Name: fluorescence-microscopy screening and next-generation sequencing: useful tools for the identification of genes involved in organelle integrity
Uploaded: 2012-04-13T12:00:00
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우리는 화학 과학, Geosciences 및 Biosciences 부문, 기초 에너지 과학, 과학의 사무실, 에너지의 미국과 (보너스 번호 DE-FG02-91ER20021) 및 국립 과학 재단 (MCB 0,948,584) (FB)의 사무실에 의해 지원을 인정합니다. 우리는 원고를 편집 미스 카렌 버드에 감사합니다.

1. EMS 치료 Arabidopsis thaliana의 씨앗은 T / 돌연변이 5-7로 C / G 그 결과 게놈 C - 투 - T 변화로 유도 mutagen 에이전트 에틸 메탄 산염 (EMS) 3,4로 사용 mutagenized됩니다. <ol><li> organelle 형광 마커를 (특히, 본 연구에서는 ssGFPHDEL는 (신호 시퀀스-GFP-HDEL tetrapeptide) ER 마커로 사용되었습니다) 운반 0.8 g Arabidopsis 종자를 (~ 40,000 씨앗) 무게. </li><li> 50 ML 팔콘 튜브의 씨?...

<ol>
	<li>Marti, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+missense+mutation+in+the+vacuolar+protein+GOLD36+causes+organizational+defects+in+the+ER+and+aberrant+protein+trafficking+in+the+plant+secretory+pathway.">A missense mutation in the vacuolar protein GOLD36 causes organizational defects in the ER and aberrant protein trafficking in the plant secretory pathway.</a> The Plant journal : for cell and molecular biology. 63, 901-913 (2010).</li><li>Stefano, G., Renna, L., Moss, T., McNew, J., Brandizzi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+the+spatial+and+dynamic+organization+of+the+endoplasmic+reticulum+and+Golgi+apparatus+is+influenced+by+the+integrity+of+the+c-terminal+domain+of+RHD3,+a+non-essential+GTPase.">Arabidopsis the spatial and dynamic organization of the endoplasmic reticulum and Golgi apparatus is influenced by the integrity of the c-terminal domain of RHD3, a non-essential GTPase.</a> The Plant Journal. , (2011).</li><li>Kim, Y., Schumaker, K. S., Zhu, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EMS+mutagenesis+of+Arabidopsis.">EMS mutagenesis of Arabidopsis.</a> Methods in molecular biology. 323, 101-103 (2006).</li><li>Maple, J., Moller, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutagenesis+in+Arabidopsis.">Mutagenesis in Arabidopsis.</a> Methods in molecular biology. 362, 197-206 (2007).</li><li>Greene, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectrum+of+chemically+induced+mutations+from+a+large-scale+reverse-genetic+screen+in+Arabidopsis.">Spectrum of chemically induced mutations from a large-scale reverse-genetic screen in Arabidopsis.</a> Genetics. 164, 731-740 (2003).</li><li>Krieg, D. 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R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+whole+human+genome+sequencing+using+reversible+terminator+chemistry.">Accurate whole human genome sequencing using reversible terminator chemistry.</a> Nature. 456, 53-59 (2008).</li><li>Weigel, D., Glazebrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis.">Arabidopsis.</a> A Laboratory Manual. , (2002).</li><li>Voelkerding, K. V., Dames, S., Durtschi, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next+generation+sequencing+for+clinical+diagnostics-principles+and+application+to+targeted+resequencing+for+hypertrophic+cardiomyopathy:+a+paper+from+the+2009+William+Beaumont+Hospital+Symposium+on+Molecular+Pathology.">Next generation sequencing for clinical diagnostics-principles and application to targeted resequencing for hypertrophic cardiomyopathy: a paper from the 2009 William Beaumont Hospital Symposium on Molecular Pathology.</a> J. Mol. Diagn. 12, 539-551 (2010).</li></ol>

여기 endomembrane의 돌연변이의 식별을 위해 공촛점 현미경 기반 검사를 설명했다. 이 접근법은 쉽게 특정 형광 단백질 마커를 사용할 수있는 세포의 다른 organelles로 연장하실 수 있습니다. 화면이 대상 organelle이나 마커를 포함해야하지 않는 organelles로 중 형광 마커의 탈선 분포를 보여 돌연변이의 신분에 따라 달라집니다. 각각 이러한 돌연변 마커를 subcompartimentalize하기 organelle의 능력 중 하나가 ?...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td></tr><tr><td> Ethylmethane의 산염 </td><td> 시그마 </td><td> M0880 </td></tr><tr><td> NaOH </td><td> JT 베이커 </td><td> 3722-05 </td></tr><tr><td> Murashige skoog 기초 매체 w gamborg 비타민 </td><td> 피토 technolog laboratorie </td><td> M404 </td></tr><tr><td> Phytagel </td><td> 시그마 </td><td> P8169-1kg </td></tr><tr><td> RNeasy 미니 키트 </td><td> Qiagen </td><td> 74,104 </td></tr><tr><td> 마스터 순수 식물 잎의 DNA 정제 키트 </td><td> Epicentre </td><td> MPP92100 </td></tr><tr><td> Bioprime의 DNA 라벨링 시스템 </td><td> Invitrogen </td><td> 18094-011 </td></tr><tr><td> 알콜 200 증명 </td><td> Decan 실험실 INC. </td><td> 2716 </td></tr><tr><td> NaOAc </td><td> JT 베이커 </td><td></td></tr><tr><td> 유전자 칩 Arabidopsis의 ATH1게놈 배열 </td><td> Affymetrix </td><td> 900,385 </td></tr><tr><td> 팔콘 튜브 50 ML </td><td> 코닝 </td><td> 430,290 </td></tr><tr><td> Eppendorf 튜브 1.5 ML </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 90mm 필터 종이 </td><td> 워트 먼지 </td><td> 1,001,090 </td></tr><tr><td> 분석 잔액 </td><td> Mettler 톨레도 AB54-S </td><td> NA </td></tr><tr><td> Nutating (웨이브) 흔드는 </td><td> Heidolph polymax 1040 </td><td> NA </td></tr><tr><td> 원심 분리기 </td><td> Eppendorf 5417-R </td><td> NA </td></tr></tbody></table>

fluorescence-microscopy screening and next-generation sequencing: useful tools for the identification of genes involved in organelle integrity

이 프로토콜은 Arabidopsis 모종의 형광 현미경 기반 검사를 설명하고 분비 경로에서 특정 태그를 형광 마커의 subcellular 분포를 변경 열성 돌연변를 매핑하는 방법에 대해 설명합니다. Arabidopsis 때문에 자사의 게놈 크기의 유전자 연구를위한 강력한 생물 학적 모델이며, 생성 시간, 그리고 왕국 간의 분자 메커니즘의 보존. 분자 마커를 기반으로 전통적인 방법과 대안에 변이를 매핑하는 방식으로 genotyping 배열은 비교적 빠른 있기 때문에 유리하고 아주 짧은 기간에 여러 돌연변이의 매핑을 허용할 수 있습니다. 이 방법은 식물의 어떤 organelle의 무결성에 영향을 미칠 수있는 단백질의 식별이 가능합니다. 여기 예로, 우리는 endoplasmic reticulum (ER)의 무결성을위한 중요한지도 유전자에 대한 화면을 제안합니다. 우리의 접근법은 그러나, 쉽게 다른 식물 세포 organelles로 연장하실 수 있습니다(예를 들어 1,2 참조), 따라서 다른 subcellular 구조를 지배하는 분자 기초를 이해 향한 중요한 단계를 나타냅니다.

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Fluorescence-microscopy Screening and Next-generation Sequencing: Useful Tools for the Identification of Genes Involved in Organelle Integrity

세포 생물학의 기본적인 탐구는 진핵 세포를 만드는 organelles의 신원을 기초 메커니즘을 정의하는 것입니다. 여기 형광 현미경과 차세대 시퀀싱 도구를 사용하여 식물 organelles의 형태학의 기능적인 무결성에 대한 책임 유전자를 식별하는 방법을 제안합니다.

형광 - 현미경 검사와 차세대 장면 : Organelle 무결성에 관련된 유전자의 식별을위한 유용한 도구

This protocol describes a fluorescence microscope-based screening of Arabidopsis seedlings and describes how to map recessive mutations that alter the ...

Research

JoVE Journal

Biology

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

siRNA Transfection 후의 유사 분열의 시간 저속 영상

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

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선충류의 바디 크기 규정에 참여 유전자에 대한 화면으로 RNA로 인한 간섭 수유 전략을 사용하여<em&gt; C. elegans</em

Double-strand RNA-mediated interference (RNAi) is an effective strategy to knock down target gene expression1-3. It has been applied to many model systems ...

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Tick Microbiome Characterization by Next-Generation 16S rRNA Amplicon Sequencing

다음-세대 16S rRNA Amplicon 시퀀싱에 의해 틱 미생물 특성

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