Name: isolation of soluble and insoluble prp oligomers in the normal human brain
Uploaded: 2012-10-03T12:00:00
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O autores são gratos ao cérebro humano e Centro de Recursos da coluna de líquido (Los Angeles, CA) para fornecer amostras normais do cérebro. Este estudo foi financiado pelos Institutos Nacionais de Saúde (NIH) R01NS062787, a Fundação CJD, biossegurança Aliança, bem como o Centro Universitário de Envelhecimento e Saúde, com o apoio da Fundação McGregor e Fundo discricionário do Presidente (Case Western Reserve University) .

1. Preparação do homogenato de cérebro e detergente solúvel (S2) e insolúvel (P2) As fracções <ol><li> Tomar 100 mg de tecido cerebral humano congelado e adicionar 100 ul de tampão de lise (10 mM Tris, 150 mM NaCl, 0,5% de Nonidet P-40 (NP-40), EDTA a 0,5%, pH 7,4). </li><li> Homogeneizar em gelo usando um pilão accionado por um motor sem fios, congelá-lo em gelo seco durante 5 minutos e homogeneizar novamente usando um pilão accionado por mãos primeiro e, em seguida, por motor, e adicionam-se 300 ul de ta...

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	<li>Prusiner, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prions.+Proc.">Prions. Proc.</a> Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 13363-13383 (1998).</li><li>Oesch, B., Westaway, D., W&#228;lchli, M., McKinley, M. P., Kent, S. B. H., Aebersold, R., Barry, R. A., Tempst, P., Teplow, D. B., Hood, L. E., Prusiner, S. B., Weissmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cellular+gene+encodes+scrapie+PrP+27-30+protein.">A cellular gene encodes scrapie PrP 27-30 protein.</a> Cell. 40, 735-746 (1985).</li><li>Bolton, D. C., McKinley, M. P., Prusiner, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+protein+that+purifies+with+the+scrapie+prion.">Identification of a protein that purifies with the scrapie prion.</a> Science. 218, 1309-1311 (1982).</li><li>Prusiner, S. B., McKinley, M. P., Bowman, K. A., Bolton, D. C., Bendheim, P. E., Groth, D. F., Glenner, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scrapie+prions+aggregate+to+form+amyloid-like+birefringent+rods.">Scrapie prions aggregate to form amyloid-like birefringent rods.</a> Cell. 35, 349-358 (1983).</li><li>Hope, J., Morton, L. J., Farquhar, C. F., Multhaup, G., Beyreuther, K., Kimberlin, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+major+polypeptide+of+scrapie-associated+fibrils+(SAF)+has+the+same+size,+charge+distribution+and+N-terminal+protein+sequence+as+predicted+for+the+normal+brain+protein+(PrP).">The major polypeptide of scrapie-associated fibrils (SAF) has the same size, charge distribution and N-terminal protein sequence as predicted for the normal brain protein (PrP).</a> EMBO J. 5, 2591-2597 (1986).</li><li>Prusiner, S. B., Groth, D. F., Bolton, D. C., Kent, S. B., Hood, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+structural+studies+of+a+major+scrapie+prion+protein.">Purification and structural studies of a major scrapie prion protein.</a> Cell. 38, 127-134 (1984).</li><li>Hall, D., Edskes, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silent+prions+lying+in+wait:+a+two-hit+model+of+prion/amyloid+formation+and+infection.">Silent prions lying in wait: a two-hit model of prion/amyloid formation and infection.</a> J. Mol. Biol. 336, 775-786 (2004).</li><li>Yuan, J., Xiao, X., McGeehan, J., Dong, Z., Cali, I., Fujioka, H., Kong, Q., Kneale, G., Gambetti, P., Zou, W. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insoluble+aggregates+and+protease-resistant+conformers+of+prion+protein+in+uninfected+human+brains.">Insoluble aggregates and protease-resistant conformers of prion protein in uninfected human brains.</a> J. Biol. Chem. 281, 34848-34858 (2006).</li><li>Yuan, J., Dong, Z., Guo, J. P., McGeehan, J., Xiao, X., Wang, J., Cali, I., McGeer, P. L., Cashman, N. R., Bessen, R., Surewicz, W. K., Kneale, G., Petersen, R. B., Gambetti, P., Zou, W. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accessibility+of+a+critical+prion+protein+region+involved+in+strain+recognition+and+its+implications+for+the+early+detection+of+prions.">Accessibility of a critical prion protein region involved in strain recognition and its implications for the early detection of prions.</a> Cell. Mol. Life Sci. 65, 631-643 (2008).</li><li>Zou, W. Q., Zheng, J., Gray, D. M., Gambetti, P., Chen, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+to+DNA+detects+scrapie+but+not+normal+prion+protein.">Antibody to DNA detects scrapie but not normal prion protein.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 1380-1385 (2004).</li><li>Gambetti, P., Dong, Z., Yuan, J., Xiao, X., Zheng, M., Alshekhlee, A., Castellani, R., Cohen, M., Barria, M. A., Gonzalez-Romero, D., Belay, E. D., Schonberger, L. B., Marder, K., Harris, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+human+disease+with+abnormal+prion+protein+sensitive+to+protease.">A novel human disease with abnormal prion protein sensitive to protease.</a> Ann. Neurol. 63, 697-708 (2008).</li><li>Zou, W. Q., Puoti, G., Xiao, X., Yuan, J., Qing, L., Cali, I., Shimoji, M., Langeveld, J. P., Castellani, R., Notari, S., Crain, B., Schmidt, R. E., Geschwind, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variably+protease-sensitive+prionopathy:+A+new+sporadic+disease+of+the+prion+protein.">Variably protease-sensitive prionopathy: A new sporadic disease of the prion protein.</a> Ann. Neurol. 68, 162-172 (2010).</li><li>Zou, W. Q., Xiao, X., Yuan, J., Puoti, G., Fujioka, H., Wang, X., Richardson, S., Zhou, X., Zou, R., Li, S., Zhu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid-beta42+interacts+mainly+with+insoluble+prion+protein+in+the+Alzheimer+brain.">Amyloid-beta42 interacts mainly with insoluble prion protein in the Alzheimer brain.</a> J. Biol. Chem. 286, 15095-15105 (2011).</li><li>Zou, W. Q., Colucci, M., Gambetti, P., Chen, S. G., Potter, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+prion+proteins.">Characterization of prion proteins.</a> Methods in Molecular Biology-Neurogenetics: Methods and Protocols. , 305-314 (2002).</li><li>Tzaban, S., Friedlander, G., Schonberger, O., Horonchik, L., Yedidia, Y., Shaked, G., Gabizon, R., Taraboulos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protease-sensitive+scrapie+prion+protein+in+aggregates+of+heterogeneous+sizes.">Protease-sensitive scrapie prion protein in aggregates of heterogeneous sizes.</a> Biochemistry. 41, 12868-12875 (2002).</li></ol>

A combinação de abordagens aqui relatado isola consistentemente agregados insolúveis PrP C e PrP C oligómeros solúveis de cérebro humano normal. Ultracentrifugação a 100.000 xg durante uma hora, é um método clássico que tem sido amplamente utilizado para a separação do insolúvel PrPSc solúvel a partir da PrP C 14. Embora seja eficaz, uma das precauções é evitar a contaminação durante o puxar-se o sobrenadante (S2), após a centrifugação. Uma vez que o per...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários (opcional) </td></tr><tr><td> Fluoreto de fenilmetilsulfonilo </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P7626 </td><td> 72 mM em 2-propanol </td></tr><tr><td> Proteinase K </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P2308 </td><td> 2 mg / ml em H2O </td></tr><tr><td> PNGase F </td><td> New England Biolabs </td><td> MWGF200 </td><td></td></tr><tr><td> Ultracentrífuga LE-80K, SW55 rotor </td><td> Beckman Coulter </td><td> Peça n º 365668, 356860 </td><td></td></tr><tr><td> Superdex 200 esferas de RH </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-1088-01 </td><td></td></tr><tr><td> AKTA FPLC sistema </td><td> GE Healthcare </td><td> 18-1900-26 </td><td></td></tr><tr><td> Os marcadores de peso molecular </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> MWGF200 </td><td> Variou </td></tr><tr><td> Dynabeads M-280 esferas magnéticas </td><td> Invitrogen </td><td> 143-01 </td><td></td></tr><tr><td> Anticorpo 3F4 </td><td> Covance </td><td> SIG-39600 </td><td></td></tr><tr><td> Anticorpo 1E4 </td><td> Cell Sciences </td><td> M1840 </td><td></td></tr><tr><td> Gel pronto 15% de Tris-HCl géis pré-moldados </td><td> Bio-Rad </td><td> 345-0020 </td><td></td></tr></tbody></table>

isolation of soluble and insoluble prp oligomers in the normal human brain

O evento central na patogénese das doenças provocadas por priões envolve a conversão do hospedeiro celular codificado prião proteína PrP C em sua isoforma patogénica PrP Sc 1. PrP C é solúvel em detergente e sensível à proteinase K (PK)-digestão, enquanto que a PrP Sc detergente forma de agregados insolúveis e é parcialmente resistente a PK 2-6. A conversão da PrP C e PrP Sc é conhecida por envolver a transição conformacional de α-helicoidal para β folhas estruturas da proteína. No entanto, o caminho em vivo ainda é pouco compreendida. A tentativa endógena PrPSc, intermediário * PrP ou &quot;prião silenciosa&quot;, ainda tem de ser identificado no cérebro não infectado 7. Usando uma combinação de abordagens biofísicas e bioquímicas, identificamos agregados insolúveis PrP C (designado iPrP C) a partir de cérebros de mamíferos não infectados e em cultura neuronalcélulas 8, 9. Aqui, descrevemos os procedimentos pormenorizados destes métodos, incluindo ultracentrifugação em tampão detergente, a sedimentação em gradiente escalonado de sacarose, cromatografia de exclusão de tamanho, o enriquecimento iPrP pelo gene da proteína 5 (G5p) que se ligam especificamente a formas de PrP estruturalmente alterados 10 e PK-tratamento. A combinação destas abordagens isolados não apenas insolúvel PrP Sc e agregados PrP C, mas também oligómeros solúveis PrP C a partir do cérebro humano normal. Uma vez que os protocolos aqui descritos foram utilizados para isolar tanto PrPSc de cérebros infectados e C iPrP de cérebros de não infectados, eles dão-nos a oportunidade de comparar as diferenças nas características físico-químicas, neurotoxicidade e infectividade entre as duas isoformas. Tal estudo vai melhorar muito a nossa compreensão dos agentes infecciosos proteicas. A fisiologia e fisiopatologia do iPrP C não são claras no presente. Notavelmente, em recém-iddoença de príon entified humano denominado variável protease-sensível prionopathy, encontramos um novo PrPSc que compartilha o comportamento imunorreativos e fragmentação com iPrP C 11, 12. Além disso, foi recentemente demonstrado que iPrP C é a espécie principal, que interage com a proteína amilóide-β na doença de Alzheimer 13. No mesmo estudo, estes métodos foram usados ​​para isolar os agregados Abeta e oligómeros em doença de Alzheimer, 13, o que sugere a sua aplicação aos agregados de proteína prião não envolvidos em outras doenças neurodegenerativas.

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Isolation of Soluble and Insoluble PrP Oligomers in the Normal Human Brain

Uma nova espécie de proteína príon celular (PrP<sup&gt; C</sup&gt;) Foi recentemente identificada em cérebros humanos não infectadas com os métodos descritos aqui. Estes métodos podem ser utilizados para isolar espécies diferentes de PrP, enquanto alguns deles são também úteis no isolamento de outros agregados de proteínas mal dobradas a partir de cérebros humanos.

Isolamento de Oligómeros PrP solúveis e insolúveis no cérebro humano normal

The central event in the pathogenesis of prion diseases involves a conversion of the host-encoded cellular prion protein PrPC into its pathogenic isoform ...

Research

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