Name: single cell measurement of dopamine release with simultaneous voltage-clamp and amperometry
Uploaded: 2012-11-21T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single Cell Measurement of Dopamine Release with Simultaneous Voltage-clamp and Amperometry at JoVE.com

Wir danken Dr. Sanika Chirwa für die kritische Durchsicht des Manuskripts. Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health (DA026947, DA021471 und NS071122) unterstützt.

Ein. Ausstattung und Zubehör <ol><li> Montieren Sie einen Faraday-Käfig auf dem Anti-Vibrations-Tabelle (TMI), um die Hintergrundgeräusche zu verringern. </li><li> Die gleichzeitige Patch-Clamp-Amperometrie Aufzeichnungssystem erfordert eine inverse Mikroskop mit exzellenter DIC Optik und einem langen Arbeitstag Abstand Linse. Schließen Sie das Mikroskop Leuchtturm an eine Autobatterie. Dieser DC-Lichtquelle für das System weiter sinken die elektrisches Rauschen. </li><li> Hydraulische Mikromanipulatoren (Siskiyo...

<ol>
	<li>Michael, A. C., Ikeda, M., Justice, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+contributing+to+the+recovery+of+striatal+releasable+dopamine+following+MFB+stimulation.">Mechanisms contributing to the recovery of striatal releasable dopamine following MFB stimulation.</a> Brain Res. 421, 325-335 (1987).</li><li>Gonon, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prolonged+and+extrasynaptic+excitatory+action+of+dopamine+mediated+by+D1+receptors+in+the+rat+striatum+in+vivo.">Prolonged and extrasynaptic excitatory action of dopamine mediated by D1 receptors in the rat striatum in vivo.</a> J. Neurosci. 17, 5972-5978 (1997).</li><li>Sulzer, D., Pothos, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+quantal+size+by+presynaptic+mechanisms.">Regulation of quantal size by presynaptic mechanisms.</a> Rev. Neurosci. 11, 159-212 (2000).</li><li>Napolitano, A., Cesura, A. M., Da Prada, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+monoamine+oxidase+and+catechol+O-methyltransferase+in+dopaminergic+neurotransmission.">The role of monoamine oxidase and catechol O-methyltransferase in dopaminergic neurotransmission.</a> J. Neural. Transm. Suppl. 45, 35-45 (1995).</li><li>Sulzer, D., Maidment, N. T., Rayport, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amphetamine+and+other+weak+bases+act+to+promote+reverse+transport+of+dopamine+in+ventral+midbrain+neurons.">Amphetamine and other weak bases act to promote reverse transport of dopamine in ventral midbrain neurons.</a> J. Neurochem. 60, 527-535 (1993).</li><li>Salahpour, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+amphetamine-induced+hyperactivity+and+reward+in+mice+overexpressing+the+dopamine+transporter.">Increased amphetamine-induced hyperactivity and reward in mice overexpressing the dopamine transporter.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 4405-4410 (2008).</li><li>Khoshbouei, H., Wang, H., Lechleiter, J. D., Javitch, J. A., Galli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amphetamine-induced+dopamine+efflux.+A+voltage-sensitive+and+intracellular+Na+-dependent+mechanism.">Amphetamine-induced dopamine efflux. A voltage-sensitive and intracellular Na+-dependent mechanism.</a> J. Biol. Chem. 278, 12070-12077 (2003).</li><li>Goodwin, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amphetamine+and+methamphetamine+differentially+affect+dopamine+transporters+in+vitro+and+in.">Amphetamine and methamphetamine differentially affect dopamine transporters in vitro and in.</a> , 284-2978 (2009).</li><li>Kahlig, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amphetamine+induces+dopamine+efflux+through+a+dopamine+transporter+channel.">Amphetamine induces dopamine efflux through a dopamine transporter channel.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 3495-3500 (2005).</li><li>Swant, J., Chirwa, S., Stanwood, G., Khoshbouei, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methamphetamine+reduces+LTP+and+increases+baseline+synaptic+transmission+in+the+CA1+region+of+mouse+hippocampus.">Methamphetamine reduces LTP and increases baseline synaptic transmission in the CA1 region of mouse hippocampus.</a> PLoS One. 5, e11382 (2010).</li><li>Gnegy, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+Ca2++regulates+amphetamine-induced+dopamine+efflux+and+currents+mediated+by+the+human+dopamine+transporter.">Intracellular Ca2+ regulates amphetamine-induced dopamine efflux and currents mediated by the human dopamine transporter.</a> Mol. Pharmacol. 66, 137-143 (2004).</li></ol>

Gleichzeitige Voltage-Clamp und Amperometrie hat die folgenden Vorteile. Alle Zelltypen sind zugänglich und können zur Aufzeichnung verwendet werden. Die Identifizierung der Zellen oder Neuronen, wo die Aufnahmen gemacht ist einfach und unkompliziert. Insbesondere, wenn die Zelle durch Hinzufügen eines fluoreszenzmarkierten fluoreszierende Markierung auf das Protein von Interesse markiert der Experimentator kann problemlos das Zielzelle oder Neurons. Der experimentelle Aufbau ermöglicht eine gleichmäßige und kontr...

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> Ausrüstung </td></tr><tr><td> Anti-Vibrations-Tabelle w / Faradayschen Käfig </td><td> Technische Manufacturing Corporation </td><td> 63-500 Serie </td><td> verwenden wir Modell 63-543 </td></tr><tr><td> Inverses Mikroskop Nikon TE-2000 </td><td> Nikon </td><td> abgebrochen </td><td> Jetzt Eclipse-Ti </td></tr><tr><td> Zwei rauscharmen Verstärkern Axopatch 200b </td><td> Molecular Devices </td><td></td><td> 800-635-5577 </td></tr><tr><td> 1-CV 203 BU Headstage </td><td> Molecular Devices </td><td></td><td> 800-635-5578 </td></tr><tr><td> 1-HL-U Pipettenhalter </td><td> Molecular Devices </td><td></td><td> 800-635-5579 </td></tr><tr><td> Digidata 1440A A / D-Wandler </td><td> Molecular Devices </td><td></td><td> 800-635-5580 </td></tr><tr><td> Zwei Manipulatoren Siskyou, linksund Rechtshänder </td><td> Siskiyou </td><td> MX6600R MX6600L </td><td> 877-313-6418 </td></tr><tr><td> Laser Pipette puller </td><td> Sutter Instruments </td><td> P-2000 </td><td> 888-883-0128 </td></tr><tr><td> Rauscharme Kohlefaser amperometrischen Elektrode </td><td> ProCFE </td><td></td><td> <a href="http://www.dagan.com" target="_blank">www.dagan.com</a> </td></tr><tr><td> Rauscharme Quarz Pipette </td><td> Sutter Instruments </td><td> QF100-70-7,5 </td><td> 888-883-0128 </td></tr><tr><td> 12-Volt-Autobatterie </td><td></td><td></td><td> weithin verfügbar </td></tr><tr><td> Autobatterie-Ladegerät </td><td></td><td></td><td> weithin verfügbar </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Reagens </td></tr><tr><td> Natriumchlorid (NaCl) </td><td> Sigma </td><td> S7653 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Sigma </td><td> H3375 </td><td></td></tr><tr><td> Traubenzucker </td><td> Sigma </td><td> G7528 </td><td></td></tr><tr><td> Magnesiumsulfat (MgSO 4) </td><td> Sigma </td><td> M2643 </td><td></td></tr><tr><td> Kaliumphosphat einbasischen (KH 2 PO 4) </td><td> Sigma </td><td> P5655 </td><td></td></tr><tr><td> Kaliumchlorid (KCl) </td><td> Sigma </td><td> P9333 </td><td></td></tr><tr><td> Calciumchloriddihydrat (CaCl 2 • 2H 2 0) </td><td> Sigma </td><td> 223506 </td><td></td></tr><tr><td> Magnesiumchlorid-Hexahydrat (MgCl 2 • 6H 2 0) </td><td> Sigma </td><td> M2670 </td><td></td></tr><tr><td> EGTA </td><td> Sigma </td><td> E0396 </td><td></td></tr></tbody></table>

single cell measurement of dopamine release with simultaneous voltage-clamp and amperometry

Nach seiner Freilassung in den synaptischen Spalt, Dopamin übt seine biologischen Eigenschaften über seine Pre-und Post-synaptischen Ziele 1. Die Dopamin-Signal wird durch Diffusion 2-3, extrazelluläre Enzyme 4 und Membrantransportern 5 beendet. Die Dopamin-Transporter in der peri-synaptischen Spalt von Dopamin-Neuronen angeordnet löscht die freigesetzten Amine durch eine nach innen Dopamin Flusses (Uptake). Die Dopamin-Transporter kann auch in umgekehrter Richtung arbeiten, um Amine von innen nach außen freigeben in einem Prozess namens Abtransport oder Efflux von Dopamin 5. . Mehr als 20 Jahren Sulzer et al berichtete die Dopamin-Transporter kann in zwei Modi der Tätigkeit zu betreiben: forward (Aufnahme) und rückwärts (Efflux) 5. Der Neurotransmitter über Efflux durch den Transporteur freigesetzt werden eine große Menge an Dopamin in den extrazellulären Raum bewegen, und hat gezeigt, dass eine große regulatorische Rolle der extrazellulären Dopamin h spielenomeostasis 6. Hier beschreiben wir, wie die gleichzeitige Patch-Clamp-und Amperometrie Aufzeichnung verwendet werden, um veröffentlicht Dopamin über den Effluxmechanismen mit Millisekunden Zeitauflösung, wenn das Membranpotential gesteuert wird messen. Hierzu werden Ganzzell-Strom und oxidative (amperometrisch) Signale gleichzeitig unter Verwendung eines Axopatch 200B Verstärkers (Molecular Devices, mit einer Tiefpaß-Bessel-Filter Satz bei 1000 Hz für Ganzzell-Strom-Aufzeichnung) gemessen. Für Amperometrie Aufzeichnen eines Kohlenstofffaser-Elektrode ist mit einem zweiten Verstärker (Axopatch 200B) verbunden ist und angrenzend und in die Plasmamembran bei +700 mV gehalten. Die Ganzzell-und oxidativen (amperometrische) Ströme können aufgezeichnet werden und die Strom-Spannungs-Beziehung kann mit Hilfe einer Spannung Schritt-Protokoll. Im Gegensatz zu der üblichen amperometrischen Kalibrierung, die Umwandlung in Konzentration erfordert, wird der Strom direkt ohne Berücksichtigung des effektiven Volumens 7 berichtet. Somit werden die resultierenden Datenstellen eine untere Grenze zu Dopamin Efflux weil einige Sender zu dem Schüttgut-Lösung verloren geht.

Kombinierte Patch Clamp mit Amperometrie messen kann spannungsabhängigen DAT-vermittelte DA Efflux. 2A zeigt eine repräsentative experimentellen Konfiguration und Aufzeichnung der DAT-vermittelte DA Efflux wenn der intrazellulären Milieu und das Membranpotential durch ein Whole-Cell-Patch-Pipette eingespannt sind. Mit dieser Technik sind Zellen exprimieren YFP-DAT Proteine ​​spannungsgesteuerten eingespannt mit einem Ganzzell Patch-Pipette, während eine amperometrische Elektrode auf der Plasmame...

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Single Cell Measurement of Dopamine Release with Simultaneous Voltage-clamp and Amperometry

Der amperometrische Technik misst Dopamin-Freisetzung aus einer einzelnen Zelle durch Detektieren der aktuellen durch spontane oxidative Dopamin Oxidation produziert. Gleichzeitige Voltage-Clamp und Amperometrie Methodik zeigen die mechanistische Beziehung zwischen der Gesamt-Wertung &quot;Aktivität&quot; Dopamin-Transporter und die regulatorische Rolle dieser Aktivität auf den Rücktransport von Dopamin.

Single Cell Messung der Freisetzung von Dopamin mit gleichzeitiger Voltage-Clamp-und Amperometry

After its release into the synaptic cleft, dopamine exerts its biological properties via its pre- and post-synaptic targets1. The dopamine signal is ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Functional Mapping with Simultaneous MEG and EEG

Functional Mapping mit Simultaneous MEG und EEG

We use magnetoencephalography (MEG) and electroencephalography (EEG) to locate and determine the temporal evolution in brain areas involved in the ...

Forschung

Neurowissenschaften

Presynaptic Dopamine Dynamics in Striatal Brain Slices with Fast-scan Cyclic Voltammetry

Präsynaptische Dynamics in striatalen Hirnschnitten mit Fast-Scan-Cyclovoltammetrie

Extensive research has focused on the neurotransmitter dopamine because of its importance in the mechanism of action of drugs of abuse (e.g. cocaine and ...

Single-cell Profiling of Developing and Mature Retinal Neurons

Einzel-Zell-Profiling der Entwicklung und Reife Netzhautneuronen

Highly specialized, but exceedingly small populations of cells play important roles in many tissues. The identification of cell-type specific markers and ...

Optical Recording of Suprathreshold Neural Activity with Single-cell and Single-spike Resolution

Optische Aufnahme überschwellige neuronale Aktivität mit Single-Cell-und Single-Spike Auflösung

Signaling of information in the vertebrate central nervous system is often carried by populations of neurons rather than individual neurons. Also ...

Simultaneous Electroencephalography, Real-time Measurement of Lactate Concentration and Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity in the Rodent Cerebral Cortex

Gleichzeitige Elektroenzephalographie, Real-time Messung der Laktat-Konzentration und optogenetische Manipulation der neuronalen Aktivität in der Nagetier Cerebral Cortex

Although the brain represents less than 5% of the body  by mass, it utilizes approximately one quarter of the glucose used by the body  at rest1. The ...

Deep Brain Stimulation with Simultaneous fMRI in Rodents

Deep Brain Stimulation mit gleichzeitiger fMRT in Nagetiere

In order to visualize the global and downstream neuronal responses to deep brain stimulation (DBS) at various targets, we have developed a protocol for ...

Preparation of Neuronal Co-cultures with Single Cell Precision

Vorbereitung der neuronalen Co-Kulturen mit Single Cell Precision

Microfluidic embodiments of the Campenot chamber have attracted great interest from the neuroscience community. These interconnected co-culture platforms ...

Simultaneous Detection of c-Fos Activation from Mesolimbic and Mesocortical Dopamine Reward Sites Following Naive Sugar and Fat Ingestion in Rats

Gleichzeitige Detektion von c-Fos Aktivierung von mesolimbischen und mesocorticalen Dopamine Belohnung Seiten Nach Naive Zucker und Fett Verschlucken in Ratten

This study uses cellular c-fos activation to assess effects of novel ingestion of fat and sugar on brain dopamine (DA) pathways in rats. Intakes of sugars ...

Electrophysiological Method for Whole-cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors

Electrophysiological Method for Whole-cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors

Elektrophysiologische Methode für Ganzzell-Spannungsklemmen Aufnahmen von<em&gt; Drosophila</em&gt; Fotorezeptoren

Whole-cell voltage clamp recordings from Drosophila melanogaster photoreceptors have revolutionized the field of invertebrate visual transduction, ...

Levator Auris Longus Preparation for Examination of Mammalian Neuromuscular Transmission Under Voltage Clamp Conditions

Levator Auris Longus Preparation for Examination of Mammalian Neuromuscular Transmission Under Voltage Clamp Conditions

Levator Auris Longus Prüfungsvorbereitung der Säugetier-neuromuskulären Übertragung unter Spannung Klemme Bedingungen

This protocol describes a technique to record synaptic transmission from the neuromuscular junction under current-clamp and voltage-clamp conditions. An ...