Name: single cell measurement of dopamine release with simultaneous voltage-clamp and amperometry
Uploaded: 2012-11-21T12:00:00
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Agradecemos ao Dr. Sanika Chirwa para revisão crítica do manuscrito. Este trabalho foi financiado pelo National Institutes of Health (DA026947, DA021471, e NS071122).

1. Equipamentos e Suprimentos <ol><li> Montar uma gaiola de Faraday em cima da mesa de vibração anti (TMI) para diminuir o ruído de fundo. </li><li> O simultânea patch clamp sistema de gravação amperometria requer um microscópio invertido com excelentes óptica DIC e uma lente de longa distância de trabalho. Ligue o microscópio farol para uma bateria de carro. Esta fonte de luz DC para o sistema irá reduzir ainda mais o ruído eléctrico. </li><li> Micromanipuladores hidráulicos (Siskiyou) nova redução de...

<ol>
	<li>Michael, A. C., Ikeda, M., Justice, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+contributing+to+the+recovery+of+striatal+releasable+dopamine+following+MFB+stimulation.">Mechanisms contributing to the recovery of striatal releasable dopamine following MFB stimulation.</a> Brain Res. 421, 325-335 (1987).</li><li>Gonon, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prolonged+and+extrasynaptic+excitatory+action+of+dopamine+mediated+by+D1+receptors+in+the+rat+striatum+in+vivo.">Prolonged and extrasynaptic excitatory action of dopamine mediated by D1 receptors in the rat striatum in vivo.</a> J. Neurosci. 17, 5972-5978 (1997).</li><li>Sulzer, D., Pothos, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+quantal+size+by+presynaptic+mechanisms.">Regulation of quantal size by presynaptic mechanisms.</a> Rev. Neurosci. 11, 159-212 (2000).</li><li>Napolitano, A., Cesura, A. M., Da Prada, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+monoamine+oxidase+and+catechol+O-methyltransferase+in+dopaminergic+neurotransmission.">The role of monoamine oxidase and catechol O-methyltransferase in dopaminergic neurotransmission.</a> J. Neural. Transm. Suppl. 45, 35-45 (1995).</li><li>Sulzer, D., Maidment, N. T., Rayport, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amphetamine+and+other+weak+bases+act+to+promote+reverse+transport+of+dopamine+in+ventral+midbrain+neurons.">Amphetamine and other weak bases act to promote reverse transport of dopamine in ventral midbrain neurons.</a> J. Neurochem. 60, 527-535 (1993).</li><li>Salahpour, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+amphetamine-induced+hyperactivity+and+reward+in+mice+overexpressing+the+dopamine+transporter.">Increased amphetamine-induced hyperactivity and reward in mice overexpressing the dopamine transporter.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 4405-4410 (2008).</li><li>Khoshbouei, H., Wang, H., Lechleiter, J. D., Javitch, J. A., Galli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amphetamine-induced+dopamine+efflux.+A+voltage-sensitive+and+intracellular+Na+-dependent+mechanism.">Amphetamine-induced dopamine efflux. A voltage-sensitive and intracellular Na+-dependent mechanism.</a> J. Biol. Chem. 278, 12070-12077 (2003).</li><li>Goodwin, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amphetamine+and+methamphetamine+differentially+affect+dopamine+transporters+in+vitro+and+in.">Amphetamine and methamphetamine differentially affect dopamine transporters in vitro and in.</a> , 284-2978 (2009).</li><li>Kahlig, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amphetamine+induces+dopamine+efflux+through+a+dopamine+transporter+channel.">Amphetamine induces dopamine efflux through a dopamine transporter channel.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 3495-3500 (2005).</li><li>Swant, J., Chirwa, S., Stanwood, G., Khoshbouei, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methamphetamine+reduces+LTP+and+increases+baseline+synaptic+transmission+in+the+CA1+region+of+mouse+hippocampus.">Methamphetamine reduces LTP and increases baseline synaptic transmission in the CA1 region of mouse hippocampus.</a> PLoS One. 5, e11382 (2010).</li><li>Gnegy, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+Ca2++regulates+amphetamine-induced+dopamine+efflux+and+currents+mediated+by+the+human+dopamine+transporter.">Intracellular Ca2+ regulates amphetamine-induced dopamine efflux and currents mediated by the human dopamine transporter.</a> Mol. Pharmacol. 66, 137-143 (2004).</li></ol>

Simultânea de tensão-clamp e amperometria tem os seguintes benefícios. Todos os tipos de células são acessíveis e podem ser utilizados para a gravação. A identificação das células neuronais ou onde as gravações são feitas é simples e directa. Em particular, se a célula é marcado por fluorescência por adição de um marcador fluorescente para a proteína de interesse, o experimentador pode facilmente seleccionar a célula alvo ou neuronal. A configuração experimental permite a distribuição uniforme ...

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> Equipamento </td></tr><tr><td> Anti-vibração tabela w / gaiola de Faraday </td><td> Técnico Manufacturing Corporation </td><td> 63-500 série </td><td> usamos modelo 63-543 </td></tr><tr><td> Invertido microscópio Nikon TE-2000 </td><td> Nikon </td><td> descontinuada </td><td> agora Eclipse Ti </td></tr><tr><td> Dois amplificadores de baixo ruído axopatch 200b </td><td> Molecular Devices </td><td></td><td> 800-635-5577 </td></tr><tr><td> Um andar de entrada 203-CV BU </td><td> Molecular Devices </td><td></td><td> 800-635-5578 </td></tr><tr><td> HL-1-U titular pipeta </td><td> Molecular Devices </td><td></td><td> 800-635-5579 </td></tr><tr><td> Digidata 1440A conversor A / D </td><td> Molecular Devices </td><td></td><td> 800-635-5580 </td></tr><tr><td> Dois manipuladores Siskyou, deixarame destro </td><td> Siskiyou </td><td> MX6600R MX6600L </td><td> 877-313-6418 </td></tr><tr><td> Laser pipeta extrator </td><td> Sutter Instruments </td><td> P-2000 </td><td> 888-883-0128 </td></tr><tr><td> Baixo ruído do eletrodo de fibra de carbono amperométrico </td><td> ProCFE </td><td></td><td> <a href="http://www.dagan.com" target="_blank">www.dagan.com</a> </td></tr><tr><td> Baixo ruído de quartzo pipeta </td><td> Sutter Instruments </td><td> QF100-70-7,5 </td><td> 888-883-0128 </td></tr><tr><td> 12-volts bateria de carro </td><td></td><td></td><td> amplamente disponíveis </td></tr><tr><td> Carregador de bateria automotora </td><td></td><td></td><td> amplamente disponíveis </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Reagente </td></tr><tr><td> Cloreto de sódio (NaCl) </td><td> Sigma </td><td> S7653 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Sigma </td><td> H3375 </td><td></td></tr><tr><td> Dextrose </td><td> Sigma </td><td> G7528 </td><td></td></tr><tr><td> Sulfato de magnésio (MgSO 4) </td><td> Sigma </td><td> M2643 </td><td></td></tr><tr><td> Fosfato de potássio monobásico (KH 2 PO 4) </td><td> Sigma </td><td> P5655 </td><td></td></tr><tr><td> Cloreto de potássio (KCl) </td><td> Sigma </td><td> P9333 </td><td></td></tr><tr><td> Di-hidrato de cloreto de cálcio (CaCl 2 • 2H 2 0) </td><td> Sigma </td><td> 223506 </td><td></td></tr><tr><td> Hexa-hidrato de cloreto de magnésio (MgCl2 • 6H 2 0) </td><td> Sigma </td><td> M2670 </td><td></td></tr><tr><td> EGTA </td><td> Sigma </td><td> E0396 </td><td></td></tr></tbody></table>

single cell measurement of dopamine release with simultaneous voltage-clamp and amperometry

Depois de sua libertação para o sináptica de dopamina fissura, exerce suas propriedades biológicas através de suas metas pré-e pós-sináptica 1. O sinal de dopamina é terminada por difusão 2-3, enzimas extracelulares 4, e transportadores de membrana 5. O transportador de dopamina, localizado na fenda peri-sináptica dos neurônios dopaminérgicos limpa as aminas liberados através de um fluxo de dopamina para dentro (captação). O transportador de dopamina pode também funcionar no sentido inverso para libertar aminas a partir de dentro para fora, num processo denominado de transporte para o exterior ou o efluxo de dopamina 5. . Mais de 20 anos atrás Sulzer et al relataram o transportador de dopamina pode funcionar em dois modos de atividade: para frente (captação) e reverso (efluxo) 5. O neurotransmissor libertado através de efluxo através do transportador pode deslocar uma grande quantidade de dopamina para o espaço extracelular, e tem sido demonstrado que desempenham um papel importante na regulação da dopamina extracelular homeostasis 6. Aqui descreve-se como patch clamp e gravação simultânea amperometria pode ser usado para medir a dopamina libertada através do mecanismo de efluxo com resolução de milissegundos do tempo em que o potencial de membrana é controlado. Por isso, células inteiras actuais e oxidativa (amperométrico) sinais são medidos simultaneamente utilizando um amplificador Axopatch 200B (Molecular Devices, com um filtro passa-conjunto de filtros de Bessel de 1.000 Hz para gravação de células inteiras de corrente). Para a gravação de um amperometria eléctrodo de fibra de carbono está ligado a um segundo amplificador (Axopatch 200B), e é colocado adjacente à membrana de plasma e mantido a 700 mV. As células inteiras e oxidativa (amperométrico) as correntes podem ser registados e a relação de corrente-tensão pode ser gerado utilizando um protocolo de passo de tensão. Ao contrário da calibração habitual amperométrico, que requer a conversão de concentração, a corrente é relatado directamente sem ter em conta o volume de 7 eficaz. Assim, os dados resultantesrepresentar um limite inferior para o efluxo de dopamina porque alguns transmissor é perdido para a solução a granel.

Patch clamp combinado com amperometria pode medir a voltagem-dependente mediada DAT DA efluxo 2A. Figura mostra uma configuração experimental representativo e gravação de DAT mediada DA efluxo quando o meio intracelular e o potencial de membrana são fixadas por uma pipeta de remendo de células inteiras. Utilizando esta técnica, as células que expressam proteínas de YFP-DAT são voltagem fixa com uma pipeta de células inteiras remendo enquanto um eléctrodo amperométrico é colocada sobre a me...

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Single Cell Measurement of Dopamine Release with Simultaneous Voltage-clamp and Amperometry

A técnica amperométrica mede a libertação de dopamina a partir de uma única célula, detectando a corrente de oxidante produzido pela oxidação da dopamina espontânea. Braçadeira de tensão simultânea e metodologia amperometria revelar a relação mecanicista entre a &quot;atividade&quot; geral do transportador de dopamina eo papel regulador da atividade no transporte reverso da dopamina.

Medição única célula de liberação de dopamina com simultânea de tensão-clamp e amperometria

After its release into the synaptic cleft, dopamine exerts its biological properties via its pre- and post-synaptic targets1. The dopamine signal is ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Functional Mapping with Simultaneous MEG and EEG

Mapeamento funcional com MEG e EEG em simultâneo

We use magnetoencephalography (MEG) and electroencephalography (EEG) to locate and determine the temporal evolution in brain areas involved in the ...

Neurociência

Presynaptic Dopamine Dynamics in Striatal Brain Slices with Fast-scan Cyclic Voltammetry

Pré-sináptica de dopamina Dynamics em fatias de cérebro estriado com Fast-scan voltametria cíclica

Extensive research has focused on the neurotransmitter dopamine because of its importance in the mechanism of action of drugs of abuse (e.g. cocaine and ...

Single-cell Profiling of Developing and Mature Retinal Neurons

De uma única célula perfil de imaturos e maduros neurônios da retina

Highly specialized, but exceedingly small populations of cells play important roles in many tissues. The identification of cell-type specific markers and ...

Optical Recording of Suprathreshold Neural Activity with Single-cell and Single-spike Resolution

A gravação ótica da atividade neural supraliminares com resolução de uma única célula e um único pico

Signaling of information in the vertebrate central nervous system is often carried by populations of neurons rather than individual neurons. Also ...

Simultaneous Electroencephalography, Real-time Measurement of Lactate Concentration and Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity in the Rodent Cerebral Cortex

Eletroencefalografia simultânea, em tempo real de medição da concentração de lactato e Manipulação optogenética da atividade neuronal do córtex cerebral de roedores

Although the brain represents less than 5% of the body  by mass, it utilizes approximately one quarter of the glucose used by the body  at rest1. The ...

Deep Brain Stimulation with Simultaneous fMRI in Rodents

Estimulação Cerebral Profunda com fMRI simultâneo em Roedores

In order to visualize the global and downstream neuronal responses to deep brain stimulation (DBS) at various targets, we have developed a protocol for ...

Preparation of Neuronal Co-cultures with Single Cell Precision

Preparação de Neuronal co-culturas com precisão única célula

Microfluidic embodiments of the Campenot chamber have attracted great interest from the neuroscience community. These interconnected co-culture platforms ...

Simultaneous Detection of c-Fos Activation from Mesolimbic and Mesocortical Dopamine Reward Sites Following Naive Sugar and Fat Ingestion in Rats

Detecção simultânea de c-Fos Ativação de mesolímbico e mesocortical dopamina Sites Recompensa Após Naive açúcar e gordura ingestão em ratos

This study uses cellular c-fos activation to assess effects of novel ingestion of fat and sugar on brain dopamine (DA) pathways in rats. Intakes of sugars ...

Electrophysiological Method for Whole-cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors

Electrophysiological Method for Whole-cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors

Método eletrofisiológico para gravações de tensão de célula inteira de<em&gt; Drosophila</em&gt; Fotorreceptores

Whole-cell voltage clamp recordings from Drosophila melanogaster photoreceptors have revolutionized the field of invertebrate visual transduction, ...

Levator Auris Longus Preparation for Examination of Mammalian Neuromuscular Transmission Under Voltage Clamp Conditions

Levator Auris Longus Preparation for Examination of Mammalian Neuromuscular Transmission Under Voltage Clamp Conditions

Músculo levantador Auris Longus Preparação para exame da transmissão Neuromuscular mamíferos sob condições de grampo de tensão

This protocol describes a technique to record synaptic transmission from the neuromuscular junction under current-clamp and voltage-clamp conditions. An ...