Name: single cell measurement of dopamine release with simultaneous voltage-clamp and amperometry
Uploaded: 2012-11-21T12:00:00
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Ringraziamo il Dott. Sanika Chirwa per la revisione critica di questo manoscritto. Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health (DA026947, DA021471 e NS071122).

1. Attrezzature e Forniture <ol><li> Montare una gabbia di Faraday sopra il tavolo antivibrazione (TMI) per diminuire il rumore di fondo. </li><li> La simultanea patch clamp sistema amperometria di controllo richiede un microscopio invertito con eccellenti ottiche DIC e una lente lunga distanza di lavoro. Collegare il microscopio faro di una batteria per auto. Questa sorgente luminosa DC per il sistema diminuirà ulteriormente il rumore elettrico. </li><li> Micromanipolatori idraulici (Siskiyou) ulteriore riduzione de...

<ol>
	<li>Michael, A. C., Ikeda, M., Justice, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+contributing+to+the+recovery+of+striatal+releasable+dopamine+following+MFB+stimulation.">Mechanisms contributing to the recovery of striatal releasable dopamine following MFB stimulation.</a> Brain Res. 421, 325-335 (1987).</li><li>Gonon, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prolonged+and+extrasynaptic+excitatory+action+of+dopamine+mediated+by+D1+receptors+in+the+rat+striatum+in+vivo.">Prolonged and extrasynaptic excitatory action of dopamine mediated by D1 receptors in the rat striatum in vivo.</a> J. Neurosci. 17, 5972-5978 (1997).</li><li>Sulzer, D., Pothos, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+quantal+size+by+presynaptic+mechanisms.">Regulation of quantal size by presynaptic mechanisms.</a> Rev. Neurosci. 11, 159-212 (2000).</li><li>Napolitano, A., Cesura, A. M., Da Prada, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+monoamine+oxidase+and+catechol+O-methyltransferase+in+dopaminergic+neurotransmission.">The role of monoamine oxidase and catechol O-methyltransferase in dopaminergic neurotransmission.</a> J. Neural. Transm. Suppl. 45, 35-45 (1995).</li><li>Sulzer, D., Maidment, N. T., Rayport, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amphetamine+and+other+weak+bases+act+to+promote+reverse+transport+of+dopamine+in+ventral+midbrain+neurons.">Amphetamine and other weak bases act to promote reverse transport of dopamine in ventral midbrain neurons.</a> J. Neurochem. 60, 527-535 (1993).</li><li>Salahpour, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+amphetamine-induced+hyperactivity+and+reward+in+mice+overexpressing+the+dopamine+transporter.">Increased amphetamine-induced hyperactivity and reward in mice overexpressing the dopamine transporter.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 4405-4410 (2008).</li><li>Khoshbouei, H., Wang, H., Lechleiter, J. D., Javitch, J. A., Galli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amphetamine-induced+dopamine+efflux.+A+voltage-sensitive+and+intracellular+Na+-dependent+mechanism.">Amphetamine-induced dopamine efflux. A voltage-sensitive and intracellular Na+-dependent mechanism.</a> J. Biol. Chem. 278, 12070-12077 (2003).</li><li>Goodwin, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amphetamine+and+methamphetamine+differentially+affect+dopamine+transporters+in+vitro+and+in.">Amphetamine and methamphetamine differentially affect dopamine transporters in vitro and in.</a> , 284-2978 (2009).</li><li>Kahlig, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amphetamine+induces+dopamine+efflux+through+a+dopamine+transporter+channel.">Amphetamine induces dopamine efflux through a dopamine transporter channel.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 3495-3500 (2005).</li><li>Swant, J., Chirwa, S., Stanwood, G., Khoshbouei, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methamphetamine+reduces+LTP+and+increases+baseline+synaptic+transmission+in+the+CA1+region+of+mouse+hippocampus.">Methamphetamine reduces LTP and increases baseline synaptic transmission in the CA1 region of mouse hippocampus.</a> PLoS One. 5, e11382 (2010).</li><li>Gnegy, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+Ca2++regulates+amphetamine-induced+dopamine+efflux+and+currents+mediated+by+the+human+dopamine+transporter.">Intracellular Ca2+ regulates amphetamine-induced dopamine efflux and currents mediated by the human dopamine transporter.</a> Mol. Pharmacol. 66, 137-143 (2004).</li></ol>

Simultanea voltage-clamp e amperometria offre i seguenti vantaggi. Tutti i tipi cellulari sono accessibili e possono essere utilizzati per la registrazione. L&#39;identificazione delle cellule o dei neuroni in cui sono fatte le registrazioni è semplice e lineare. In particolare, se la cella è marcato in modo fluorescente aggiungendo un tag fluorescente per la proteina di interesse sperimentatore può facilmente selezionare la cella di destinazione o neurone. La configurazione sperimentale consente un&#39;erogazione un...

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> Attrezzatura </td></tr><tr><td> Anti-vibrazione tavolo w / gabbia di Faraday </td><td> Tecnico Manufacturing Corporation </td><td> 63-500 serie </td><td> usiamo il modello 63-543 </td></tr><tr><td> Microscopio invertito Nikon TE-2000 </td><td> Nikon </td><td> interrotto </td><td> ora Eclipse Ti </td></tr><tr><td> Due amplificatori a basso rumore axopatch 200b </td><td> Molecular Devices </td><td></td><td> 800-635-5577 </td></tr><tr><td> 1-203 CV BU headstage </td><td> Molecular Devices </td><td></td><td> 800-635-5578 </td></tr><tr><td> 1-HL-U pipetta titolare </td><td> Molecular Devices </td><td></td><td> 800-635-5579 </td></tr><tr><td> Digidata 1440A convertitore A / D </td><td> Molecular Devices </td><td></td><td> 800-635-5580 </td></tr><tr><td> Due manipolatori Siskyou, a sinistrae la mano destra </td><td> Siskiyou </td><td> MX6600R MX6600L </td><td> 877-313-6418 </td></tr><tr><td> Laser pipetta estrattore </td><td> Sutter Instruments </td><td> P-2000 </td><td> 888-883-0128 </td></tr><tr><td> Bassa rumorosità in fibra di carbonio elettrodo amperometrico </td><td> ProCFE </td><td></td><td> <a href="http://www.dagan.com" target="_blank">www.dagan.com</a> </td></tr><tr><td> Bassa rumorosità quarzo pipetta </td><td> Sutter Instruments </td><td> QF100-70-7,5 </td><td> 888-883-0128 </td></tr><tr><td> 12 volt batteria auto </td><td></td><td></td><td> ampiamente disponibili </td></tr><tr><td> Caricabatterie per auto </td><td></td><td></td><td> ampiamente disponibili </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Reagente </td></tr><tr><td> Cloruro di sodio (NaCl) </td><td> Sigma </td><td> S7653 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Sigma </td><td> H3375 </td><td></td></tr><tr><td> Destrosio </td><td> Sigma </td><td> G7528 </td><td></td></tr><tr><td> Solfato di magnesio (MgSO4) </td><td> Sigma </td><td> M2643 </td><td></td></tr><tr><td> Potassio fosfato monobasico (KH 2 PO 4) </td><td> Sigma </td><td> P5655 </td><td></td></tr><tr><td> Cloruro di potassio (KCl) </td><td> Sigma </td><td> P9333 </td><td></td></tr><tr><td> Calcio cloruro diidrato (CaCl 2 • 2H 2 0) </td><td> Sigma </td><td> 223506 </td><td></td></tr><tr><td> Magnesio cloruro esaidrato (MgCl 2 • 6H 2 0) </td><td> Sigma </td><td> M2670 </td><td></td></tr><tr><td> EGTA </td><td> Sigma </td><td> E0396 </td><td></td></tr></tbody></table>

single cell measurement of dopamine release with simultaneous voltage-clamp and amperometry

Dopo il suo rilascio nella fessura sinaptica, la dopamina esercita le sue proprietà biologiche attraverso i suoi obiettivi di pre-e post-sinaptica 1. Il segnale dopamina è terminata da diffusione 2-3, enzimi extracellulari 4, e trasportatori di membrana 5. Il trasportatore della dopamina, che si trova nel peri-sinaptico dei neuroni dopaminergici cancella le ammine rilasciate attraverso un flusso di dopamina verso l&#39;interno (assorbimento). Il trasportatore della dopamina può funzionare anche in senso inverso per liberare ammine dall&#39;interno verso l&#39;esterno in un processo chiamato di trasporto verso l&#39;esterno o l&#39;efflusso di dopamina 5. . Più di 20 anni fa Sulzer et al hanno riportato il trasportatore della dopamina può operare in due modi di attività: in avanti (assorbimento) e la retromarcia (efflusso) 5. Il neurotrasmettitore rilasciato tramite efflusso attraverso il trasportatore può spostare una grande quantità di dopamina nello spazio extracellulare, e ha dimostrato di giocare un ruolo importante nella regolamentazione dopamina extracellulare homeostasi 6. Qui si descrive come patch clamp e registrazione simultanee amperometria può essere utilizzato per misurare dopamina rilasciata attraverso il meccanismo di flusso con risoluzione temporale millisecondo quando il potenziale di membrana è controllata. Per questo, cellule intere correnti e ossidativo (amperometrico) segnali sono misurati simultaneamente utilizzando un amplificatore Axopatch 200B (Molecular Devices, con un passa-basso insieme filtro di Bessel a 1.000 Hz per cellula intera registrazione corrente). Per amperometria registrazione di un elettrodo in fibra di carbonio è collegato ad un secondo amplificatore (Axopatch 200B) ed è posto adiacente alla membrana plasmatica e mantenuto a 700 mV. Le cellule intere e ossidativo (amperometrico) correnti possono essere registrati e la relazione corrente-tensione possono essere generati utilizzando un protocollo di tensione di fase. A differenza della calibrazione solita amperometrico, che richiede la conversione alla concentrazione, la corrente viene riportato direttamente senza considerare il 7 effettivo volume. Così, i dati risultantirappresentano un limite inferiore di efflusso dopamina perché alcuni trasmettitore è perso alla soluzione bulk.

Patch clamp combinato con amperometria può misurare tensione-dipendente DAT-mediata DA efflusso. Figura 2A mostra una configurazione rappresentativa sperimentale e registrazione DAT-mediata DA efflusso quando l&#39;ambiente intracellulare e il potenziale di membrana sono serrati da una cellula intera pipette patch. Usando questa tecnica, cellule esprimenti YFP-DAT proteine ​​sono in tensione fissata con una pipetta intero cerotto cellule mentre un elettrodo amperometrico viene posto sulla membrana ...

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Single Cell Measurement of Dopamine Release with Simultaneous Voltage-clamp and Amperometry

La tecnica di misura amperometrico il rilascio di dopamina da una singola cellula rilevando la corrente ossidativo prodotta per ossidazione spontanea dopamina. Morsetto di tensione simultanea e la metodologia amperometria rivelano il rapporto meccanicistico tra il generale &quot;attività&quot; del trasportatore della dopamina e il ruolo di regolamentazione di questa attività sul trasporto inverso di dopamina.

Cella di misura singola di rilascio di dopamina con simultanea di tensione-clamp e Amperometria

After its release into the synaptic cleft, dopamine exerts its biological properties via its pre- and post-synaptic targets1. The dopamine signal is ...

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