Name: single cell measurement of dopamine release with simultaneous voltage-clamp and amperometry
Uploaded: 2012-11-21T12:00:00
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Nous remercions le Dr Chirwa Sanika à l&#39;examen critique de ce manuscrit. Ce travail a été soutenu par les Instituts nationaux de la santé (DA026947, DA021471 et NS071122).

1. Matériel et fournitures <ol><li> Monter une cage de Faraday sur le dessus de la table anti-vibration (TMI) pour diminuer le bruit de fond. </li><li> La pince simultanée correctif d&#39;enregistrement ampérométrie système nécessite un microscope inversé avec d&#39;excellentes optiques DIC et une lentille longue distance de travail. Branchez le microscope phare à une batterie de voiture. Cette source de lumière continue pour le système va encore réduire le bruit électrique. </li><li> Micromanipulateurs hy...

<ol>
	<li>Michael, A. C., Ikeda, M., Justice, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+contributing+to+the+recovery+of+striatal+releasable+dopamine+following+MFB+stimulation.">Mechanisms contributing to the recovery of striatal releasable dopamine following MFB stimulation.</a> Brain Res. 421, 325-335 (1987).</li><li>Gonon, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prolonged+and+extrasynaptic+excitatory+action+of+dopamine+mediated+by+D1+receptors+in+the+rat+striatum+in+vivo.">Prolonged and extrasynaptic excitatory action of dopamine mediated by D1 receptors in the rat striatum in vivo.</a> J. Neurosci. 17, 5972-5978 (1997).</li><li>Sulzer, D., Pothos, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+quantal+size+by+presynaptic+mechanisms.">Regulation of quantal size by presynaptic mechanisms.</a> Rev. Neurosci. 11, 159-212 (2000).</li><li>Napolitano, A., Cesura, A. M., Da Prada, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+monoamine+oxidase+and+catechol+O-methyltransferase+in+dopaminergic+neurotransmission.">The role of monoamine oxidase and catechol O-methyltransferase in dopaminergic neurotransmission.</a> J. Neural. Transm. Suppl. 45, 35-45 (1995).</li><li>Sulzer, D., Maidment, N. T., Rayport, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amphetamine+and+other+weak+bases+act+to+promote+reverse+transport+of+dopamine+in+ventral+midbrain+neurons.">Amphetamine and other weak bases act to promote reverse transport of dopamine in ventral midbrain neurons.</a> J. Neurochem. 60, 527-535 (1993).</li><li>Salahpour, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+amphetamine-induced+hyperactivity+and+reward+in+mice+overexpressing+the+dopamine+transporter.">Increased amphetamine-induced hyperactivity and reward in mice overexpressing the dopamine transporter.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 4405-4410 (2008).</li><li>Khoshbouei, H., Wang, H., Lechleiter, J. D., Javitch, J. A., Galli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amphetamine-induced+dopamine+efflux.+A+voltage-sensitive+and+intracellular+Na+-dependent+mechanism.">Amphetamine-induced dopamine efflux. A voltage-sensitive and intracellular Na+-dependent mechanism.</a> J. Biol. Chem. 278, 12070-12077 (2003).</li><li>Goodwin, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amphetamine+and+methamphetamine+differentially+affect+dopamine+transporters+in+vitro+and+in.">Amphetamine and methamphetamine differentially affect dopamine transporters in vitro and in.</a> , 284-2978 (2009).</li><li>Kahlig, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amphetamine+induces+dopamine+efflux+through+a+dopamine+transporter+channel.">Amphetamine induces dopamine efflux through a dopamine transporter channel.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 3495-3500 (2005).</li><li>Swant, J., Chirwa, S., Stanwood, G., Khoshbouei, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methamphetamine+reduces+LTP+and+increases+baseline+synaptic+transmission+in+the+CA1+region+of+mouse+hippocampus.">Methamphetamine reduces LTP and increases baseline synaptic transmission in the CA1 region of mouse hippocampus.</a> PLoS One. 5, e11382 (2010).</li><li>Gnegy, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+Ca2++regulates+amphetamine-induced+dopamine+efflux+and+currents+mediated+by+the+human+dopamine+transporter.">Intracellular Ca2+ regulates amphetamine-induced dopamine efflux and currents mediated by the human dopamine transporter.</a> Mol. Pharmacol. 66, 137-143 (2004).</li></ol>

Simultanée voltage-clamp et ampérométrie présente les avantages suivants. Tous les types de cellules sont accessibles et peuvent être utilisés pour l&#39;enregistrement. L&#39;identification des cellules ou neurones où les enregistrements sont effectués est simple et direct. En particulier, si la cellule est marquée par fluorescence par addition d&#39;un marqueur fluorescent pour la protéine d&#39;intérêt à l&#39;expérimentateur peut facilement sélectionner la cellule cible ou des neurones. La configurati...

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> Équipement </td></tr><tr><td> Anti-vibration table w / cage de Faraday </td><td> Technique Manufacturing Corporation </td><td> 63-500 série </td><td> nous utilisons le modèle 63-543 </td></tr><tr><td> Microscope inversé Nikon TE-2000 </td><td> Nikon </td><td> interrompu </td><td> maintenant Eclipse Ti </td></tr><tr><td> Deux amplificateurs à faible bruit Axopatch 200B </td><td> Molecular Devices </td><td></td><td> 800-635-5577 </td></tr><tr><td> 1-203 CV headstage BU </td><td> Molecular Devices </td><td></td><td> 800-635-5578 </td></tr><tr><td> HL-1-U porte-pipette </td><td> Molecular Devices </td><td></td><td> 800-635-5579 </td></tr><tr><td> Digidata 1440A convertisseur A / N </td><td> Molecular Devices </td><td></td><td> 800-635-5580 </td></tr><tr><td> Deux manipulateurs Siskyou, gaucheet droitier </td><td> Siskiyou </td><td> MX6600R MX6600L </td><td> 877-313-6418 </td></tr><tr><td> Laser pipette extracteur </td><td> Sutter Instruments </td><td> P-2000 </td><td> 888-883-0128 </td></tr><tr><td> Faible bruit de fibres de carbone électrode ampérométrique </td><td> ProCFE </td><td></td><td> <a href="http://www.dagan.com" target="_blank">www.dagan.com</a> </td></tr><tr><td> Faible bruit de quartz pipette </td><td> Sutter Instruments </td><td> QF100-70-7.5 </td><td> 888-883-0128 </td></tr><tr><td> Batterie de voiture de 12 volts </td><td></td><td></td><td> largement disponibles </td></tr><tr><td> Chargeur de batterie de voiture </td><td></td><td></td><td> largement disponibles </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Réactif </td></tr><tr><td> Chlorure de sodium (NaCl) </td><td> Sigma </td><td> S7653 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Sigma </td><td> H3375 </td><td></td></tr><tr><td> Dextrose </td><td> Sigma </td><td> G7528 </td><td></td></tr><tr><td> Le sulfate de magnésium (MgSO 4) </td><td> Sigma </td><td> M2643 </td><td></td></tr><tr><td> Phosphate de potassium monobasique (KH 2 PO 4) </td><td> Sigma </td><td> P5655 </td><td></td></tr><tr><td> Le chlorure de potassium (KCl) </td><td> Sigma </td><td> P9333 </td><td></td></tr><tr><td> Dihydrate de chlorure de calcium (CaCl 2 • 2H 2 0) </td><td> Sigma </td><td> 223506 </td><td></td></tr><tr><td> Hexahydrate de chlorure de magnésium (MgCl 2 • 6H 2 0) </td><td> Sigma </td><td> M2670 </td><td></td></tr><tr><td> EGTA </td><td> Sigma </td><td> E0396 </td><td></td></tr></tbody></table>

single cell measurement of dopamine release with simultaneous voltage-clamp and amperometry

Après sa libération dans la fente synaptique, la dopamine exerce ses propriétés biologiques par l&#39;intermédiaire de ses objectifs pré-et post-synaptique 1. Le signal de la dopamine se termine par la diffusion de 2-3, enzymes extracellulaires 4 et transporteurs membranaires 5. Le transporteur de la dopamine, située dans la fente péri-synaptique des neurones dopaminergiques efface les amines libérées par un flux entrant de dopamine (absorption). Le transporteur de la dopamine peut aussi fonctionner dans le sens inverse pour libérer des amines de l&#39;intérieur vers l&#39;extérieur dans un processus appelé transport vers l&#39;extérieur ou l&#39;efflux de dopamine 5. . Plus de 20 ans, Sulzer et al ont rapporté le transporteur de la dopamine peut fonctionner en deux modes d&#39;activité: avant (absorption) et inverse (efflux) 5. Le neurotransmetteur libéré par efflux par le transporteur peut transporter une grande quantité de dopamine dans l&#39;espace extracellulaire, et il a été montré à jouer un rôle majeur dans la régulation extracellulaire de dopamine homeostasis 6. Nous décrivons ici comment patch-clamp et l&#39;enregistrement simultanés ampérométrie peut être utilisé pour mesurer la dopamine libérée par l&#39;intermédiaire du mécanisme d&#39;efflux avec une résolution temporelle millisecondes lorsque le potentiel de la membrane est contrôlée. Pour cela, l&#39;ensemble de la cellule courante et à l&#39;oxydation (ampérométrique) signaux sont mesurés simultanément en utilisant un amplificateur Axopatch 200B (Molecular Devices, avec un ensemble de Bessel passe-bas du filtre à 1.000 Hz pour l&#39;ensemble des cellules d&#39;enregistrement en cours). Pour l&#39;enregistrement d&#39;une électrode ampérométrique fibre de carbone est reliée à un second amplificateur (200B Axopatch) et est placé à côté de la membrane plasmique et maintenu à +700 mV. Les cellules entières et à l&#39;oxydation (ampérométrique) courants peuvent être enregistrées et la relation courant-tension peut être généré à l&#39;aide d&#39;un protocole échelon de tension. Contrairement à l&#39;étalonnage d&#39;habitude ampérométrique, qui exige la conversion de la concentration, le courant est directement signalé sans tenir compte de la 7 fois le volume efficace. Ainsi, les données qui en résultentreprésentent une limite inférieure à efflux de dopamine parce que certains émetteur est perdu à la solution en vrac.

Patch-clamp combinée avec ampérométrie peut mesurer la tension en fonction de DAT DA induite par efflux. Figure 2A montre une configuration représentative expérimentale et l&#39;enregistrement des DAT DA induite par efflux lorsque le milieu intracellulaire et le potentiel de membrane sont serrées par une pipette de patch de cellule entière. En utilisant cette technique, les cellules exprimant les protéines YFP-DAT sont serrées en tension avec une pipette de patch pendant toute cellule d&#39;une...

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Single Cell Measurement of Dopamine Release with Simultaneous Voltage-clamp and Amperometry

La technique de mesure ampérométrique la libération de dopamine à partir d&#39;une seule cellule en détectant le courant oxydatif produit par oxydation spontanée dopamine. Pince simultanée de la tension et de la méthodologie ampérométrie révéler la relation mécanique entre l&#39;ensemble «activité» du transporteur de la dopamine et le rôle régulateur de l&#39;activité sur le transport inverse de la dopamine.

Mesure Single Cell de la libération de dopamine avec Voltage-clamp simultanée et Amperometry

After its release into the synaptic cleft, dopamine exerts its biological properties via its pre- and post-synaptic targets1. The dopamine signal is ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Functional Mapping with Simultaneous MEG and EEG

Cartographie fonctionnelle avec MEG et EEG simultanée

We use magnetoencephalography (MEG) and electroencephalography (EEG) to locate and determine the temporal evolution in brain areas involved in the ...

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Neurosciences

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Optical Recording of Suprathreshold Neural Activity with Single-cell and Single-spike Resolution

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Électroencéphalographie simultanée, en temps réel Mesure de la concentration de lactate et manipulation optogenetic de l&#39;activité neuronale dans le cortex cérébral des rongeurs

Although the brain represents less than 5% of the body  by mass, it utilizes approximately one quarter of the glucose used by the body  at rest1. The ...

Deep Brain Stimulation with Simultaneous fMRI in Rodents

La stimulation cérébrale profonde avec simultanée IRMf chez les rongeurs

In order to visualize the global and downstream neuronal responses to deep brain stimulation (DBS) at various targets, we have developed a protocol for ...

Preparation of Neuronal Co-cultures with Single Cell Precision

Préparation de neurones co-cultures avec l&#39;unité portable de précision

Microfluidic embodiments of the Campenot chamber have attracted great interest from the neuroscience community. These interconnected co-culture platforms ...

Simultaneous Detection of c-Fos Activation from Mesolimbic and Mesocortical Dopamine Reward Sites Following Naive Sugar and Fat Ingestion in Rats

Détection simultanée de c-Fos Activation de Sites de récompense dopaminergique mésolimbique et mésocortical Après Naive sucre et de graisse Ingestion chez le rat

This study uses cellular c-fos activation to assess effects of novel ingestion of fat and sugar on brain dopamine (DA) pathways in rats. Intakes of sugars ...

Electrophysiological Method for Whole-cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors

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Méthode électrophysiologique pour les enregistrements de la pince à tension intégrale à partir de<em&gt; Drosophila</em&gt; Photorécepteurs

Whole-cell voltage clamp recordings from Drosophila melanogaster photoreceptors have revolutionized the field of invertebrate visual transduction, ...

Levator Auris Longus Preparation for Examination of Mammalian Neuromuscular Transmission Under Voltage Clamp Conditions

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Levator Auris Longus Préparation pour l’examen de la Transmission neuromusculaire mammifères dans des Conditions de tension de serrage

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