Name: fluorescence-microscopy screening and next-generation sequencing: useful tools for the identification of genes involved in organelle integrity
Uploaded: 2012-04-13T12:00:00
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Reconhecemos o apoio da Ciência Química, Geociências e Biociências Divisão, Escritório de ciências básicas da energia, Secretaria de Ciência, Departamento de Energia dos EUA (número prêmio DE-FG02-91ER20021) e National Science Foundation (MCB 0.948.584) (FB). Somos gratos à Sra. Karen Pássaro para a edição do manuscrito.

1. EMS Tratamento Sementes de Arabidopsis thaliana são mutagenizado utilizando como agente mutagénico sulfonato de metano agente de etilo (EMS) 3,4, o que induz nos C-para-T genoma alterações resultantes em C / G para T / A mutações 5-7. <ol><li> Pesar 0,8 g de sementes de Arabidopsis (~ de 40.000 sementes) que transportam a organela marcador fluorescente (especificamente, neste estudo ssGFPHDEL (sequência sinal-GFP-HDEL tetrapéptido) tem sido utiliza...

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	<li>Marti, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+missense+mutation+in+the+vacuolar+protein+GOLD36+causes+organizational+defects+in+the+ER+and+aberrant+protein+trafficking+in+the+plant+secretory+pathway.">A missense mutation in the vacuolar protein GOLD36 causes organizational defects in the ER and aberrant protein trafficking in the plant secretory pathway.</a> The Plant journal : for cell and molecular biology. 63, 901-913 (2010).</li><li>Stefano, G., Renna, L., Moss, T., McNew, J., Brandizzi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+the+spatial+and+dynamic+organization+of+the+endoplasmic+reticulum+and+Golgi+apparatus+is+influenced+by+the+integrity+of+the+c-terminal+domain+of+RHD3,+a+non-essential+GTPase.">Arabidopsis the spatial and dynamic organization of the endoplasmic reticulum and Golgi apparatus is influenced by the integrity of the c-terminal domain of RHD3, a non-essential GTPase.</a> The Plant Journal. , (2011).</li><li>Kim, Y., Schumaker, K. S., Zhu, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EMS+mutagenesis+of+Arabidopsis.">EMS mutagenesis of Arabidopsis.</a> Methods in molecular biology. 323, 101-103 (2006).</li><li>Maple, J., Moller, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutagenesis+in+Arabidopsis.">Mutagenesis in Arabidopsis.</a> Methods in molecular biology. 362, 197-206 (2007).</li><li>Greene, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectrum+of+chemically+induced+mutations+from+a+large-scale+reverse-genetic+screen+in+Arabidopsis.">Spectrum of chemically induced mutations from a large-scale reverse-genetic screen in Arabidopsis.</a> Genetics. 164, 731-740 (2003).</li><li>Krieg, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethyl+methanesulfonate-induced+reversion+of+bacteriophage+T4rII+mutants.">Ethyl methanesulfonate-induced reversion of bacteriophage T4rII mutants.</a> Genetics. 48, 561-580 (1963).</li><li>Kovalchuk, I., Kovalchuk, O., Hohn, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+variation+of+the+somatic+mutation+frequency+in+transgenic+plants.">Genome-wide variation of the somatic mutation frequency in transgenic plants.</a> The EMBO journal. 19, 4431-4438 (2000).</li><li>Boulaflous, A., Faso, C., Brandizzi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering+the+Golgi+apparatus:+from+imaging+to+genes.">Deciphering the Golgi apparatus: from imaging to genes.</a> Traffic. 9, 1613-1617 (2008).</li><li>Borevitz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genotyping+and+mapping+with+high-density+oligonucleotide+arrays.">Genotyping and mapping with high-density oligonucleotide arrays.</a> Methods in molecular biology. 323, 137-145 (2006).</li><li>Konieczny, A., Ausubel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+procedure+for+mapping+Arabidopsis+mutations+using+co-dominant+ecotype-specific+PCR-based+markers.">A procedure for mapping Arabidopsis mutations using co-dominant ecotype-specific PCR-based markers.</a> The Plant journal : for cell and molecular biology. 4, 403-410 (1993).</li><li>Bell, C. J., Ecker, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assignment+of+30+microsatellite+loci+to+the+linkage+map+of+Arabidopsis.">Assignment of 30 microsatellite loci to the linkage map of Arabidopsis.</a> Genomics. 19, 137-144 (1994).</li><li>Hazen, S. P., Kay, S. 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R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+whole+human+genome+sequencing+using+reversible+terminator+chemistry.">Accurate whole human genome sequencing using reversible terminator chemistry.</a> Nature. 456, 53-59 (2008).</li><li>Weigel, D., Glazebrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis.">Arabidopsis.</a> A Laboratory Manual. , (2002).</li><li>Voelkerding, K. V., Dames, S., Durtschi, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next+generation+sequencing+for+clinical+diagnostics-principles+and+application+to+targeted+resequencing+for+hypertrophic+cardiomyopathy:+a+paper+from+the+2009+William+Beaumont+Hospital+Symposium+on+Molecular+Pathology.">Next generation sequencing for clinical diagnostics-principles and application to targeted resequencing for hypertrophic cardiomyopathy: a paper from the 2009 William Beaumont Hospital Symposium on Molecular Pathology.</a> J. Mol. Diagn. 12, 539-551 (2010).</li></ol>

Aqui, foi descrito um rastreio de microscopia confocal baseado na identificação de mutantes endomembrane. Esta abordagem pode ser facilmente adaptado para outras organelas da célula para os quais marcadores específicos de proteínas fluorescentes estão disponíveis. A tela é baseado na identificação de mutantes que mostram uma distribuição aberrante do marcador fluorescente, quer na organela alvo ou para organelas que não são supostos para conter o marcador. Respectivamente, estes mutantes representam popula...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> Sulfonato Ethylmethane </td><td> Sigma </td><td> M0880 </td></tr><tr><td> NaOH </td><td> JT Baker </td><td> 3722-05 </td></tr><tr><td> Murashige Skoog basais médios w Gamborg vitaminas </td><td> Phyto Technolog laboratorie </td><td> M404 </td></tr><tr><td> Phytagel </td><td> Sigma </td><td> P8169-1 kg </td></tr><tr><td> Mini kit RNeasy </td><td> Qiagen </td><td> 74104 </td></tr><tr><td> Mestre pura planta folha kit de purificação de DNA </td><td> Epicentro </td><td> MPP92100 </td></tr><tr><td> Sistema de rotulagem Bioprime DNA </td><td> Invitrogen </td><td> 18094-011 </td></tr><tr><td> Prova do álcool 200 </td><td> Decan Laboratories Inc. </td><td> 2716 </td></tr><tr><td> NaOAc </td><td> JT Baker </td><td></td></tr><tr><td> Gene ATH1 Arabidopsis chipsmatriz genoma </td><td> Affymetrix </td><td> 900385 </td></tr><tr><td> Falcon tubos 50 mL </td><td> corning </td><td> 430290 </td></tr><tr><td> Tubos Eppendorf de 1,5 mL </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Papel de filtro 90 milímetros </td><td> Whatman </td><td> 1001090 </td></tr><tr><td> Balança Analítica </td><td> Mettler Toledo AB54-S </td><td> nd </td></tr><tr><td> Nutação (onda) shaker </td><td> Heidolph PolyMax 1040 </td><td> nd </td></tr><tr><td> Centrifugar </td><td> Eppendorf 5417-R </td><td> nd </td></tr></tbody></table>

fluorescence-microscopy screening and next-generation sequencing: useful tools for the identification of genes involved in organelle integrity

Este protocolo descreve um rastreio microscópio de fluorescência baseada de plântulas de Arabidopsis e descreve como mapear mutações recessivas que alteram a distribuição subcelular de um marcador específico marcado fluorescente na via secretora. Arabidopsis é um poderoso modelo biológico para estudos genéticos devido ao seu tamanho de genoma, tempo de geração e conservação de mecanismos moleculares entre os reinos. A matriz de genotipagem como uma abordagem para mapear a mutação em alternativa ao método tradicional baseado em marcadores moleculares é vantajosa porque é relativamente rápido e pode permitir que o mapeamento de vários mutantes de um período de tempo muito curto. Este método permite a identificação de proteínas que podem influenciar a integridade de qualquer organela em plantas. Aqui, como um exemplo, é proposto um ecrã para mapear genes importantes para a integridade do retículo endoplasmático (RE). Nossa abordagem, no entanto, pode ser facilmente estendido para outras organelas celulares vegetais(Por exemplo, ver 1,2), e, portanto, representa um passo importante para compreender a base molecular que regula outras estruturas subcelulares.

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Fluorescence-microscopy Screening and Next-generation Sequencing: Useful Tools for the Identification of Genes Involved in Organelle Integrity

Uma busca fundamentais em biologia celular é definir os mecanismos subjacentes à identidade dos organelos que tornam as células eucarióticas. Aqui é proposto um método para identificar os genes responsáveis ​​pela integridade morfológica e funcional de organelas vegetais utilizando microscopia de fluorescência e as ferramentas a próxima geração de sequenciação.

Microscopia de fluorescência de Triagem e seqüenciamento da próxima geração: Ferramentas úteis para a identificação de genes envolvidos na integridade das Organelas

This protocol describes a fluorescence microscope-based screening of Arabidopsis seedlings and describes how to map recessive mutations that alter the ...

Research

JoVE Journal

Biology

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Lapso de tempo de imagens de Mitose Depois de Transfection siRNA

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

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Amplificação, sequenciamento de próxima geração, e Genomic DNA Mapeamento das retrovirais Integração Sites

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Interactome-Seq: Um protocolo para a construção da biblioteca de Domainome, a validação e a seleção por Phage Display e a próxima geração de sequenciamento

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Tick Microbiome Characterization by Next-Generation 16S rRNA Amplicon Sequencing

Caracterização de Microbiome carrapato de próxima geração 16S rRNA Amplicon sequenciação

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A recently published DNA extraction protocol using magnetic beads and an automated DNA extraction instrument suggested that it is possible to extract high ...