Name: single cell measurement of dopamine release with simultaneous voltage-clamp and amperometry
Uploaded: 2012-11-21T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single Cell Measurement of Dopamine Release with Simultaneous Voltage-clamp and Amperometry at JoVE.com

Vi tackar Dr Sanika Chirwa för kritisk granskning av detta manuskript. Detta arbete stöddes av National Institutes of Health (DA026947, DA021471 och NS071122).

1. Utrustning och tillbehör <ol><li> Montera en Faradays bur ovanpå anti vibrationsbord (TMI) att minska bakgrundsbruset. </li><li> Den samtidiga patch clamp amperometri inspelning kräver ett inverterat mikroskop med utmärkt DIC optik och en lång arbetsdag avstånd lins. Anslut mikroskopet fyr till ett bilbatteri. Denna DC-ljuskälla för systemet kommer att ytterligare minska elektriskt brus. </li><li> Hydrauliska mikromanipulatorer (Siskiyou) ytterligare minskning buller. I vår konfiguration använder vi en h?...

<ol>
	<li>Michael, A. C., Ikeda, M., Justice, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+contributing+to+the+recovery+of+striatal+releasable+dopamine+following+MFB+stimulation.">Mechanisms contributing to the recovery of striatal releasable dopamine following MFB stimulation.</a> Brain Res. 421, 325-335 (1987).</li><li>Gonon, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prolonged+and+extrasynaptic+excitatory+action+of+dopamine+mediated+by+D1+receptors+in+the+rat+striatum+in+vivo.">Prolonged and extrasynaptic excitatory action of dopamine mediated by D1 receptors in the rat striatum in vivo.</a> J. Neurosci. 17, 5972-5978 (1997).</li><li>Sulzer, D., Pothos, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+quantal+size+by+presynaptic+mechanisms.">Regulation of quantal size by presynaptic mechanisms.</a> Rev. Neurosci. 11, 159-212 (2000).</li><li>Napolitano, A., Cesura, A. M., Da Prada, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+monoamine+oxidase+and+catechol+O-methyltransferase+in+dopaminergic+neurotransmission.">The role of monoamine oxidase and catechol O-methyltransferase in dopaminergic neurotransmission.</a> J. Neural. Transm. Suppl. 45, 35-45 (1995).</li><li>Sulzer, D., Maidment, N. T., Rayport, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amphetamine+and+other+weak+bases+act+to+promote+reverse+transport+of+dopamine+in+ventral+midbrain+neurons.">Amphetamine and other weak bases act to promote reverse transport of dopamine in ventral midbrain neurons.</a> J. Neurochem. 60, 527-535 (1993).</li><li>Salahpour, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+amphetamine-induced+hyperactivity+and+reward+in+mice+overexpressing+the+dopamine+transporter.">Increased amphetamine-induced hyperactivity and reward in mice overexpressing the dopamine transporter.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 4405-4410 (2008).</li><li>Khoshbouei, H., Wang, H., Lechleiter, J. D., Javitch, J. A., Galli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amphetamine-induced+dopamine+efflux.+A+voltage-sensitive+and+intracellular+Na+-dependent+mechanism.">Amphetamine-induced dopamine efflux. A voltage-sensitive and intracellular Na+-dependent mechanism.</a> J. Biol. Chem. 278, 12070-12077 (2003).</li><li>Goodwin, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amphetamine+and+methamphetamine+differentially+affect+dopamine+transporters+in+vitro+and+in.">Amphetamine and methamphetamine differentially affect dopamine transporters in vitro and in.</a> , 284-2978 (2009).</li><li>Kahlig, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amphetamine+induces+dopamine+efflux+through+a+dopamine+transporter+channel.">Amphetamine induces dopamine efflux through a dopamine transporter channel.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 3495-3500 (2005).</li><li>Swant, J., Chirwa, S., Stanwood, G., Khoshbouei, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methamphetamine+reduces+LTP+and+increases+baseline+synaptic+transmission+in+the+CA1+region+of+mouse+hippocampus.">Methamphetamine reduces LTP and increases baseline synaptic transmission in the CA1 region of mouse hippocampus.</a> PLoS One. 5, e11382 (2010).</li><li>Gnegy, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+Ca2++regulates+amphetamine-induced+dopamine+efflux+and+currents+mediated+by+the+human+dopamine+transporter.">Intracellular Ca2+ regulates amphetamine-induced dopamine efflux and currents mediated by the human dopamine transporter.</a> Mol. Pharmacol. 66, 137-143 (2004).</li></ol>

Samtidig spänning-klämma och amperometri har följande fördelar. Alla celltyper är tillgängliga och kan användas för inspelning. Identifieringen av cellerna eller neuron där inspelningarna görs är enkel och okomplicerad. I synnerhet, om cellen är fluorescensmärkta genom tillsats av en fluorescerande markör till proteinet av intresse försöksledaren kan enkelt välja målcellen eller neuron. Den experimentella utformningen medger jämn och kontrollerad tillförsel av farmakologiska medel antingen via fläck...

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> Utrustning </td></tr><tr><td> Vibrationsdämpande bord w / Faradays bur </td><td> Tekniska Manufacturing Corporation </td><td> 63-500 serien </td><td> vi använder model 63-543 </td></tr><tr><td> Inverterat mikroskop Nikon TE-2000 </td><td> Nikon </td><td> avbrytas </td><td> nu Eclipse Ti </td></tr><tr><td> Två lågbrusförstärkare Axopatch 200b </td><td> Molecular Devices </td><td></td><td> 800-635-5577 </td></tr><tr><td> 1-CV 203 BU huvudsteg </td><td> Molecular Devices </td><td></td><td> 800-635-5578 </td></tr><tr><td> 1-HL-U pipetthållare </td><td> Molecular Devices </td><td></td><td> 800-635-5579 </td></tr><tr><td> Digidata 1440A A / D-omvandlare </td><td> Molecular Devices </td><td></td><td> 800-635-5580 </td></tr><tr><td> Två manipulatorer Siskyou, kvaroch högerhänt </td><td> Siskiyou </td><td> MX6600R MX6600L </td><td> 877-313-6418 </td></tr><tr><td> Laser pipett avdragare </td><td> Sutter Instrument </td><td> P-2000 </td><td> 888-883-0128 </td></tr><tr><td> Låg ljudnivå kolfiber amperometrisk elektrod </td><td> ProCFE </td><td></td><td> <a href="http://www.dagan.com" target="_blank">www.dagan.com</a> </td></tr><tr><td> Låg ljudnivå kvarts pipett </td><td> Sutter Instrument </td><td> QF100-70-7,5 </td><td> 888-883-0128 </td></tr><tr><td> 12-volts bilbatteri </td><td></td><td></td><td> allmänt tillgängliga </td></tr><tr><td> Bil batteriladdare </td><td></td><td></td><td> allmänt tillgängliga </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Reagens </td></tr><tr><td> Natriumklorid (NaCl) </td><td> Sigma </td><td> S7653 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Sigma </td><td> H3375 </td><td></td></tr><tr><td> Dextros </td><td> Sigma </td><td> G7528 </td><td></td></tr><tr><td> Magnesiumsulfat (MgSO 4) </td><td> Sigma </td><td> M2643 </td><td></td></tr><tr><td> Kalium monobasisk (KH 2 PO 4) </td><td> Sigma </td><td> P5655 </td><td></td></tr><tr><td> Kaliumklorid (KCl) </td><td> Sigma </td><td> P9333 </td><td></td></tr><tr><td> Kalciumkloriddihydrat (CaCb 2 • 2H 2 0) </td><td> Sigma </td><td> 223.506 </td><td></td></tr><tr><td> Magnesiumkloridhexahydrat (MgCl 2 • 6H 2 0) </td><td> Sigma </td><td> M2670 </td><td></td></tr><tr><td> EGTA </td><td> Sigma </td><td> E0396 </td><td></td></tr></tbody></table>

single cell measurement of dopamine release with simultaneous voltage-clamp and amperometry

Efter dess release i synaptiska klyftan, dopamin utövar sina biologiska egenskaper via sina pre-och postsynaptiska mål 1. Dopamin signalen avslutas genom diffusion 2-3, extracellulära enzymer 4 och transportörer membran 5. Dopamin transportör, som ligger i den peri-synaptiska klyftan av dopaminneuroner rensar de frigjorda aminer genom en inre dopamin flöde (upptag). Den dopamintransportörer kan också arbeta i motsatt riktning för att frigöra aminer från insidan till utsidan på en process som kallas yttre transport eller utflöde av dopamin 5. . Mer än 20 år sedan Sulzer et al rapporterade dopamin transportören kan arbeta i två lägen Verksamhetsområde: framåt (upptag) och omvänd (efflux) 5. Signalsubstansen frigörs via utflöde genom transportören kan flytta en stor mängd dopamin till det extracellulära utrymmet, och har visat sig spela en viktig reglerande roll i extracellulärt dopamin timomeostasis 6. Här beskriver vi hur samtidig patch clamp och amperometri inspelning kan användas för att mäta ut dopamin via effluxmekanism med millisekunders tidsupplösning när membranpotentialen styrs. För detta är hel-cell nuvarande och oxidativ (amperometriska) signaler mätas samtidigt med en Axopatch 200B förstärkare (Molecular Devices, med en låg-pass Besselfiltrets inställd på 1.000 Hz för helcell-aktuell inspelning). För amperometri inspelning en elektrod kolfiber är ansluten till en andra förstärkare (Axopatch 200B) och är placerad intill plasmamembranet och hölls vid 700 mV. De hel-cell-och oxidativ (amperometriska) strömmar kan registreras och ström-spänning relation kan genereras med hjälp av en spänning steg protokoll. Till skillnad från den vanliga amperometriska kalibrering, vilket kräver omvandling till koncentration, visas den aktuella redovisas direkt utan hänsyn till faktiska volymen 7. Således resulterande datautgör en undre gräns till dopamin utflöde eftersom vissa sändaren förlorade mot bulklösningen.

Kombinerad patch clamp med amperometri kan mäta spänningsberoende DAT-medierad DA utflöde. Figur 2A visar ett representativt experimentell konfiguration och inspelning av DAT-medierad DA utflöde när den intracellulära miljön och membranpotentialen kläms av en hel-cell patch-pipett. Med användning av denna teknik, celler som uttrycker YFP-DAT proteiner är spännings-fastklämd med en hel cell patch-pipett medan en amperometrisk elektrod placeras på plasmamembranet (fig. 2A). H...

Watch this Scientific Journal Video about Single Cell Measurement of Dopamine Release with Simultaneous Voltage-clamp and Amperometry at JoVE.com

Single Cell Measurement of Dopamine Release with Simultaneous Voltage-clamp and Amperometry

Den amperometriska tekniken mäter dopaminfrisättning från en enda cell genom att detektera den oxidativa ström som produceras av spontan dopamin oxidation. Samtidig spänning klämma och amperometri metodik avslöjar mekanistiska förhållandet mellan den totala &quot;aktivitet&quot; av dopamin transportören och reglerande roll denna aktivitet på baksidan transport av dopamin.

Encelliga Mätning av dopaminfrisättning med samtidig Spänning-klämma och amperometri

After its release into the synaptic cleft, dopamine exerts its biological properties via its pre- and post-synaptic targets1. The dopamine signal is ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Functional Mapping with Simultaneous MEG and EEG

Funktionell kartläggning med samtidig MEG och EEG

We use magnetoencephalography (MEG) and electroencephalography (EEG) to locate and determine the temporal evolution in brain areas involved in the ...

Presynaptic Dopamine Dynamics in Striatal Brain Slices with Fast-scan Cyclic Voltammetry

Presynaptisk dopamin Dynamics i striatum hjärnan skivor med Fast-scan Cykliska Voltammetry

Extensive research has focused on the neurotransmitter dopamine because of its importance in the mechanism of action of drugs of abuse (e.g. cocaine and ...

Single-cell Profiling of Developing and Mature Retinal Neurons

Encelliga Profilering av u och mogen näthinneneuroner

Highly specialized, but exceedingly small populations of cells play important roles in many tissues. The identification of cell-type specific markers and ...

Optical Recording of Suprathreshold Neural Activity with Single-cell and Single-spike Resolution

Optisk inspelning av suprathreshold neural aktivitet med encelliga och single-spik upplösning

Signaling of information in the vertebrate central nervous system is often carried by populations of neurons rather than individual neurons. Also ...

Simultaneous Electroencephalography, Real-time Measurement of Lactate Concentration and Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity in the Rodent Cerebral Cortex

Samtidig Elektroencefalografi, realtidsmätning av laktat koncentration och optogenetic Manipulering av neuronal aktivitet hos gnagare Cerebral Cortex

Although the brain represents less than 5% of the body  by mass, it utilizes approximately one quarter of the glucose used by the body  at rest1. The ...

Deep Brain Stimulation with Simultaneous fMRI in Rodents

Deep Brain Stimulation med samtidig fMRI i Gnagare

In order to visualize the global and downstream neuronal responses to deep brain stimulation (DBS) at various targets, we have developed a protocol for ...

Preparation of Neuronal Co-cultures with Single Cell Precision

Beredning av Neuronal Co-kulturer med Single Cell Precision

Microfluidic embodiments of the Campenot chamber have attracted great interest from the neuroscience community. These interconnected co-culture platforms ...

Simultaneous Detection of c-Fos Activation from Mesolimbic and Mesocortical Dopamine Reward Sites Following Naive Sugar and Fat Ingestion in Rats

Samtidig detektion av c-Fos Aktivering från mesolimbiska och Mesocortical dopamin belöning webbplatser Efter Naive socker och fett Förtäring i råttor

This study uses cellular c-fos activation to assess effects of novel ingestion of fat and sugar on brain dopamine (DA) pathways in rats. Intakes of sugars ...

Electrophysiological Method for Whole-cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors

Electrophysiological Method for Whole-cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors

Elektrofysiologisk metod för helcells spänningskläminspelningar från<em&gt; Drosophila</em&gt; Photoreceptors

Whole-cell voltage clamp recordings from Drosophila melanogaster photoreceptors have revolutionized the field of invertebrate visual transduction, ...

Levator Auris Longus Preparation for Examination of Mammalian Neuromuscular Transmission Under Voltage Clamp Conditions

Levator Auris Longus Preparation for Examination of Mammalian Neuromuscular Transmission Under Voltage Clamp Conditions

Levator Auris Longus Förberedelse för undersökning av däggdjur neuromuskulär Transmission spänningen klämman villkor

This protocol describes a technique to record synaptic transmission from the neuromuscular junction under current-clamp and voltage-clamp conditions. An ...