Name: fluorescence-microscopy screening and next-generation sequencing: useful tools for the identification of genes involved in organelle integrity
Uploaded: 2012-04-13T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fluorescence-microscopy Screening and Next-generation Sequencing: Useful Tools for the Identification of Genes Involved in Organelle Integrity at JoVE.com

אנו מכירים תמיכה על ידי למדעי הכימיה, Geosciences ו Biosciences החטיבה, משרד האנרגיה של יסוד מדעי, משרד המדע, משרד האנרגיה של ארה&quot;ב (מספר הפרס DE-FG02-91ER20021) ואת הקרן הלאומית למדע (MCB 0948584) (FB). אנו אסירי תודה על קרן בירד גב לעריכה את כתב היד.

1. EMS טיפול זרעים thaliana ארבידופסיס הם mutagenized משתמש כמו sulfonate mutagen אתיל מתאן סוכן (EMS) 3,4, אשר מעוררת את ה-C-ל-T משתנה הגנום וכתוצאה מכך C / G ל T / A מוטציות 5-7. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוקל 0.8 גרם זרעי ?...

<ol>
	<li>Marti, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+missense+mutation+in+the+vacuolar+protein+GOLD36+causes+organizational+defects+in+the+ER+and+aberrant+protein+trafficking+in+the+plant+secretory+pathway.">A missense mutation in the vacuolar protein GOLD36 causes organizational defects in the ER and aberrant protein trafficking in the plant secretory pathway.</a> The Plant journal : for cell and molecular biology. 63, 901-913 (2010).</li><li>Stefano, G., Renna, L., Moss, T., McNew, J., Brandizzi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+the+spatial+and+dynamic+organization+of+the+endoplasmic+reticulum+and+Golgi+apparatus+is+influenced+by+the+integrity+of+the+c-terminal+domain+of+RHD3,+a+non-essential+GTPase.">Arabidopsis the spatial and dynamic organization of the endoplasmic reticulum and Golgi apparatus is influenced by the integrity of the c-terminal domain of RHD3, a non-essential GTPase.</a> The Plant Journal. , (2011).</li><li>Kim, Y., Schumaker, K. S., Zhu, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EMS+mutagenesis+of+Arabidopsis.">EMS mutagenesis of Arabidopsis.</a> Methods in molecular biology. 323, 101-103 (2006).</li><li>Maple, J., Moller, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutagenesis+in+Arabidopsis.">Mutagenesis in Arabidopsis.</a> Methods in molecular biology. 362, 197-206 (2007).</li><li>Greene, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectrum+of+chemically+induced+mutations+from+a+large-scale+reverse-genetic+screen+in+Arabidopsis.">Spectrum of chemically induced mutations from a large-scale reverse-genetic screen in Arabidopsis.</a> Genetics. 164, 731-740 (2003).</li><li>Krieg, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethyl+methanesulfonate-induced+reversion+of+bacteriophage+T4rII+mutants.">Ethyl methanesulfonate-induced reversion of bacteriophage T4rII mutants.</a> Genetics. 48, 561-580 (1963).</li><li>Kovalchuk, I., Kovalchuk, O., Hohn, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+variation+of+the+somatic+mutation+frequency+in+transgenic+plants.">Genome-wide variation of the somatic mutation frequency in transgenic plants.</a> The EMBO journal. 19, 4431-4438 (2000).</li><li>Boulaflous, A., Faso, C., Brandizzi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering+the+Golgi+apparatus:+from+imaging+to+genes.">Deciphering the Golgi apparatus: from imaging to genes.</a> Traffic. 9, 1613-1617 (2008).</li><li>Borevitz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genotyping+and+mapping+with+high-density+oligonucleotide+arrays.">Genotyping and mapping with high-density oligonucleotide arrays.</a> Methods in molecular biology. 323, 137-145 (2006).</li><li>Konieczny, A., Ausubel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+procedure+for+mapping+Arabidopsis+mutations+using+co-dominant+ecotype-specific+PCR-based+markers.">A procedure for mapping Arabidopsis mutations using co-dominant ecotype-specific PCR-based markers.</a> The Plant journal : for cell and molecular biology. 4, 403-410 (1993).</li><li>Bell, C. J., Ecker, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assignment+of+30+microsatellite+loci+to+the+linkage+map+of+Arabidopsis.">Assignment of 30 microsatellite loci to the linkage map of Arabidopsis.</a> Genomics. 19, 137-144 (1994).</li><li>Hazen, S. P., Kay, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+arrays+are+not+just+for+measuring+gene+expression.">Gene arrays are not just for measuring gene expression.</a> Trends in Plant Science. 8, 413-416 (2003).</li><li>Hazen, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+array+mapping+of+circadian+clock+and+developmental+mutations+in+Arabidopsis.">Rapid array mapping of circadian clock and developmental mutations in Arabidopsis.</a> Plant Physiology. 138, 990-997 (2005).</li><li>Bentley, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+whole+human+genome+sequencing+using+reversible+terminator+chemistry.">Accurate whole human genome sequencing using reversible terminator chemistry.</a> Nature. 456, 53-59 (2008).</li><li>Weigel, D., Glazebrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis.">Arabidopsis.</a> A Laboratory Manual. , (2002).</li><li>Voelkerding, K. V., Dames, S., Durtschi, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next+generation+sequencing+for+clinical+diagnostics-principles+and+application+to+targeted+resequencing+for+hypertrophic+cardiomyopathy:+a+paper+from+the+2009+William+Beaumont+Hospital+Symposium+on+Molecular+Pathology.">Next generation sequencing for clinical diagnostics-principles and application to targeted resequencing for hypertrophic cardiomyopathy: a paper from the 2009 William Beaumont Hospital Symposium on Molecular Pathology.</a> J. Mol. Diagn. 12, 539-551 (2010).</li></ol>

כאן תיארנו ההקרנה confocal מיקרוסקופיה מבוססת על זיהוי של מוטציות endomembrane. גישה זו ניתן להרחיב בקלות אברונים אחרים של התא עבורו סמנים ספציפיים חלבון פלואורסצנטי הזמינים. המסך מבוסס על זיהוי של מוטנטים המציגים התפלגות חריגה של סמן פלואורסצנטי בין אם אברון היעד או אברונים...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td></tr><tr><td> Ethylmethane sulfonate </td><td> סיגמא </td><td> M0880 </td></tr><tr><td> NaOH </td><td> JT בייקר </td><td> 3722-05 </td></tr><tr><td> Murashige skoog הבסיס בינוני * פרנסות gamborg ויטמינים </td><td> פיטו technolog laboratorie </td><td> M404 </td></tr><tr><td> Phytagel </td><td> סיגמא </td><td> P8169-1 ק&quot;ג </td></tr><tr><td> ערכת RNeasy מיני </td><td> Qiagen </td><td> 74104 </td></tr><tr><td> הורים צמח טהור עלה DNA ערכת טיהור </td><td> Epicentre </td><td> MPP92100 </td></tr><tr><td> ה-DNA Bioprime תיוג מערכת </td><td> Invitrogen </td><td> 18094-011 </td></tr><tr><td> 200 אלכוהול הוכחה </td><td> Decan מעבדות Inc. </td><td> 2716 </td></tr><tr><td> NaOAc </td><td> JT בייקר </td><td></td></tr><tr><td> שבב גנטי ארבידופסיס ATH1הגנום מערך </td><td> Affymetrix </td><td> 900385 </td></tr><tr><td> פלקון צינורות 50 מ&quot;ל </td><td> קורנינג </td><td> 430290 </td></tr><tr><td> Eppendorf מבחנות 1.5 מ&quot;ל </td><td></td><td></td></tr><tr><td> נייר סינון 90 מ&quot;מ </td><td> Whatman </td><td> 1001090 </td></tr><tr><td> אנליטי מאזן </td><td> Mettler טולדו AB54-S </td><td> נה </td></tr><tr><td> Nutating (גל) שאכר </td><td> Heidolph polymax 1040 </td><td> נה </td></tr><tr><td> סרכזת </td><td> Eppendorf 5417-R </td><td> נה </td></tr></tbody></table>

fluorescence-microscopy screening and next-generation sequencing: useful tools for the identification of genes involved in organelle integrity

פרוטוקול זה מתאר סינון הקרינה המיקרוסקופ מבוסס על שתילים ארבידופסיס ומתאר כיצד למפות מוטציות רצסיבי אשר משנים את חלוקת subcellular של סמן מסוים ניאון מתויג במסלול הפרשה. ארבידופסיס הוא מודל ביולוגי רב עוצמה למחקרים גנטיים בגלל גודל הגנום שלו, זמן דור, ושימור של המנגנונים המולקולריים בין הממלכות. מערך genotyping כגישה למפות מוטציה חלופה לשיטה המסורתית המבוססת על סמנים מולקולריים יש יתרון משום שהוא הוא יחסית מהיר יותר עשוי לאפשר מיפוי של מוטציות מספר פרק זמן קצר מאוד. שיטה זו מאפשרת זיהוי של חלבונים אשר יכולים להשפיע על שלמות אברון כל בצמחים. הנה, לדוגמה, אנו מציעים מסך לגנים מפת חשובים שלמות של reticulum endoplasmic (ER). הגישה שלנו, לעומת זאת, ניתן להרחיב בקלות אברונים תאים אחרים צמחים(לדוגמה לראות 1,2), ובכך מייצג צעד חשוב לקראת הבנת הבסיס המולקולרי השולט מבנים subcellular אחרים.

Watch this Scientific Journal Video about Fluorescence-microscopy Screening and Next-generation Sequencing: Useful Tools for the Identification of Genes Involved in Organelle Integrity at JoVE.com

Fluorescence-microscopy Screening and Next-generation Sequencing: Useful Tools for the Identification of Genes Involved in Organelle Integrity

בחיפוש יסודי ביולוגיה של התא היא להגדיר את המנגנונים העומדים בבסיס זהותה של האברונים המרכיבים התאים האיקריוטים. כאן אנו מציעים שיטה לזהות את הגנים האחראים על תקינות מורפולוגית ופונקציונלית של אברונים צמחים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי ואת הדור הבא של כלים רצף.

פלואורסצנטי, מיקרוסקופ הקרנת ואת הדור הבא הרצף: כלים שימושיים לזיהוי גנים המעורבים אברון Integrity

This protocol describes a fluorescence microscope-based screening of Arabidopsis seedlings and describes how to map recessive mutations that alter the ...

Research

JoVE Journal

Biology

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

זמן לשגות הדמיה של מיטוזה לאחר transfection siRNA

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

באמצעות אסטרטגית האכלת התערבות RNA בתיווך למסך לגנים מעורבים בויסות משקל גוף בנמטודות<em&gt; ג elegans</em

Double-strand RNA-mediated interference (RNAi) is an effective strategy to knock down target gene expression1-3. It has been applied to many model systems ...

Next-generation Sequencing of 16S Ribosomal RNA Gene Amplicons

רצף של הדור הבא של 16S ריבוזומלי amplicons ג&#39;ין RNA

One of the major questions in microbial ecology is &#8220;who is there?&#8221; This question can be answered using various tools, but one of the ...

Targeted DNA Methylation Analysis by Next-generation Sequencing

ממוקד DNA מתילציה ניתוח על ידי רצף של הדור הבא

The role of epigenetic processes in the control of gene expression has been known for a number of years. DNA methylation at cytosine residues is of ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

הקרנת תפוקה גבוהה עבור כימית מאפננים של גני Post-תעתיק מוסדר

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

הגברה, רצף הדור הבא, ואת הגנום מיפוי ה- DNA של אתרי אינטגרצית retroviral

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...

Interactome-Seq: A Protocol for Domainome Library Construction, Validation and Selection by Phage Display and Next Generation Sequencing

Interactome-Seq: פרוטוקול עבור ספריית Domainome ובניה, אימות בחירה Phage התצוגה ורצף הדור הבא

Folding reporters are proteins with easily identifiable phenotypes, such as antibiotic resistance, whose folding and function is compromised when fused to ...

Tick Microbiome Characterization by Next-Generation 16S rRNA Amplicon Sequencing

אפיון Microbiome שנתות על-ידי מטוסי אף-16 הדור הבא rRNA אמפליקון רצף

In recent decades, vector-borne diseases have re-emerged and expanded at alarming rates, causing considerable morbidity and mortality worldwide. Effective ...

Microbiota Analysis Using Two-step PCR and Next-generation 16S rRNA Gene Sequencing

אנליזה microbiota באמצעות שני שלבים PCR ו-הדור הבא של 16 rRNA גן רצף

The human gut is colonized by trillions of bacteria that support physiologic functions such as food metabolism, energy harvesting, and regulation of the ...

A Magnetic-Bead-Based Mosquito DNA Extraction Protocol for Next-Generation Sequencing

פרוטוקול מיצוי DNA יתוש מבוסס חרוז מגנטי לרצף הדור הבא

A recently published DNA extraction protocol using magnetic beads and an automated DNA extraction instrument suggested that it is possible to extract high ...