of+the+prion+protein.">Variably protease-sensitive prionopathy: A new sporadic disease of the prion protein.</a> Ann. Neurol. 68, 162-172 (2010).</li><li>Zou, W. Q., Xiao, X., Yuan, J., Puoti, G., Fujioka, H., Wang, X., Richardson, S., Zhou, X., Zou, R., Li, S., Zhu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid-beta42+interacts+mainly+with+insoluble+prion+protein+in+the+Alzheimer+brain.">Amyloid-beta42 interacts mainly with insoluble prion protein in the Alzheimer brain.</a> J. Biol. Chem. 286, 15095-15105 (2011).</li><li>Zou, W. Q., Colucci, M., Gambetti, P., Chen, S. G., Potter, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+prion+proteins.">Characterization of prion proteins.</a> Methods in Molecular Biology-Neurogenetics: Methods and Protocols. , 305-314 (2002).</li><li>Tzaban, S., Friedlander, G., Schonberger, O., Horonchik, L., Yedidia, Y., Shaked, G., Gabizon, R., Taraboulos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protease-sensitive+scrapie+prion+protein+in+aggregates+of+heterogeneous+sizes.">Protease-sensitive scrapie prion protein in aggregates of heterogeneous sizes.</a> Biochemistry. 41, 12868-12875 (2002).</li></ol>

Kombinasjonen av tilnærminger som rapporteres her isolerer konsekvent uløselige PrP C aggregater og løselig PrP C oligomerer fra normal menneskelig hjerne. Ultrasentrifugering ved 100.000 xg i en time er en klassisk metode som har vært mye brukt for separering av det uløselige PrP Sc fra løselig PrP C 14. Mens den er effektiv, en av de forsiktighetsregler er å unngå forurensning under trekking supernatanten (S2) etter sentrifugering. Siden gel profilen iPrP C</sup...

<table border="1"><tbody><tr><td> Navnet på reagensen </td><td> Selskapet </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentarer (valgfritt) </td></tr><tr><td> Phenylmethylsulfonyl fluor </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P7626 </td><td> 72 mM i 2-propanol </td></tr><tr><td> Proteinase K </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P2308 </td><td> 2 mg / ml i H 2 O </td></tr><tr><td> PNGase F </td><td> New England Biolabs </td><td> MWGF200 </td><td></td></tr><tr><td> Ultrasentrifuger LE-80K, SW55 rotor </td><td> Beckman Coulter </td><td> Del 365668 No 356860 </td><td></td></tr><tr><td> Superdex 200 HR perler </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-1088-01 </td><td></td></tr><tr><td> AKTA FPLC system </td><td> GE Healthcare </td><td> 18-1900-26 </td><td></td></tr><tr><td> Molekylvektmarkører </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> MWGF200 </td><td> Variert </td></tr><tr><td> Dynabeads M-280 magnetiske kuler </td><td> Invitrogen </td><td> 143-01 </td><td></td></tr><tr><td> 3F4 antistoff </td><td> Covance </td><td> SIG-39600 </td><td></td></tr><tr><td> 1E4 antistoff </td><td> Cell Sciences </td><td> M1840 </td><td></td></tr><tr><td> Klar gel 15% Tris-HCl prefabrikerte geler </td><td> Bio-Rad </td><td> 345-0020 </td><td></td></tr></tbody></table>

isolation of soluble and insoluble prp oligomers in the normal human brain

Den sentrale begivenhet i patogenesen av prionsykdommer innebærer en konvertering av verten-kodede cellulær prionproteinet PrP C i sin sykdomsfremkallende isoform PrP Sc 1. PrP C er vaskemiddel-løselig og følsom for proteinase K (PK)-fordøyelsen, mens PrP Sc danner vaskemiddel-uoppløselige aggregater og er delvis resistent til PK 2-6. Omdannelsen av PrP C til PrP Sc er kjent for å omfatte en konformasjonsendring overgang av α-spiralformede til β arks strukturer av protein. Imidlertid er in vivo pathway fremdeles dårlig forstått. En foreløpig endogene PrP Sc, middels PrP * eller &quot;silent prion&quot;, har ennå ikke identifisert i infisert hjernen 7. Ved hjelp av en kombinasjon av biofysiske og biokjemiske metoder, identifiserte vi uløselige PrP C aggregater (betegnet iPrP C) fra infiserte pattedyr hjerner og kulturperler neuronalceller 8, 9. Her beskriver vi detaljerte prosedyrer av disse metoder, inkludert ultrasentrifugering i vaskemiddel buffer, sukrose trinngradient sedimentering, gelfiltrerings-kromatografi, iPrP oppformering etter genet 5 protein (G5p) som spesifikt binder seg til strukturelt endrede PrP skjemaer 10, og PK-behandling. Kombinasjonen av disse metodene isolerer ikke bare uløselig PrP Sc og PrP C tilslag, men også løselig PrP C oligomerer fra normal menneskelig hjerne. Siden protokoller som er beskrevet her har blitt brukt til å isolere både PrP Sc fra infiserte hjerner og iPrP C fra friske hjerner, de gir oss en mulighet til å sammenligne forskjeller i fysisk-kjemiske egenskaper, nevrotoksisitet og smittsomhet mellom de to isoformer. En slik studie vil gi betraktelig bedre vår forståelse av de smittsomme proteinholdige patogener. Fysiologi og patofysiologi av iPrP C er uklart i dag. Spesielt, i en nylig-identified menneskelig prionsykdom kalles variabelt protease-sensitive prionopathy, fant vi en ny PrP Sc som deler immunoreaktiv atferd og fragmentering med iPrP 11 C, 12. Videre har vi nylig vist at iPrP C er den viktigste arten som samhandler med amyloid-β protein i Alzheimers sykdom 13. I den samme studien, ble disse metodene brukes til å isolere Ap aggregater og oligomerer i Alzheimers sykdom 13, noe som tyder sin søknad til ikke-prionproteinet tilslag involvert i andre nevrodegenerative lidelser.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Soluble and Insoluble PrP Oligomers in the Normal Human Brain at JoVE.com

Isolation of Soluble and Insoluble PrP Oligomers in the Normal Human Brain

En ny art av mobilnettet prionproteinet (PrP<sup&gt; C</sup&gt;) Har nylig blitt identifisert i friske menneskelige hjerne ved hjelp av metodene som er beskrevet her. Disse metodene kan brukes til å isolere forskjellige PrP arter, mens noen av dem er også nyttige for å isolere andre misfolded protein tilslag fra menneskelige hjerne.

Isolering av oppløselige og uoppløselige PrP oligomerer i Normal Human Brain

The central event in the pathogenesis of prion diseases involves a conversion of the host-encoded cellular prion protein PrPC into its pathogenic isoform ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Identification and Isolation of Slow-Dividing Cells in Human Glioblastoma Using Carboxy Fluorescein Succinimidyl Ester (CFSE)

Identification and Isolation of Slow-Dividing Cells in Human Glioblastoma Using Carboxy Fluorescein Succinimidyl Ester CFSE

Tumor heterogeneity represents a fundamental feature supporting tumor robustness and presents a central obstacle to the development of therapeutic ...

The Use of Primary Human Fibroblasts for Monitoring Mitochondrial Phenotypes in the Field of Parkinson's Disease

Bruk av primære humane fibroblaster for overvåking Mitokondrielle Fenotyper i feltet av Parkinsons sykdom

Parkinson's disease (PD) is the second most  common movement disorder and affects 1% of people over the age of 60 1. Because ageing is  the most important ...

Lesion Explorer: A Video-guided, Standardized Protocol for Accurate and Reliable MRI-derived Volumetrics in Alzheimer's Disease and Normal Elderly

Lesjon Explorer: En video-guidet, Standardisert protokoll for nøyaktig og pålitelig MRI-avledet Volumetrics i Alzheimers sykdom og Normal eldreomsorg

Obtaining in vivo human brain tissue volumetrics from MRI is often complicated by various technical and biological issues. These challenges are ...

In Vivo Optical Imaging of Brain Tumors and Arthritis Using Fluorescent SapC-DOPS Nanovesicles

In Vivo Optical Imaging of Brain Tumors and Arthritis Using Fluorescent SapC-DOPS Nanovesicles

I Vivo Optisk Imaging av hjernesvulster og leddgikt Bruke Fluorescent SapC-DOPS Nanovesicles

We describe a multi-angle rotational optical imaging (MAROI) system for in vivo monitoring of physiopathological processes labeled with a fluorescent ...

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

Eksitotoksiske Stimulering av Hjerne Microslices som en<em&gt; In vitro</em&gt; Modell av Stroke

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As ...

Multi-electrode Array Recordings of Human Epileptic Postoperative Cortical Tissue

Multi-elektrode Array Recordings of Human Epileptiske Postoperativ Kortikal Tissue

Epilepsy, affecting about 1% of the population, comprises a group of neurological disorders characterized by the periodic occurrence of seizures, which ...

Isolation, Cryopreservation and Culture of Human Amnion Epithelial Cells for Clinical Applications

Isolasjon, Kryopreservering og kultur menneskerettighets amnion Epitelceller for kliniske anvendelser

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a ...

Isolation of Human Lymphatic Endothelial Cells by Multi-parameter Fluorescence-activated Cell Sorting

Isolering av human lymfatisk endotelceller ved Multi-parameter fluorescens-aktivert cellesortering

Lymphatic system disorders such as primary lymphedema, lymphatic malformations and lymphatic tumors are rare conditions that cause significant morbidity ...

Using Saccadometry with Deep Brain Stimulation to Study Normal and Pathological Brain Function

Bruke Saccadometry med dyp hjernestimulering for å studere normal og patologisk hjernefunksjon

The oculomotor system involves a large number of brain areas including parts of the basal ganglia, and various neurodegenerative diseases including ...

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

Fosfor-31 Magnetic Resonance spektroskopi: Et verktøy for måling<em&gt; I Vivo</em&gt; Mitokondriell oksidativ fosforylering Kapasitet i Human Skeletal Muscle

Skeletal muscle mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) capacity, which is critically important in health and disease, can be measured in vivo ...