Name: fluorescence-microscopy screening and next-generation sequencing: useful tools for the identification of genes involved in organelle integrity
Uploaded: 2012-04-13T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fluorescence-microscopy Screening and Next-generation Sequencing: Useful Tools for the Identification of Genes Involved in Organelle Integrity at JoVE.com

Мы признаем, поддержка со стороны химических наук, наук о Земле и биологических наук отдела Управления основной энергии наук, Управление по науке, Министерство энергетики США (награда номер DE-FG02-91ER20021) и Национальный научный фонд (MCB 0948584) (FB). Мы благодарны г-жа Карен птица для редактирования рукописи.

1. EMS лечение Arabidopsis семена THALIANA которые мутагенизированный, используя в качестве мутагенного агента этилового метан сульфонат (EMS) 3,4, которое индуцирует в геном C-к-T изменения, приводящие к C / G Т / мутаций 5-7. <ol><li> Взвесить 0,8 г семян Arabidopsis (~ 40 000 семян) ...

<ol>
	<li>Marti, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+missense+mutation+in+the+vacuolar+protein+GOLD36+causes+organizational+defects+in+the+ER+and+aberrant+protein+trafficking+in+the+plant+secretory+pathway.">A missense mutation in the vacuolar protein GOLD36 causes organizational defects in the ER and aberrant protein trafficking in the plant secretory pathway.</a> The Plant journal : for cell and molecular biology. 63, 901-913 (2010).</li><li>Stefano, G., Renna, L., Moss, T., McNew, J., Brandizzi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+the+spatial+and+dynamic+organization+of+the+endoplasmic+reticulum+and+Golgi+apparatus+is+influenced+by+the+integrity+of+the+c-terminal+domain+of+RHD3,+a+non-essential+GTPase.">Arabidopsis the spatial and dynamic organization of the endoplasmic reticulum and Golgi apparatus is influenced by the integrity of the c-terminal domain of RHD3, a non-essential GTPase.</a> The Plant Journal. , (2011).</li><li>Kim, Y., Schumaker, K. S., Zhu, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EMS+mutagenesis+of+Arabidopsis.">EMS mutagenesis of Arabidopsis.</a> Methods in molecular biology. 323, 101-103 (2006).</li><li>Maple, J., Moller, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutagenesis+in+Arabidopsis.">Mutagenesis in Arabidopsis.</a> Methods in molecular biology. 362, 197-206 (2007).</li><li>Greene, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectrum+of+chemically+induced+mutations+from+a+large-scale+reverse-genetic+screen+in+Arabidopsis.">Spectrum of chemically induced mutations from a large-scale reverse-genetic screen in Arabidopsis.</a> Genetics. 164, 731-740 (2003).</li><li>Krieg, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethyl+methanesulfonate-induced+reversion+of+bacteriophage+T4rII+mutants.">Ethyl methanesulfonate-induced reversion of bacteriophage T4rII mutants.</a> Genetics. 48, 561-580 (1963).</li><li>Kovalchuk, I., Kovalchuk, O., Hohn, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+variation+of+the+somatic+mutation+frequency+in+transgenic+plants.">Genome-wide variation of the somatic mutation frequency in transgenic plants.</a> The EMBO journal. 19, 4431-4438 (2000).</li><li>Boulaflous, A., Faso, C., Brandizzi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering+the+Golgi+apparatus:+from+imaging+to+genes.">Deciphering the Golgi apparatus: from imaging to genes.</a> Traffic. 9, 1613-1617 (2008).</li><li>Borevitz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genotyping+and+mapping+with+high-density+oligonucleotide+arrays.">Genotyping and mapping with high-density oligonucleotide arrays.</a> Methods in molecular biology. 323, 137-145 (2006).</li><li>Konieczny, A., Ausubel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+procedure+for+mapping+Arabidopsis+mutations+using+co-dominant+ecotype-specific+PCR-based+markers.">A procedure for mapping Arabidopsis mutations using co-dominant ecotype-specific PCR-based markers.</a> The Plant journal : for cell and molecular biology. 4, 403-410 (1993).</li><li>Bell, C. J., Ecker, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assignment+of+30+microsatellite+loci+to+the+linkage+map+of+Arabidopsis.">Assignment of 30 microsatellite loci to the linkage map of Arabidopsis.</a> Genomics. 19, 137-144 (1994).</li><li>Hazen, S. P., Kay, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+arrays+are+not+just+for+measuring+gene+expression.">Gene arrays are not just for measuring gene expression.</a> Trends in Plant Science. 8, 413-416 (2003).</li><li>Hazen, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+array+mapping+of+circadian+clock+and+developmental+mutations+in+Arabidopsis.">Rapid array mapping of circadian clock and developmental mutations in Arabidopsis.</a> Plant Physiology. 138, 990-997 (2005).</li><li>Bentley, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+whole+human+genome+sequencing+using+reversible+terminator+chemistry.">Accurate whole human genome sequencing using reversible terminator chemistry.</a> Nature. 456, 53-59 (2008).</li><li>Weigel, D., Glazebrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis.">Arabidopsis.</a> A Laboratory Manual. , (2002).</li><li>Voelkerding, K. V., Dames, S., Durtschi, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next+generation+sequencing+for+clinical+diagnostics-principles+and+application+to+targeted+resequencing+for+hypertrophic+cardiomyopathy:+a+paper+from+the+2009+William+Beaumont+Hospital+Symposium+on+Molecular+Pathology.">Next generation sequencing for clinical diagnostics-principles and application to targeted resequencing for hypertrophic cardiomyopathy: a paper from the 2009 William Beaumont Hospital Symposium on Molecular Pathology.</a> J. Mol. Diagn. 12, 539-551 (2010).</li></ol>

Здесь мы описали конфокальной микроскопии скрининга для идентификации endomembrane мутантов. Этот подход можно легко распространить и на другие органеллы клетки, для которых конкретные флуоресцентные маркеры белка имеются. Экран на основе идентификации мутантов, которые показывают, анома...

<table border="1"><tbody><tr><td> Название реагента </td><td> Компания </td><td> Номер по каталогу </td></tr><tr><td> Ethylmethane сульфонат </td><td> Сигма </td><td> M0880 </td></tr><tr><td> NaOH </td><td> JT Baker </td><td> 3722-05 </td></tr><tr><td> Мурасиге Скуга базальной среды со Гамборга витамины </td><td> Фито Технолог laboratorie </td><td> M404 </td></tr><tr><td> Phytagel </td><td> Сигма </td><td> P8169-1 кг </td></tr><tr><td> RNeasy комплект мини </td><td> Qiagen </td><td> 74104 </td></tr><tr><td> Мастер чистого листа растения очистки ДНК комплект </td><td> Эпицентр </td><td> MPP92100 </td></tr><tr><td> Bioprime система маркировки ДНК </td><td> Invitrogen </td><td> 18094-011 </td></tr><tr><td> Алкоголь 200 доказательство </td><td> Декан Laboratories Inc. </td><td> 2716 </td></tr><tr><td> NaOAc </td><td> JT Baker </td><td></td></tr><tr><td> Генных чипов Arabidopsis ATH1генома массив </td><td> Affymetrix </td><td> 900385 </td></tr><tr><td> Сокол трубы 50 мл </td><td> гранулирование </td><td> 430290 </td></tr><tr><td> Эппендорф трубы 1,5 мл </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Фильтровальная бумага 90 мм </td><td> Ватман </td><td> 1001090 </td></tr><tr><td> Аналитические весы </td><td> Mettler Toledo AB54-S </td><td> не доступно </td></tr><tr><td> Nutating (волны) шейкер </td><td> Heidolph Polymax 1040 </td><td> не доступно </td></tr><tr><td> Центрифугировать </td><td> Эппендорф 5417-R </td><td> не доступно </td></tr></tbody></table>

fluorescence-microscopy screening and next-generation sequencing: useful tools for the identification of genes involved in organelle integrity

Этот протокол описывает флуоресцентного микроскопа на основе проверки Arabidopsis саженцев и описывает, как отобразить рецессивные мутации, которые изменяют субклеточных распределение конкретных помеченный флуоресцентного маркера в секреторный путь. Arabidopsis является мощной биологической модели для генетических исследований, поскольку его размер генома, Время создания и сохранения молекулярных механизмов между царствами. Массив генотипирования, как подход к карте мутации в альтернативу традиционным методом, основанным на молекулярные маркеры выгодно, потому что это сравнительно быстрый и может разрешить отображение нескольких мутантов в очень короткие сроки. Этот метод позволяет идентифицировать белки, которые могут повлиять на целостность любой органеллы растений. Здесь, как, например, мы предлагаем экран карту генов, важных для целостности эндоплазматического ретикулума (ЭР). Наш подход, однако, можно легко распространить и на другие органеллы растительной клетки(См., например, 1,2), и, следовательно, представляет собой важный шаг на пути к пониманию молекулярных основ, регулирующих другие субклеточные структуры.

Watch this Scientific Journal Video about Fluorescence-microscopy Screening and Next-generation Sequencing: Useful Tools for the Identification of Genes Involved in Organelle Integrity at JoVE.com

Fluorescence-microscopy Screening and Next-generation Sequencing: Useful Tools for the Identification of Genes Involved in Organelle Integrity

Основной квест в клеточной биологии является определение механизмов, которые лежат в основе личности органеллы, которые делают эукариотических клеток. Здесь мы предлагаем метод для идентификации генов, ответственных за морфологической и функциональной целостности растительного органелл с помощью флуоресцентной микроскопии и следующее поколение инструментов последовательности.

Флуоресценции микроскопии Скрининг и следующего поколения секвенирования: Полезные инструменты для идентификации генов, вовлеченных в органелл Integrity

This protocol describes a fluorescence microscope-based screening of Arabidopsis seedlings and describes how to map recessive mutations that alter the ...

Research

JoVE Journal

Biology

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Покадровый Визуализация Митоз После трансфекции миРНК

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

Использование РНК-опосредованного вмешательства стратегии кормления для выявления генов, участвующих в размерах тела регулированию в Нематода<em&gt; C. Элеганс</em

Double-strand RNA-mediated interference (RNAi) is an effective strategy to knock down target gene expression1-3. It has been applied to many model systems ...

Next-generation Sequencing of 16S Ribosomal RNA Gene Amplicons

Следующее поколение Секвенирование 16S рибосомальной РНК генов ампликонов

One of the major questions in microbial ecology is &#8220;who is there?&#8221; This question can be answered using various tools, but one of the ...

Targeted DNA Methylation Analysis by Next-generation Sequencing

Целевые метилирования ДНК Анализ Следующее поколение Секвенирование

The role of epigenetic processes in the control of gene expression has been known for a number of years. DNA methylation at cytosine residues is of ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Высокопроизводительный скрининг для химических модуляторов посттранскрипционно регулируемых генов

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Amplification, следующего поколения Секвенирование и геномную ДНК Mapping ретровирусных интеграции сайты

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...

Interactome-Seq: A Protocol for Domainome Library Construction, Validation and Selection by Phage Display and Next Generation Sequencing

Interactome-Seq: Протокол для строительства Domainome Библиотека, проверки и отбора Фаговые отображения и следующего поколения последовательности

Folding reporters are proteins with easily identifiable phenotypes, such as antibiotic resistance, whose folding and function is compromised when fused to ...

Tick Microbiome Characterization by Next-Generation 16S rRNA Amplicon Sequencing

Характеристика микрофлора клеща, следующего поколения 16S рРНК ампликон последовательности

In recent decades, vector-borne diseases have re-emerged and expanded at alarming rates, causing considerable morbidity and mortality worldwide. Effective ...

Microbiota Analysis Using Two-step PCR and Next-generation 16S rRNA Gene Sequencing

Анализ микробиоты с использованием двухступенчатого ПЦР и секвенирования гена нового поколения 16S rRNA

The human gut is colonized by trillions of bacteria that support physiologic functions such as food metabolism, energy harvesting, and regulation of the ...

A Magnetic-Bead-Based Mosquito DNA Extraction Protocol for Next-Generation Sequencing

Протокол экстракции ДНК комаров на магнитной основе для секвенирования следующего поколения

A recently published DNA extraction protocol using magnetic beads and an automated DNA extraction instrument suggested that it is possible to extract high ...