Name: isolation of soluble and insoluble prp oligomers in the normal human brain
Uploaded: 2012-10-03T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Soluble and Insoluble PrP Oligomers in the Normal Human Brain at JoVE.com

Авторы выражают благодарность человеческого мозга и спинного ресурсный центр Fluid (Лос-Анджелес, Калифорния) для обеспечения нормальных образцов мозга. Это исследование было поддержано Национальным институтом здоровья (NIH) R01NS062787, CJD фонд, Альянс BioSecure, а также центр университета по проблемам старения и здоровья при поддержке МакГрегор фонда и дискреционного фонда Президента (Case Western Reserve University) .

1. Подготовка гомогената мозга и моющих средств водорастворимые (S2) и нерастворимые (P2) Фракции <ol><li> Принимать по 100 мг замороженных человеческих тканей головного мозга и добавить 100 мкл буфера для лизиса (10 мМ Трис, 150 мМ NaCl, 0,5% Nonidet P-40 (NP-40), 0,5% ЭДТА, рН 7,4). </li><li> Однородный его на льду с пест?...

<ol>
	<li>Prusiner, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prions.+Proc.">Prions. Proc.</a> Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 13363-13383 (1998).</li><li>Oesch, B., Westaway, D., W&#228;lchli, M., McKinley, M. P., Kent, S. B. H., Aebersold, R., Barry, R. A., Tempst, P., Teplow, D. B., Hood, L. E., Prusiner, S. B., Weissmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cellular+gene+encodes+scrapie+PrP+27-30+protein.">A cellular gene encodes scrapie PrP 27-30 protein.</a> Cell. 40, 735-746 (1985).</li><li>Bolton, D. C., McKinley, M. P., Prusiner, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+protein+that+purifies+with+the+scrapie+prion.">Identification of a protein that purifies with the scrapie prion.</a> Science. 218, 1309-1311 (1982).</li><li>Prusiner, S. B., McKinley, M. P., Bowman, K. A., Bolton, D. C., Bendheim, P. E., Groth, D. F., Glenner, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scrapie+prions+aggregate+to+form+amyloid-like+birefringent+rods.">Scrapie prions aggregate to form amyloid-like birefringent rods.</a> Cell. 35, 349-358 (1983).</li><li>Hope, J., Morton, L. J., Farquhar, C. F., Multhaup, G., Beyreuther, K., Kimberlin, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+major+polypeptide+of+scrapie-associated+fibrils+(SAF)+has+the+same+size,+charge+distribution+and+N-terminal+protein+sequence+as+predicted+for+the+normal+brain+protein+(PrP).">The major polypeptide of scrapie-associated fibrils (SAF) has the same size, charge distribution and N-terminal protein sequence as predicted for the normal brain protein (PrP).</a> EMBO J. 5, 2591-2597 (1986).</li><li>Prusiner, S. B., Groth, D. F., Bolton, D. C., Kent, S. B., Hood, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+structural+studies+of+a+major+scrapie+prion+protein.">Purification and structural studies of a major scrapie prion protein.</a> Cell. 38, 127-134 (1984).</li><li>Hall, D., Edskes, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silent+prions+lying+in+wait:+a+two-hit+model+of+prion/amyloid+formation+and+infection.">Silent prions lying in wait: a two-hit model of prion/amyloid formation and infection.</a> J. Mol. Biol. 336, 775-786 (2004).</li><li>Yuan, J., Xiao, X., McGeehan, J., Dong, Z., Cali, I., Fujioka, H., Kong, Q., Kneale, G., Gambetti, P., Zou, W. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insoluble+aggregates+and+protease-resistant+conformers+of+prion+protein+in+uninfected+human+brains.">Insoluble aggregates and protease-resistant conformers of prion protein in uninfected human brains.</a> J. Biol. Chem. 281, 34848-34858 (2006).</li><li>Yuan, J., Dong, Z., Guo, J. P., McGeehan, J., Xiao, X., Wang, J., Cali, I., McGeer, P. L., Cashman, N. R., Bessen, R., Surewicz, W. K., Kneale, G., Petersen, R. B., Gambetti, P., Zou, W. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accessibility+of+a+critical+prion+protein+region+involved+in+strain+recognition+and+its+implications+for+the+early+detection+of+prions.">Accessibility of a critical prion protein region involved in strain recognition and its implications for the early detection of prions.</a> Cell. Mol. Life Sci. 65, 631-643 (2008).</li><li>Zou, W. Q., Zheng, J., Gray, D. M., Gambetti, P., Chen, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+to+DNA+detects+scrapie+but+not+normal+prion+protein.">Antibody to DNA detects scrapie but not normal prion protein.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 1380-1385 (2004).</li><li>Gambetti, P., Dong, Z., Yuan, J., Xiao, X., Zheng, M., Alshekhlee, A., Castellani, R., Cohen, M., Barria, M. A., Gonzalez-Romero, D., Belay, E. D., Schonberger, L. B., Marder, K., Harris, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+human+disease+with+abnormal+prion+protein+sensitive+to+protease.">A novel human disease with abnormal prion protein sensitive to protease.</a> Ann. Neurol. 63, 697-708 (2008).</li><li>Zou, W. Q., Puoti, G., Xiao, X., Yuan, J., Qing, L., Cali, I., Shimoji, M., Langeveld, J. P., Castellani, R., Notari, S., Crain, B., Schmidt, R. E., Geschwind, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variably+protease-sensitive+prionopathy:+A+new+sporadic+disease+of+the+prion+protein.">Variably protease-sensitive prionopathy: A new sporadic disease of the prion protein.</a> Ann. Neurol. 68, 162-172 (2010).</li><li>Zou, W. Q., Xiao, X., Yuan, J., Puoti, G., Fujioka, H., Wang, X., Richardson, S., Zhou, X., Zou, R., Li, S., Zhu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid-beta42+interacts+mainly+with+insoluble+prion+protein+in+the+Alzheimer+brain.">Amyloid-beta42 interacts mainly with insoluble prion protein in the Alzheimer brain.</a> J. Biol. Chem. 286, 15095-15105 (2011).</li><li>Zou, W. Q., Colucci, M., Gambetti, P., Chen, S. G., Potter, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+prion+proteins.">Characterization of prion proteins.</a> Methods in Molecular Biology-Neurogenetics: Methods and Protocols. , 305-314 (2002).</li><li>Tzaban, S., Friedlander, G., Schonberger, O., Horonchik, L., Yedidia, Y., Shaked, G., Gabizon, R., Taraboulos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protease-sensitive+scrapie+prion+protein+in+aggregates+of+heterogeneous+sizes.">Protease-sensitive scrapie prion protein in aggregates of heterogeneous sizes.</a> Biochemistry. 41, 12868-12875 (2002).</li></ol>

Сочетание подходов сообщили здесь изолирует последовательно нерастворимые агрегаты PrP C и растворимого PrP C олигомеров от нормального человеческого мозга. Ультрацентрифугирования при 100000 х г в течение одного часа является классическим методом, который широко используется...

<table border="1"><tbody><tr><td> Название реагента </td><td> Компания </td><td> Номер в каталоге </td><td> Комментарии (по желанию) </td></tr><tr><td> Фенилметилсульфонилфторида </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P7626 </td><td> 72 мм в 2-пропанол </td></tr><tr><td> Протеиназы K </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P2308 </td><td> 2 мг / мл H 2 O </td></tr><tr><td> PNGase F </td><td> New England Biolabs </td><td> MWGF200 </td><td></td></tr><tr><td> Ультрацентрифуге LE-80K, SW55 роторе </td><td> Beckman Coulter </td><td> Номер 365668, 356860 </td><td></td></tr><tr><td> Superdex 200 HR бисера </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-1088-01 </td><td></td></tr><tr><td> AKTA FPLC системы </td><td> GE Healthcare </td><td> 18-1900-26 </td><td></td></tr><tr><td> Маркеров молекулярной массы </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> MWGF200 </td><td> Разнообразные </td></tr><tr><td> Dynabeads M-280 магнитных шариков </td><td> Invitrogen </td><td> 143-01 </td><td></td></tr><tr><td> 3F4 антитела </td><td> Covance </td><td> SIG-39600 </td><td></td></tr><tr><td> 1E4 антител </td><td> Сотовые наук </td><td> M1840 </td><td></td></tr><tr><td> Готовый гель 15% Трис-HCl сборных гелях </td><td> Bio-Rad </td><td> 345-0020 </td><td></td></tr></tbody></table>

isolation of soluble and insoluble prp oligomers in the normal human brain

Центральным событием в патогенезе прионных заболеваний включает в себя преобразование хоста в кодировке сотовой прионных белков PrP C в своей патогенной изоформы PrP Sc 1. PrP C является моющим средством растворимых и чувствительны к протеиназы К (PK)-пищеварения, в то время как PrPSc, образует нерастворимые моющих средств агрегатов и частично устойчивы к ПК 2-6. Преобразование PrP C в PrPSc, как известно, связаны с конформационного перехода из α-спиральные к β-лист структуре белка. Тем не менее, в пути естественных условиях все еще ​​плохо изучены. Предварительный эндогенных PrPSc, промежуточные PrP * или &quot;тихая прионных&quot;, до сих пор не определены в неинфицированных мозга 7. Использование комбинации биофизических и биохимических подходов, мы определили нерастворимые PrP C агрегатов (назначенный IPRP C) из неинфицированных млекопитающих мозг и культурный нейроновклетки 8, 9. Здесь мы описываем подробные процедуры из этих методов, в том числе ультрацентрифугирования в моющих буфер, сахарозу шаг градиента осаждение, хроматография исключения, IPRP обогащения гена 5 белков (G5p), которые специфически связываются с структурно изменило PrP формы 10 и ПК-лечение. Сочетание этих подходов изолирует не только нерастворимые PrPSc, и PrP C агрегатов, но и растворимого PrP C олигомеров от нормального человеческого мозга. Так как протоколы, описанные здесь, были использованы для выделения и PrPSc, от инфицированной мозги и IPRP C от неинфицированных мозги, они дают нам возможность сравнить различия в физико-химическими свойствами, нейротоксичность, и инфекционной двух изоформ. Такое исследование позволит значительно улучшить наше понимание инфекционных белковых патогенных микроорганизмов. Физиологии и патофизиологии IPRP C неясны в настоящее время. Примечательно, что в новой ID-entified прионных болезней человека называют переменно-протеазы чувствительной prionopathy, мы нашли новый PrPSc, которая разделяет иммунореактивного поведения и фрагментации с IPRP C 11, 12. Кроме того, недавно мы показали, что IPRP C является основным видом, который взаимодействует с β-амилоидных белков в болезнь Альцгеймера 13. В том же исследовании, эти методы были использованы для выделения Abeta агрегатов и олигомеров при болезни Альцгеймера 13, предполагая, их применение не-прионных белков агрегатов, участвующих в других нейродегенеративных заболеваний.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Soluble and Insoluble PrP Oligomers in the Normal Human Brain at JoVE.com

Isolation of Soluble and Insoluble PrP Oligomers in the Normal Human Brain

Новый вид клеточный белок прион (PrP<sup&gt; C</sup&gt;) Недавно была идентифицирована в незараженных человеческого мозга с использованием методов, описанных здесь. Эти методы могут быть использованы для выделения различных видов PrP, а некоторые из них также являются полезными в изоляции других агрегатов неправильно упакованных белков из человеческого мозга.

Выделение растворимых и нерастворимых олигомеров PrP в нормальном мозга человека

The central event in the pathogenesis of prion diseases involves a conversion of the host-encoded cellular prion protein PrPC into its pathogenic isoform ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Identification and Isolation of Slow-Dividing Cells in Human Glioblastoma Using Carboxy Fluorescein Succinimidyl Ester (CFSE)

Identification and Isolation of Slow-Dividing Cells in Human Glioblastoma Using Carboxy Fluorescein Succinimidyl Ester CFSE

Выявление и изоляция Медленно делящихся клеток глиобластомы человека в использовании Carboxy Fluorescein сукцинимидил Эстер (CFSE)

Tumor heterogeneity represents a fundamental feature supporting tumor robustness and presents a central obstacle to the development of therapeutic ...

The Use of Primary Human Fibroblasts for Monitoring Mitochondrial Phenotypes in the Field of Parkinson's Disease

Использование первичных фибробластов человека для мониторинга митохондриальной фенотипы в области болезни Паркинсона

Parkinson's disease (PD) is the second most  common movement disorder and affects 1% of people over the age of 60 1. Because ageing is  the most important ...

Lesion Explorer: A Video-guided, Standardized Protocol for Accurate and Reliable MRI-derived Volumetrics in Alzheimer's Disease and Normal Elderly

Поражение Explorer: Видео наведением, стандартизированный протокол для точной и надежной МРТ-производных Volumetrics при болезни Альцгеймера и Нормальная Пожилые

Obtaining in vivo human brain tissue volumetrics from MRI is often complicated by various technical and biological issues. These challenges are ...

In Vivo Optical Imaging of Brain Tumors and Arthritis Using Fluorescent SapC-DOPS Nanovesicles

In Vivo Optical Imaging of Brain Tumors and Arthritis Using Fluorescent SapC-DOPS Nanovesicles

В Vivo визуализация пространственного распределения опухолей головного мозга и артрита использованием флуоресцентных SAPC-DOPS Nanovesicles

We describe a multi-angle rotational optical imaging (MAROI) system for in vivo monitoring of physiopathological processes labeled with a fluorescent ...

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

Экзайтотоксическим Стимуляция мозга Microslices как<em&gt; В пробирке</em&gt; Модель инсульта

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As ...

Multi-electrode Array Recordings of Human Epileptic Postoperative Cortical Tissue

Многоэлектродной массива Записи человека эпилептические Послеоперационный корковой ткани

Epilepsy, affecting about 1% of the population, comprises a group of neurological disorders characterized by the periodic occurrence of seizures, which ...

Isolation, Cryopreservation and Culture of Human Amnion Epithelial Cells for Clinical Applications

Изоляция, криоконсервации и культура клеток человека Амнион Эпителиальные для клинического применения

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a ...

Isolation of Human Lymphatic Endothelial Cells by Multi-parameter Fluorescence-activated Cell Sorting

Выделение человека эндотелиальных клеток лимфатической от нескольких параметров флуоресценции активирован сортировки клеток

Lymphatic system disorders such as primary lymphedema, lymphatic malformations and lymphatic tumors are rare conditions that cause significant morbidity ...

Using Saccadometry with Deep Brain Stimulation to Study Normal and Pathological Brain Function

Использование Saccadometry с Глубокая стимуляция мозга для изучения нормальной и патологической функции мозга

The oculomotor system involves a large number of brain areas including parts of the basal ganglia, and various neurodegenerative diseases including ...

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

Фосфор-31 спектроскопии магнитного резонанса: Прибор для измерения<em&gt; В Vivo</em&gt; Митохондриальной окислительное фосфорилирование потенциала в скелетных мышцах человека

Skeletal muscle mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) capacity, which is critically important in health and disease, can be measured in vivo ...