Name: isolation of soluble and insoluble prp oligomers in the normal human brain
Uploaded: 2012-10-03T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Soluble and Insoluble PrP Oligomers in the Normal Human Brain at JoVE.com

yazarlar normal beyin numuneleri sağlamak için İnsan Beyin ve Omurilik Sıvısı Kaynak Merkezi (Los Angeles, CA) müteşekkiriz. Bu çalışma McGregor Vakfı&#39;nın desteği ve Cumhurbaşkanı İhtiyari Fonu (Case Western Reserve Üniversitesi) ile Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) R01NS062787, CJD Vakfı, İttifak BioSecure yanı sıra Üniversite Yaşlanma Merkezi ve Sağlık tarafından desteklenen .

1. Beyin Homojenat ve Deterjan-Çözünür (S2) ve çözünemeyen (P2), fraksiyonlar hazırlanması <ol><li> 100 mg insan dondurulmuş beyin dokusu almak ve (10 mM Tris, 150 mM NaCl,% 0.5 Nonidet P-40 (NP-40),% 0.5 EDTA, pH 7.4) 100 ul lizis tamponu ilave edin. </li><li> Bir akülü motor tarafından tahrik havaneli kullanarak buz üzerinde homojenize, bu da 20 olan 5 dk için kuru buz içinde dondurmak ve motor tarafından ilk ve sonra eller tarafından tahrik havaneli kullanarak tekrar homojenize ve 300 ul veya 800 ...

<ol>
	<li>Prusiner, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prions.+Proc.">Prions. Proc.</a> Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 13363-13383 (1998).</li><li>Oesch, B., Westaway, D., W&#228;lchli, M., McKinley, M. P., Kent, S. B. H., Aebersold, R., Barry, R. A., Tempst, P., Teplow, D. B., Hood, L. E., Prusiner, S. B., Weissmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cellular+gene+encodes+scrapie+PrP+27-30+protein.">A cellular gene encodes scrapie PrP 27-30 protein.</a> Cell. 40, 735-746 (1985).</li><li>Bolton, D. C., McKinley, M. P., Prusiner, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+protein+that+purifies+with+the+scrapie+prion.">Identification of a protein that purifies with the scrapie prion.</a> Science. 218, 1309-1311 (1982).</li><li>Prusiner, S. B., McKinley, M. P., Bowman, K. A., Bolton, D. C., Bendheim, P. E., Groth, D. F., Glenner, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scrapie+prions+aggregate+to+form+amyloid-like+birefringent+rods.">Scrapie prions aggregate to form amyloid-like birefringent rods.</a> Cell. 35, 349-358 (1983).</li><li>Hope, J., Morton, L. J., Farquhar, C. F., Multhaup, G., Beyreuther, K., Kimberlin, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+major+polypeptide+of+scrapie-associated+fibrils+(SAF)+has+the+same+size,+charge+distribution+and+N-terminal+protein+sequence+as+predicted+for+the+normal+brain+protein+(PrP).">The major polypeptide of scrapie-associated fibrils (SAF) has the same size, charge distribution and N-terminal protein sequence as predicted for the normal brain protein (PrP).</a> EMBO J. 5, 2591-2597 (1986).</li><li>Prusiner, S. B., Groth, D. F., Bolton, D. C., Kent, S. B., Hood, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+structural+studies+of+a+major+scrapie+prion+protein.">Purification and structural studies of a major scrapie prion protein.</a> Cell. 38, 127-134 (1984).</li><li>Hall, D., Edskes, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silent+prions+lying+in+wait:+a+two-hit+model+of+prion/amyloid+formation+and+infection.">Silent prions lying in wait: a two-hit model of prion/amyloid formation and infection.</a> J. Mol. Biol. 336, 775-786 (2004).</li><li>Yuan, J., Xiao, X., McGeehan, J., Dong, Z., Cali, I., Fujioka, H., Kong, Q., Kneale, G., Gambetti, P., Zou, W. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insoluble+aggregates+and+protease-resistant+conformers+of+prion+protein+in+uninfected+human+brains.">Insoluble aggregates and protease-resistant conformers of prion protein in uninfected human brains.</a> J. Biol. Chem. 281, 34848-34858 (2006).</li><li>Yuan, J., Dong, Z., Guo, J. P., McGeehan, J., Xiao, X., Wang, J., Cali, I., McGeer, P. L., Cashman, N. R., Bessen, R., Surewicz, W. K., Kneale, G., Petersen, R. B., Gambetti, P., Zou, W. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accessibility+of+a+critical+prion+protein+region+involved+in+strain+recognition+and+its+implications+for+the+early+detection+of+prions.">Accessibility of a critical prion protein region involved in strain recognition and its implications for the early detection of prions.</a> Cell. Mol. Life Sci. 65, 631-643 (2008).</li><li>Zou, W. Q., Zheng, J., Gray, D. M., Gambetti, P., Chen, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+to+DNA+detects+scrapie+but+not+normal+prion+protein.">Antibody to DNA detects scrapie but not normal prion protein.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 1380-1385 (2004).</li><li>Gambetti, P., Dong, Z., Yuan, J., Xiao, X., Zheng, M., Alshekhlee, A., Castellani, R., Cohen, M., Barria, M. A., Gonzalez-Romero, D., Belay, E. D., Schonberger, L. B., Marder, K., Harris, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+human+disease+with+abnormal+prion+protein+sensitive+to+protease.">A novel human disease with abnormal prion protein sensitive to protease.</a> Ann. Neurol. 63, 697-708 (2008).</li><li>Zou, W. Q., Puoti, G., Xiao, X., Yuan, J., Qing, L., Cali, I., Shimoji, M., Langeveld, J. P., Castellani, R., Notari, S., Crain, B., Schmidt, R. E., Geschwind, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variably+protease-sensitive+prionopathy:+A+new+sporadic+disease+of+the+prion+protein.">Variably protease-sensitive prionopathy: A new sporadic disease of the prion protein.</a> Ann. Neurol. 68, 162-172 (2010).</li><li>Zou, W. Q., Xiao, X., Yuan, J., Puoti, G., Fujioka, H., Wang, X., Richardson, S., Zhou, X., Zou, R., Li, S., Zhu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid-beta42+interacts+mainly+with+insoluble+prion+protein+in+the+Alzheimer+brain.">Amyloid-beta42 interacts mainly with insoluble prion protein in the Alzheimer brain.</a> J. Biol. Chem. 286, 15095-15105 (2011).</li><li>Zou, W. Q., Colucci, M., Gambetti, P., Chen, S. G., Potter, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+prion+proteins.">Characterization of prion proteins.</a> Methods in Molecular Biology-Neurogenetics: Methods and Protocols. , 305-314 (2002).</li><li>Tzaban, S., Friedlander, G., Schonberger, O., Horonchik, L., Yedidia, Y., Shaked, G., Gabizon, R., Taraboulos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protease-sensitive+scrapie+prion+protein+in+aggregates+of+heterogeneous+sizes.">Protease-sensitive scrapie prion protein in aggregates of heterogeneous sizes.</a> Biochemistry. 41, 12868-12875 (2002).</li></ol>

Burada bildirilen yaklaşımların birleşimi normal insan beyninin sürekli çözünmez PrP C agrega ve çözünür PrP C oligomerler ayırır. Bir saat boyunca 100,000 x g&#39;da santrifüjü gibi geniş ölçüde çözünür PrP C den 14 çözünmez PrP Sc ayrılması için kullanılmış olan klasik bir yöntemdir. Bu, uyarılar bir etkili olsa da santrifüj sonrasında (S2) süpernatant çekme sırasında kirlenmesini önlemek içindir. IPrP C jel pr...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar (isteğe bağlı) </td></tr><tr><td> Phenylmethylsulfonyl florür </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P7626 </td><td> 2-propanol içinde 72 mM </td></tr><tr><td> Proteinaz K </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P2308 </td><td> H2O içinde 2 mg / ml </td></tr><tr><td> PNGase F </td><td> New England Biolabs </td><td> MWGF200 </td><td></td></tr><tr><td> LE-80K, SW55 rotor ultrasantrifüjdeki </td><td> Beckman Coulter </td><td> Parça No 365668, 356860 </td><td></td></tr><tr><td> Superdex 200 HR boncuk </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-1088-01 </td><td></td></tr><tr><td> AKTA FPLC sistemi </td><td> GE Healthcare </td><td> 18-1900-26 </td><td></td></tr><tr><td> Molekül ağırlığı belirteçler </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> MWGF200 </td><td> Çeşitlidir </td></tr><tr><td> Dynabeads M-280 manyetik boncuk </td><td> Invitrogen </td><td> 143-01 </td><td></td></tr><tr><td> 3F4 antikoru </td><td> Covance </td><td> SIG-39600 </td><td></td></tr><tr><td> Antikor 1E4 </td><td> Hücre Bilimleri </td><td> M1840 </td><td></td></tr><tr><td> Hazır jel% 15 mM Tris-HCl, önceden dökme jeller </td><td> Bio-Rad </td><td> 345-0020 </td><td></td></tr></tbody></table>

isolation of soluble and insoluble prp oligomers in the normal human brain

Prion hastalıklarının patogenezinde merkezi bir olay, onun patojenik izoformu PrP Sc 1 içine konak-kodlanmış hücresel prion proteini PrP C bir dönüşüm içerir. PrP-Sc deterjan çözünmez agregaları ve PK 2-6 karşı kısmen dirençlidir ise PrP C, deterjan çözünebilen ve proteinaz K (PK)-sindirim duyarlıdır. PrP Sc PrP C dönüştürme protein β-tabaka yapıları α-sarmal bir konformasyon geçiş dahil olduğu bilinmektedir. Ancak, in vivo yolu içinde çok az anlaşılmıştır. Bir geçici endojen PrP Sc, ara PrP * veya &quot;sessiz prion&quot;, bulaşmamış beyin 7 tespit edilmesi henüz. Biyofiziksel ve biyokimyasal yaklaşımların bir arada kullanarak, bulaşmamış memeli beyin ve nöronal kültürlü gelen çözünmez PrP C agrega (belirlenmiş iPrP C) tespithücreler 8, 9. Burada, deterjan tampon, sukroz adım degrade sedimantasyon, boyut dışlama kromatografisi, özellikle yapısal değişmiş PrP formları, 10 ve PK-tedavi bağlamak gen 5 proteini (G5p) tarafından iPrP zenginleşmesine Ultrasantrifügasyon dahil olmak üzere bu yöntemlerin ayrıntılı prosedürleri açıklar. Bu yaklaşımların birleşimi çözünmeyen PrP Sc ve PrP C büyüklükler değil, aynı zamanda normal insan beyninden çözünür PrP C oligomerler sadece ayırır. Protokolleri enfekte beyinleri ve enfekte olmayan beyninden iPrP C PrP Sc hem izole etmek için kullanılan oylandı Burada açıklanan bu yana, fizikokimyasal özellikleri, nörotoksisite ve iki izoformu arasındaki enfektivite farklılıkları karşılaştırmak için bir fırsat verin. Böyle bir çalışmanın büyük ölçüde bulaşıcı proteinli patojenlerin anlayışımızı geliştirecektir. IPrP C fizyolojisi ve patofizyolojisi halen belirsizdir. Özellikle, yeni-idyazısından İnsan prion hastalığı proteaz duyarlı prionopathy değişken olarak adlandırılan, biz iPrP C 11, 12 ile immunoreaktif davranış ve parçalanma paylaşan yeni PrP Sc bulundu. Ayrıca, biz son zamanlarda iPrP C Alzheimer hastalığı 13 amiloid-β proteini ile etkileşime ana tür olduğunu göstermiştir. Aynı çalışmada, bu yöntemlerin diğer nörodejeneratif bozukluklar ile ilgili olmayan prion proteininin agregalar için uygulama düşündüren, Alzheimer hastalığının 13 Abeta agrega ve oligomerler izole etmek için kullanılmıştır.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Soluble and Insoluble PrP Oligomers in the Normal Human Brain at JoVE.com

Isolation of Soluble and Insoluble PrP Oligomers in the Normal Human Brain

Hücresel prion proteini yeni bir tür (PrP<sup&gt; C</sup&gt;) Son zamanlarda burada açıklanan yöntemleri kullanarak bulaşmamış insan beyni saptanmıştır. Bunların bazıları, aynı zamanda, insan beyninden diğer katlanan protein büyüklükler izole yararlıdırlar Bu yöntemler, çeşitli PrP tür izole etmek için de kullanılabilir.

Normal İnsan Beyin Çözünür ve çözünmez PrP Oligomerleri İzolasyonu

The central event in the pathogenesis of prion diseases involves a conversion of the host-encoded cellular prion protein PrPC into its pathogenic isoform ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Identification and Isolation of Slow-Dividing Cells in Human Glioblastoma Using Carboxy Fluorescein Succinimidyl Ester (CFSE)

Identification and Isolation of Slow-Dividing Cells in Human Glioblastoma Using Carboxy Fluorescein Succinimidyl Ester CFSE

Karboksi Flöresein sukkinimidil ester (KAKE) Kullanarak İnsan Glioblastoma Yavaş-bölme Hücreleri Tanımlama ve İzolasyonu

Tumor heterogeneity represents a fundamental feature supporting tumor robustness and presents a central obstacle to the development of therapeutic ...

The Use of Primary Human Fibroblasts for Monitoring Mitochondrial Phenotypes in the Field of Parkinson's Disease

Parkinson Hastalığı Alanında Mitokondriyal Fenotiplerinin İzleme İlköğretim İnsan Fibroblast Kullanımı

Parkinson's disease (PD) is the second most  common movement disorder and affects 1% of people over the age of 60 1. Because ageing is  the most important ...

Lesion Explorer: A Video-guided, Standardized Protocol for Accurate and Reliable MRI-derived Volumetrics in Alzheimer's Disease and Normal Elderly

Lezyon Explorer: Doğru ve Güvenilir MR türetilmiş Alzheimer Hastalığı Volumetrics ve Normal Yaşlı Bir Video-güdümlü, Standart Protokol

Obtaining in vivo human brain tissue volumetrics from MRI is often complicated by various technical and biological issues. These challenges are ...

In Vivo Optical Imaging of Brain Tumors and Arthritis Using Fluorescent SapC-DOPS Nanovesicles

In Vivo Optical Imaging of Brain Tumors and Arthritis Using Fluorescent SapC-DOPS Nanovesicles

Floresan SapC-DOPS Nanovesicles kullanma Beyin Tümörleri ve Artrit Vivo Optik Görüntüleme

We describe a multi-angle rotational optical imaging (MAROI) system for in vivo monitoring of physiopathological processes labeled with a fluorescent ...

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

Bir olarak Beyin Microslices arasında excitotoxic uyarılması<em&gt; In vitro</em&gt; İnme Model

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As ...

Multi-electrode Array Recordings of Human Epileptic Postoperative Cortical Tissue

İnsan Epileptik Ameliyat sonrası Kortikal Doku Çok elektrot Dizi Kayıtlar

Epilepsy, affecting about 1% of the population, comprises a group of neurological disorders characterized by the periodic occurrence of seizures, which ...

Isolation, Cryopreservation and Culture of Human Amnion Epithelial Cells for Clinical Applications

İzolasyon, Kriyoprezervasyon ve Kültür Klinik Uygulamaları İnsan Amniyon Epitel Hücreleri

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a ...

Isolation of Human Lymphatic Endothelial Cells by Multi-parameter Fluorescence-activated Cell Sorting

Çoklu-parametre floresans ile aktive edilen hücre sınıflandırma İnsan lenfatik endotel hücreleri İzolasyonu

Lymphatic system disorders such as primary lymphedema, lymphatic malformations and lymphatic tumors are rare conditions that cause significant morbidity ...

Using Saccadometry with Deep Brain Stimulation to Study Normal and Pathological Brain Function

Derin Beyin Uyarım ile Saccadometry kullanarak normal ve patolojik beyin fonksiyonlarını incelemek için

The oculomotor system involves a large number of brain areas including parts of the basal ganglia, and various neurodegenerative diseases including ...

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

Fosfor-31 Manyetik Rezonans Spektroskopisi: Ölçme için Aracı<em&gt; İn Vivo</emİnsan İskelet Kası içinde&gt; Mitokondriyal Oksidatif Fosforilasyon Kapasitesi

Skeletal muscle mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) capacity, which is critically important in health and disease, can be measured in vivo ...