Name: single cell measurement of dopamine release with simultaneous voltage-clamp and amperometry
Uploaded: 2012-11-21T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single Cell Measurement of Dopamine Release with Simultaneous Voltage-clamp and Amperometry at JoVE.com

Wij danken Dr Sanika Chirwa voor kritische beoordeling van dit manuscript. Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health (DA026947, DA021471, en NS071122).

1. Apparatuur en benodigdheden <ol><li> Monteer een Faraday kooi bovenop de anti triltafel (TMI) om de achtergrondruis te verminderen. </li><li> De gelijktijdige patch clamp amperometrie opname systeem vereist een omgekeerde microscoop met uitstekende DIC optiek en een lange werkafstand lens. Sluit de microscoop vuurtoren op een auto-accu. Deze DC lichtbron voor het systeem verdere daling van het elektrische ruis. </li><li> Hydraulische micromanipulators (Siskiyou) verdere daling lawaai. In onze configuratie, gebruike...

<ol>
	<li>Michael, A. C., Ikeda, M., Justice, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+contributing+to+the+recovery+of+striatal+releasable+dopamine+following+MFB+stimulation.">Mechanisms contributing to the recovery of striatal releasable dopamine following MFB stimulation.</a> Brain Res. 421, 325-335 (1987).</li><li>Gonon, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prolonged+and+extrasynaptic+excitatory+action+of+dopamine+mediated+by+D1+receptors+in+the+rat+striatum+in+vivo.">Prolonged and extrasynaptic excitatory action of dopamine mediated by D1 receptors in the rat striatum in vivo.</a> J. Neurosci. 17, 5972-5978 (1997).</li><li>Sulzer, D., Pothos, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+quantal+size+by+presynaptic+mechanisms.">Regulation of quantal size by presynaptic mechanisms.</a> Rev. Neurosci. 11, 159-212 (2000).</li><li>Napolitano, A., Cesura, A. M., Da Prada, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+monoamine+oxidase+and+catechol+O-methyltransferase+in+dopaminergic+neurotransmission.">The role of monoamine oxidase and catechol O-methyltransferase in dopaminergic neurotransmission.</a> J. Neural. Transm. Suppl. 45, 35-45 (1995).</li><li>Sulzer, D., Maidment, N. T., Rayport, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amphetamine+and+other+weak+bases+act+to+promote+reverse+transport+of+dopamine+in+ventral+midbrain+neurons.">Amphetamine and other weak bases act to promote reverse transport of dopamine in ventral midbrain neurons.</a> J. Neurochem. 60, 527-535 (1993).</li><li>Salahpour, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+amphetamine-induced+hyperactivity+and+reward+in+mice+overexpressing+the+dopamine+transporter.">Increased amphetamine-induced hyperactivity and reward in mice overexpressing the dopamine transporter.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 4405-4410 (2008).</li><li>Khoshbouei, H., Wang, H., Lechleiter, J. D., Javitch, J. A., Galli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amphetamine-induced+dopamine+efflux.+A+voltage-sensitive+and+intracellular+Na+-dependent+mechanism.">Amphetamine-induced dopamine efflux. A voltage-sensitive and intracellular Na+-dependent mechanism.</a> J. Biol. Chem. 278, 12070-12077 (2003).</li><li>Goodwin, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amphetamine+and+methamphetamine+differentially+affect+dopamine+transporters+in+vitro+and+in.">Amphetamine and methamphetamine differentially affect dopamine transporters in vitro and in.</a> , 284-2978 (2009).</li><li>Kahlig, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amphetamine+induces+dopamine+efflux+through+a+dopamine+transporter+channel.">Amphetamine induces dopamine efflux through a dopamine transporter channel.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 3495-3500 (2005).</li><li>Swant, J., Chirwa, S., Stanwood, G., Khoshbouei, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methamphetamine+reduces+LTP+and+increases+baseline+synaptic+transmission+in+the+CA1+region+of+mouse+hippocampus.">Methamphetamine reduces LTP and increases baseline synaptic transmission in the CA1 region of mouse hippocampus.</a> PLoS One. 5, e11382 (2010).</li><li>Gnegy, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+Ca2++regulates+amphetamine-induced+dopamine+efflux+and+currents+mediated+by+the+human+dopamine+transporter.">Intracellular Ca2+ regulates amphetamine-induced dopamine efflux and currents mediated by the human dopamine transporter.</a> Mol. Pharmacol. 66, 137-143 (2004).</li></ol>

Gelijktijdige voltage-clamp en amperometrie heeft de volgende voordelen. Alle celtypen zijn toegankelijk en kunnen worden gebruikt voor opname. De identificatie van de cellen of neuron waar de opnames worden gedaan, is eenvoudig en ongecompliceerd. Met name wanneer de cel fluorescent gelabelde door toevoeging van een fluorescerend label aan het eiwit van belang de experimentator kan eenvoudig de doelcel of neuron. De experimentele configuratie maakt uniforme en gecontroleerde afgifte van farmacologische middelen hetzij ...

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> Uitrusting </td></tr><tr><td> Anti-vibratie tafel w / kooi van Faraday </td><td> Technische Manufacturing Corporation </td><td> 63 tot 500 serie </td><td> gebruiken we het model 63 tot 543 </td></tr><tr><td> Omgekeerde microscoop Nikon TE-2000 </td><td> Nikon </td><td> gestaakt </td><td> nu Eclipse Ti </td></tr><tr><td> Twee low noise versterkers axopatch 200b </td><td> Molecular Devices </td><td></td><td> 800-635-5577 </td></tr><tr><td> 1-CV 203 BU headstage </td><td> Molecular Devices </td><td></td><td> 800-635-5578 </td></tr><tr><td> 1-HL-U pipethouder </td><td> Molecular Devices </td><td></td><td> 800-635-5579 </td></tr><tr><td> Digidata 1440A A / D converter </td><td> Molecular Devices </td><td></td><td> 800-635-5580 </td></tr><tr><td> Twee manipulatoren Siskyou, linksen rechtshandig </td><td> Siskiyou </td><td> MX6600R MX6600L </td><td> 877-313-6418 </td></tr><tr><td> Laser pipet trekker </td><td> Sutter Instrumenten </td><td> P-2000 </td><td> 888-883-0128 </td></tr><tr><td> Laag geluidsniveau koolstofvezel amperometrische elektrode </td><td> ProCFE </td><td></td><td> <a href="http://www.dagan.com" target="_blank">www.dagan.com</a> </td></tr><tr><td> Laag geluidsniveau kwarts pipet </td><td> Sutter Instrumenten </td><td> QF100-70-7.5 </td><td> 888-883-0128 </td></tr><tr><td> 12-volt accu van de auto </td><td></td><td></td><td> schaal beschikbaar </td></tr><tr><td> Auto acculader </td><td></td><td></td><td> schaal beschikbaar </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Reagens </td></tr><tr><td> Natriumchloride (NaCl) </td><td> Sigma </td><td> S7653 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Sigma </td><td> H3375 </td><td></td></tr><tr><td> Dextrose </td><td> Sigma </td><td> G7528 </td><td></td></tr><tr><td> Magnesiumsulfaat (MgSO4) </td><td> Sigma </td><td> M2643 </td><td></td></tr><tr><td> Kaliumfosfaat monobasisch (KH 2 PO 4) </td><td> Sigma </td><td> P5655 </td><td></td></tr><tr><td> Kaliumchloride (KCl) </td><td> Sigma </td><td> P9333 </td><td></td></tr><tr><td> Calciumchloridedihydraat (CaCl 2 • 2H 2 0) </td><td> Sigma </td><td> 223506 </td><td></td></tr><tr><td> Magnesiumchloridehexahydraat (MgCl2 • 6H 2 0) </td><td> Sigma </td><td> M2670 </td><td></td></tr><tr><td> EGTA </td><td> Sigma </td><td> E0396 </td><td></td></tr></tbody></table>

single cell measurement of dopamine release with simultaneous voltage-clamp and amperometry

Na de introductie in de synaptische spleet, dopamine oefent zijn biologische eigenschappen via de pre-en post-synaptische doelstellingen 1. De dopamine signaal wordt beëindigd door diffusie 2-3, extracellulaire enzymen 4 en membraan transporters 5. De dopamine transporter, gelegen in het peri-synaptische spleet van dopamine neuronen wist de vrijgekomen aminen door middel van een naar binnen dopamine flux (opname). De dopamine transporter kan ook in omgekeerde richting om aminen vrijgeven van binnen naar buiten in een proces genaamd naar buiten vervoer of efflux van dopamine 5. . Meer dan 20 jaar geleden Sulzer et al. rapporteerden de dopamine transporter kan in twee vormen van activiteit: vooruit (opname) en achteruit (efflux) 5. De neurotransmitter model via efflux door de transporter kunt een grote hoeveelheid dopamine naar de extracellulaire ruimte, en blijkt een belangrijke regulerende rol spelen in extracellulaire dopamine homeostasis 6. Hier beschrijven we hoe gelijktijdige patch clamp en amperometrie registratie kan worden toegepast om model dopamine meten via de efflux mechanisme milliseconde tijdsresolutie wanneer de membraanpotentiaal wordt geregeld. Hiervoor zijn gehele celstroom en oxidatieve (amperometrische) signalen gelijktijdig gemeten met een Axopatch 200B versterker (Molecular Devices, een low-pass filter set Bessel bij 1000 Hz voor whole-cell huidige opname). Voor amperometrie opnemen van een koolstofvezel elektrode is verbonden met een tweede versterker (Axopatch 200B) en grenzend aan het plasmamembraan en +700 mV gehouden. De volledige cel en oxidatieve (amperometrische) stromen kunnen worden opgenomen en de stroom-spanning relatie kan worden gegenereerd met een spanningssprong protocol. In tegenstelling tot de gebruikelijke amperometrische kalibratie, die omzetting concentratie is vereist, wordt de stroom direct gerapporteerd zonder de effectieve volume 7. Aldus de verkregen datavertegenwoordigen een ondergrens aan dopamine efflux omdat sommige zender wordt verloren aan de bulk oplossing.

Gecombineerde patch clamp met amperometrie kan meten spanningsafhankelijke DAT-gemedieerde efflux DA. Figuur 2A toont een representatieve experimentele configuratie en opnemen van DAT-gemedieerde efflux DA wanneer de intracellulaire milieu en de membraanpotentiaal worden vastgeklemd door een volledige cel patch pipet. Met deze techniek cellen die YFP-DAT eiwitten voltage-geklemd met een gehele cel patch pipet terwijl een amperometrische elektrode wordt op de plasmamembraan (Figuur 2A). ...

Watch this Scientific Journal Video about Single Cell Measurement of Dopamine Release with Simultaneous Voltage-clamp and Amperometry at JoVE.com

Single Cell Measurement of Dopamine Release with Simultaneous Voltage-clamp and Amperometry

De amperometrische techniek meet dopamine afgifte van een enkele cel door het detecteren van de stroom die door oxidatieve spontane dopamine oxidatie. Gelijktijdig spanning klem en amperometrie methodologie onthullen de mechanistische relatie tussen de totale &quot;activiteit&quot; van dopamine transporter en de regulerende rol van deze activiteit op de achterzijde transport van dopamine.

Single Cell Meting van dopamine-afgifte met gelijktijdige Voltage-klem en amperometrie

After its release into the synaptic cleft, dopamine exerts its biological properties via its pre- and post-synaptic targets1. The dopamine signal is ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Functional Mapping with Simultaneous MEG and EEG

Functionele Mapping met gelijktijdige MEG en EEG

We use magnetoencephalography (MEG) and electroencephalography (EEG) to locate and determine the temporal evolution in brain areas involved in the ...

Presynaptic Dopamine Dynamics in Striatal Brain Slices with Fast-scan Cyclic Voltammetry

Presynaptische Dopamine Dynamiek in het striatum Brain Plakjes met Fast-scan cyclische voltammetrie

Extensive research has focused on the neurotransmitter dopamine because of its importance in the mechanism of action of drugs of abuse (e.g. cocaine and ...

Single-cell Profiling of Developing and Mature Retinal Neurons

Single-cell Profilering van het ontwikkelen en Jong netvlies Neuronen

Highly specialized, but exceedingly small populations of cells play important roles in many tissues. The identification of cell-type specific markers and ...

Optical Recording of Suprathreshold Neural Activity with Single-cell and Single-spike Resolution

Optische registratie van suprathreshold neurale activiteit met single-cell en single-spike resolutie

Signaling of information in the vertebrate central nervous system is often carried by populations of neurons rather than individual neurons. Also ...

Simultaneous Electroencephalography, Real-time Measurement of Lactate Concentration and Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity in the Rodent Cerebral Cortex

Gelijktijdig Elektro, Real-time meting van lactaatconcentratie en Optogenetic Manipulatie van neuronale activiteit in de Rodent Cerebral Cortex

Although the brain represents less than 5% of the body  by mass, it utilizes approximately one quarter of the glucose used by the body  at rest1. The ...

Deep Brain Stimulation with Simultaneous fMRI in Rodents

Deep Brain Stimulation met gelijktijdige fMRI in Knaagdieren

In order to visualize the global and downstream neuronal responses to deep brain stimulation (DBS) at various targets, we have developed a protocol for ...

Preparation of Neuronal Co-cultures with Single Cell Precision

Voorbereiding van Neuronale Co-culturen met Single Cell Precision

Microfluidic embodiments of the Campenot chamber have attracted great interest from the neuroscience community. These interconnected co-culture platforms ...

Simultaneous Detection of c-Fos Activation from Mesolimbic and Mesocortical Dopamine Reward Sites Following Naive Sugar and Fat Ingestion in Rats

Gelijktijdige detectie van c-Fos Activering van mesolimbic en mesocorticale Dopamine Beloning Sites Na Naive suiker en vet inname bij ratten

This study uses cellular c-fos activation to assess effects of novel ingestion of fat and sugar on brain dopamine (DA) pathways in rats. Intakes of sugars ...

Electrophysiological Method for Whole-cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors

Electrophysiological Method for Whole-cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors

Elektrofysiologische methode voor opname van volledige spanningsklemmen van<em&gt; Drosophila</em&gt; Photoreceptors

Whole-cell voltage clamp recordings from Drosophila melanogaster photoreceptors have revolutionized the field of invertebrate visual transduction, ...

Levator Auris Longus Preparation for Examination of Mammalian Neuromuscular Transmission Under Voltage Clamp Conditions

Levator Auris Longus Preparation for Examination of Mammalian Neuromuscular Transmission Under Voltage Clamp Conditions

Musculus levator Auris Longus Voorbereiding onderzoek van zoogdieren neuromusculaire transmissie Voltage Clamp voorwaarden

This protocol describes a technique to record synaptic transmission from the neuromuscular junction under current-clamp and voltage-clamp conditions. An ...