Name: single cell measurement of dopamine release with simultaneous voltage-clamp and amperometry
Uploaded: 2012-11-21T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single Cell Measurement of Dopamine Release with Simultaneous Voltage-clamp and Amperometry at JoVE.com

Biz bu elyazmasının eleştirel yaklaşım Dr Sanika Chirwa ederim. Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri (DA026947, DA021471 ve NS071122) tarafından desteklenmiştir.

1. Ekipman ve Malzemeleri <ol><li> Arka plan gürültüsünü azaltmak için anti-vibrasyon tablosu (TMI) üstüne bir Faraday kafesi monte edin. </li><li> Eşzamanlı yama klemp amperometri kayıt sistemi mükemmel DIC optik ve uzun bir çalışma mesafesi lensi ile bir inverted mikroskop gerektirir. Bir araba aküsüne feneri mikroskop bağlayın. Bu sistem için DC ışık kaynağı daha fazla elektriksel gürültüyü azaltır. </li><li> Hidrolik mikromanipülatörler (Siskiyou) daha azalma gürültü. Bizim yapı...

<ol>
	<li>Michael, A. C., Ikeda, M., Justice, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+contributing+to+the+recovery+of+striatal+releasable+dopamine+following+MFB+stimulation.">Mechanisms contributing to the recovery of striatal releasable dopamine following MFB stimulation.</a> Brain Res. 421, 325-335 (1987).</li><li>Gonon, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prolonged+and+extrasynaptic+excitatory+action+of+dopamine+mediated+by+D1+receptors+in+the+rat+striatum+in+vivo.">Prolonged and extrasynaptic excitatory action of dopamine mediated by D1 receptors in the rat striatum in vivo.</a> J. Neurosci. 17, 5972-5978 (1997).</li><li>Sulzer, D., Pothos, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+quantal+size+by+presynaptic+mechanisms.">Regulation of quantal size by presynaptic mechanisms.</a> Rev. Neurosci. 11, 159-212 (2000).</li><li>Napolitano, A., Cesura, A. M., Da Prada, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+monoamine+oxidase+and+catechol+O-methyltransferase+in+dopaminergic+neurotransmission.">The role of monoamine oxidase and catechol O-methyltransferase in dopaminergic neurotransmission.</a> J. Neural. Transm. Suppl. 45, 35-45 (1995).</li><li>Sulzer, D., Maidment, N. T., Rayport, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amphetamine+and+other+weak+bases+act+to+promote+reverse+transport+of+dopamine+in+ventral+midbrain+neurons.">Amphetamine and other weak bases act to promote reverse transport of dopamine in ventral midbrain neurons.</a> J. Neurochem. 60, 527-535 (1993).</li><li>Salahpour, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+amphetamine-induced+hyperactivity+and+reward+in+mice+overexpressing+the+dopamine+transporter.">Increased amphetamine-induced hyperactivity and reward in mice overexpressing the dopamine transporter.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 4405-4410 (2008).</li><li>Khoshbouei, H., Wang, H., Lechleiter, J. D., Javitch, J. A., Galli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amphetamine-induced+dopamine+efflux.+A+voltage-sensitive+and+intracellular+Na+-dependent+mechanism.">Amphetamine-induced dopamine efflux. A voltage-sensitive and intracellular Na+-dependent mechanism.</a> J. Biol. Chem. 278, 12070-12077 (2003).</li><li>Goodwin, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amphetamine+and+methamphetamine+differentially+affect+dopamine+transporters+in+vitro+and+in.">Amphetamine and methamphetamine differentially affect dopamine transporters in vitro and in.</a> , 284-2978 (2009).</li><li>Kahlig, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amphetamine+induces+dopamine+efflux+through+a+dopamine+transporter+channel.">Amphetamine induces dopamine efflux through a dopamine transporter channel.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 3495-3500 (2005).</li><li>Swant, J., Chirwa, S., Stanwood, G., Khoshbouei, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methamphetamine+reduces+LTP+and+increases+baseline+synaptic+transmission+in+the+CA1+region+of+mouse+hippocampus.">Methamphetamine reduces LTP and increases baseline synaptic transmission in the CA1 region of mouse hippocampus.</a> PLoS One. 5, e11382 (2010).</li><li>Gnegy, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+Ca2++regulates+amphetamine-induced+dopamine+efflux+and+currents+mediated+by+the+human+dopamine+transporter.">Intracellular Ca2+ regulates amphetamine-induced dopamine efflux and currents mediated by the human dopamine transporter.</a> Mol. Pharmacol. 66, 137-143 (2004).</li></ol>

Eşzamanlı voltaj-klemp ve amperometri aşağıdaki faydaları vardır. Tüm hücre tipleri tarafından erişilebilir ve kayıt için kullanılabilir. Kayıtları yapılır hücreleri veya nöronun tespiti basit ve anlaşılırdır. Hücre floresan ilgili proteini ile bir floresan etiket ekleyerek işaretli olarak, özellikle deneyi kolaylıkla hedef hücre ya da nöron seçebilir. Konfigürasyonu deneysel yama pipet yoluyla, veya banyo solüsyonu 10, bu ajanların ilave edilerek ya da farmakolojik ajanlar i...

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> Ekipman </td></tr><tr><td> Anti-titreşim tablo w / faraday kafesi </td><td> Teknik İmalat Corporation </td><td> 63-500 serisi </td><td> biz modeli 63-543 kullanın </td></tr><tr><td> Ters mikroskop Nikon TE-2000 </td><td> Nikon </td><td> üretilmiyor </td><td> şimdi Eclipse Ti </td></tr><tr><td> İki düşük gürültülü yükselteçler axopatch 200b </td><td> Molecular Devices </td><td></td><td> 800-635-5577 </td></tr><tr><td> 1-CV 203 BU headstage </td><td> Molecular Devices </td><td></td><td> 800-635-5578 </td></tr><tr><td> 1-HL-U pipet tutucu </td><td> Molecular Devices </td><td></td><td> 800-635-5579 </td></tr><tr><td> Digidata 1440A A / D dönüştürücü </td><td> Molecular Devices </td><td></td><td> 800-635-5580 </td></tr><tr><td> İki manipülatörler Siskyou, solve sağ teslim </td><td> Siskiyou </td><td> MX6600R MX6600L </td><td> 877-313-6418 </td></tr><tr><td> Lazer pipet çektirmesi </td><td> Sutter Aletleri </td><td> P-2000 </td><td> 888-883-0128 </td></tr><tr><td> Düşük gürültü karbon fiber amperometrik elektrot </td><td> ProCFE </td><td></td><td> <a href="http://www.dagan.com" target="_blank">www.dagan.com</a> </td></tr><tr><td> Düşük gürültü kuvars pipet </td><td> Sutter Aletleri </td><td> QF100-70-7,5 </td><td> 888-883-0128 </td></tr><tr><td> 12-volt araç aküsü </td><td></td><td></td><td> yaygın olarak kullanılabilir </td></tr><tr><td> Araç şarj cihazı </td><td></td><td></td><td> yaygın olarak kullanılabilir </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Reaktif </td></tr><tr><td> Sodyum klorür (NaCl) </td><td> Sigma </td><td> S7653 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Sigma </td><td> H3375 </td><td></td></tr><tr><td> Üzüm şekeri </td><td> Sigma </td><td> G7528 </td><td></td></tr><tr><td> Magnezyum sülfat (MgSO4) </td><td> Sigma </td><td> M2643 </td><td></td></tr><tr><td> Potasyum fosfat tekbazlı (KH 2 PO 4) </td><td> Sigma </td><td> P5655 </td><td></td></tr><tr><td> Potasyum klorür (KCl) </td><td> Sigma </td><td> P9333 </td><td></td></tr><tr><td> Kalsiyum klorür dihidrat (CaCl2 • 2H 2 0) </td><td> Sigma </td><td> 223506 </td><td></td></tr><tr><td> Magnezyum klorür hekzahidrat (MgCl2 • 6H 2 0) </td><td> Sigma </td><td> M2670 </td><td></td></tr><tr><td> EGTA </td><td> Sigma </td><td> E0396 </td><td></td></tr></tbody></table>

single cell measurement of dopamine release with simultaneous voltage-clamp and amperometry

Sinaptik aralıkta dopamin içine yayımlanmasından sonra onun öncesi ve post-sinaptik hedeflere 1 yoluyla biyolojik özelliklerini uygular. Dopamin sinyali difüzyon 2-3, ekstraselüler enzimler 4, ve membran taşıyıcıları 5 ile sonlandırılır. Dopamin nöronlarının peri-sinaptik aralıkta bulunan dopamin taşıyıcısı, bir içe dopamin akı (uptake) aracılığıyla serbest aminler temizler. Dopamin taşıyıcısı da dışa aktarım veya dopamin 5 efflux denilen bir süreçle içeriden dışarıya aminler serbest ters yönde çalışabilir. . Ileri (uptake) ve ters (effluks) 5: daha 20 yıl önce Sulzer ark dopamin taşıyıcısı iki faaliyet modlarında çalışabilir bildirdi. Taşıyıcı aracılığıyla akış üzerinden serbest nörotransmitter olan hücre dışı alanı için dopamin büyük bir miktarı hareket edebilir, ve hücre dışı dopamin saat içinde önemli düzenleyici bir rol oynadığı görülmüştüromeostasis 6. Burada simultane yama kelepçe ve amperometri kayıt membran potansiyeli denetlenir milisaniyelik zaman çözünürlüğü ile effluks mekanizması yoluyla serbest dopamin ölçmek için nasıl kullanılabileceğini açıklar. Bunun için, tüm-hücre akım ve oksidatif (amperometrik) sinyalleri bir Axopatch 200B amplifikatör (Moleküler Cihazlar, tam hücreli geçerli kayıt için 1.000 Hz bir alçak geçiren Bessel filtre seti ile) kullanılarak eş zamanlı olarak ölçülür. Bir karbon fiber elektrot kayıt amperometri, ikinci bir amplifikatör (Axopatch 200B) bağlı olan ve plazma zarına bitişik yerleştirilen ve +700 mV tutulur için. Tüm-hücre ve oksidatif (amperometrik) akımları kaydedilebilir ve akım-voltaj ilişkisi bir voltaj adımı protokol kullanılarak oluşturulabilir. Konsantrasyon ile dönüştürülmesini gerektirir olağan amperometrik kalibrasyon aksine, mevcut etkin hacmi 7 dikkate alınmadan hemen rapor edilir. Bu nedenle, sonuçta elde edilen verilerBazı verici toplu çözüm için kaybolur, çünkü dopamin efflux bir alt limit temsil eder.

Amperometri Kombine yama klemp voltaj bağımlı DAT-aracılı DA effluks. Şekil 2A intraselüler ortam ve membran potansiyeli tam hücreli yama pipet ile kenetlenir DAT-aracılı DA effluks temsilcisi deney yapılandırma ve kayıt gösterir ölçebilirsiniz. Bu tekniği kullanarak, YFP-DAT proteinleri ifade hücreleri olan gerilim-kenetlenmiş bir amperometrik elektrot plazma zarı (Şekil 2A) üzerine alınırken bir bütün hücre yama pipet ile. Bütün hücre elektrot 2 mM DA iht...

Watch this Scientific Journal Video about Single Cell Measurement of Dopamine Release with Simultaneous Voltage-clamp and Amperometry at JoVE.com

Single Cell Measurement of Dopamine Release with Simultaneous Voltage-clamp and Amperometry

Amperometrik tekniği spontan dopamin oksitlenmeye tarafından üretilen oksidatif akımı algılayarak tek bir hücreden dopamin salınımını ölçer. Eşzamanlı gerilim kelepçe ve amperometri metodolojisi dopamin taşıyıcısı ve dopamin ters taşıma Bu faaliyetin düzenleyici rolünün genel &quot;faaliyet&quot; arasındaki mekanistik ilişki bulunmaktadır.

Eşzamanlı Gerilim-kelepçe ve Amperometri ile Dopamin Film Tek Hücre Ölçümü

After its release into the synaptic cleft, dopamine exerts its biological properties via its pre- and post-synaptic targets1. The dopamine signal is ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Functional Mapping with Simultaneous MEG and EEG

Eşzamanlı MEG ve EEG Fonksiyonel Haritalama

We use magnetoencephalography (MEG) and electroencephalography (EEG) to locate and determine the temporal evolution in brain areas involved in the ...

Nörobilim

Presynaptic Dopamine Dynamics in Striatal Brain Slices with Fast-scan Cyclic Voltammetry

Hızlı tarama Cyclic Voltametri striatal Beyin Slices presinaptik dopamin Dinamiği

Extensive research has focused on the neurotransmitter dopamine because of its importance in the mechanism of action of drugs of abuse (e.g. cocaine and ...

Single-cell Profiling of Developing and Mature Retinal Neurons

Gelişen ve Olgun Retina Nöronlar Tek hücreli Profilleme

Highly specialized, but exceedingly small populations of cells play important roles in many tissues. The identification of cell-type specific markers and ...

Optical Recording of Suprathreshold Neural Activity with Single-cell and Single-spike Resolution

Tek hücreli ve tek başak çözünürlüğe sahip supratreshold nöral aktivitenin Optik kaydı

Signaling of information in the vertebrate central nervous system is often carried by populations of neurons rather than individual neurons. Also ...

Simultaneous Electroencephalography, Real-time Measurement of Lactate Concentration and Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity in the Rodent Cerebral Cortex

Eşzamanlı Elektroensefalografi, Kemirgen Serebral Korteks Laktat Konsantrasyonu ve Nöronal Faaliyet Optogenetic Manipülasyon Gerçek zamanlı ölçüm

Although the brain represents less than 5% of the body  by mass, it utilizes approximately one quarter of the glucose used by the body  at rest1. The ...

Deep Brain Stimulation with Simultaneous fMRI in Rodents

Kemirgenler Eşzamanlı fMRI ile derin beyin stimülasyonu

In order to visualize the global and downstream neuronal responses to deep brain stimulation (DBS) at various targets, we have developed a protocol for ...

Preparation of Neuronal Co-cultures with Single Cell Precision

Tek Hücre Hassas Nevronik Co-kültürler hazırlanması

Microfluidic embodiments of the Campenot chamber have attracted great interest from the neuroscience community. These interconnected co-culture platforms ...

Simultaneous Detection of c-Fos Activation from Mesolimbic and Mesocortical Dopamine Reward Sites Following Naive Sugar and Fat Ingestion in Rats

Sıçanlar Naif Şeker ve Yağ Yeme ardından mezolimbik ve mezokortikal Dopamin Ödül Siteleri c-Fos Aktivasyon Eşzamanlı Algılama

This study uses cellular c-fos activation to assess effects of novel ingestion of fat and sugar on brain dopamine (DA) pathways in rats. Intakes of sugars ...

Electrophysiological Method for Whole-cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors

Electrophysiological Method for Whole-cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors

Tam Hücreli Gerilim Kelepçesi Kayıtları için Elektrofizyolojik Yöntem<em&gt; Drosophila</emPhotoreceptors

Whole-cell voltage clamp recordings from Drosophila melanogaster photoreceptors have revolutionized the field of invertebrate visual transduction, ...

Levator Auris Longus Preparation for Examination of Mammalian Neuromuscular Transmission Under Voltage Clamp Conditions

Levator Auris Longus Preparation for Examination of Mammalian Neuromuscular Transmission Under Voltage Clamp Conditions

Levator Auris Longus Gerilim kelepçe koşullar altında memeli nöromuskuler iletim Sınavı Hazırlık

This protocol describes a technique to record synaptic transmission from the neuromuscular junction under current-clamp and voltage-clamp conditions. An ...