Name: primary microglia isolation from mixed glial cell cultures of neonatal rat brain tissue
Uploaded: 2012-08-15T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Primary Microglia Isolation from Mixed Glial Cell Cultures of Neonatal Rat Brain Tissue at JoVE.com

Finansieret af murene program på uniformerede Universitet.

1. Dissektion af Neonatal rottehjernevæv <ol><li> Chill Leibovitzs L-15 konditionerede medier (Leibowitz L-15 + 0,1% BSA + 1% Pen / Strep) til 4 ° C. Varme kulturmedier (DMEM + 10% FBS + 1% penicillin / streptomycin) til 37 ° C. Fremstilling af 4 60x15 mm petriskåle med 4-5 ml af det konditionerede L-15 medie på is. Sterilisere alle kirurgiske værktøjer med 100% ethanol. </li><li> Skyl P2 neonatale rap hvalpe med 70% ethanol. (Neonatale rotteunger alderen P1-P5 kan anvendes i denne protokol.) </li><li> Hurtigt ...

<ol>
	<li>Ransohoff, R. M., Perry, V. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+physiology:+unique+stimuli,+specialized+responses.">Microglial physiology: unique stimuli, specialized responses.</a> Annu. Rev. Immunol. 27, 119-145 (2009).</li><li>Raivich, G., Bohatschek, M., Kloss, C. U., Werner, A., Jones, L. L., Kreutzberg, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroglial+activation+repertoire+in+the+injured+brain:+graded+response,+molecular+mechanisms+and+cues+to+physiological+function.">Neuroglial activation repertoire in the injured brain: graded response, molecular mechanisms and cues to physiological function.</a> Brain Res. Brain Res. Rev. 30, 77-105 (1999).</li><li>Loane, D. J., Byrnes, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+microglia+in+neurotrauma.">Role of microglia in neurotrauma.</a> Neurotherapeutics. 7, 245-265 (2010).</li><li>Glass, C. K., Saijo, K., Winner, B., Marchetto, M. C., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+underlying+inflammation+in+neurodegeneration.">Mechanisms underlying inflammation in neurodegeneration.</a> Cell. 140, 918-934 (2010).</li><li>Pocock, J. M., Liddle, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+signalling+cascades+in+neurodegenerative+disease.">Microglial signalling cascades in neurodegenerative disease.</a> Prog. Brain Res. 132, 555-565 (2001).</li><li>Block, M. L., Hong, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+microglial+activation+and+progressive+dopaminergic+neurotoxicity.">Chronic microglial activation and progressive dopaminergic neurotoxicity.</a> Biochem. Soc. Trans. 35, 1127-1132 (2007).</li><li>Barger, S. W., Basile, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+microglia+by+secreted+amyloid+percursor+protein+evokes+release+of+glutamate+by+cystine+exchange+and+attenuates+synpatic+function.">Activation of microglia by secreted amyloid percursor protein evokes release of glutamate by cystine exchange and attenuates synpatic function.</a> J. Neurochem. 76, 846-854 (2001).</li><li>Ni, M., Aschner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neonatal+rat+primary+microglia:+isolation,+culturing,+and+selected+applications.">Neonatal rat primary microglia: isolation, culturing, and selected applications.</a> Curr. Protoc. Toxicol. Chapter 12, Unit 12.17 (2010).</li><li>Hassan, N. F., Rifat, S., Campbell, D. E., McCawley, L. J., Douglas, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+flow+cytometric+characterization+of+newborn+mouse+brain-derived+microglia+maintained+in+vitro.">Isolation and flow cytometric characterization of newborn mouse brain-derived microglia maintained in vitro.</a> J. Leukoc. Biol. 50, 86-92 (1991).</li><li>Hassan, N. F., Prakash, K., Chehimi, J., McCawley, L. J., Douglas, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+newborn+rabbit+brain-derived+microglia.">Isolation and characterization of newborn rabbit brain-derived microglia.</a> Clin. Immunol. Immunopathol. 59, 426-435 (1991).</li><li>Hassan, N. F., Campbell, D. E., Rifat, S., Douglas, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+human+fetal+brain-derived+microglia+in+in+vitro+culture.">Isolation and characterization of human fetal brain-derived microglia in in vitro culture.</a> Neuroscience. 41, 149-158 (1991).</li><li>Frank, M. G., Wieseler-Frank, J. L., Watkins, L. R., Maier, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+isolation+of+highly+enriched+and+quiescent+microglia+from+adult+rat+hippocampus:+immunophenotypic+and+functional+characteristics.">Rapid isolation of highly enriched and quiescent microglia from adult rat hippocampus: immunophenotypic and functional characteristics.</a> J. Neurosci. Methods. 151, 121-130 (2006).</li><li>Byrnes, K. R., Stoica, B., Loane, D. J., Riccio, A., Davis, M. I., Faden, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabotropic+glutamate+receptor+5+activation+inhibits+microglial+associated+inflammation+and+neurotoxicity.">Metabotropic glutamate receptor 5 activation inhibits microglial associated inflammation and neurotoxicity.</a> Glia. 57, 550-560 (2009).</li><li>Loane, D. J., Stoica, B. A., Pajoohesh-Ganji, A., Byrnes, K. R., Faden, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+metabotropic+glutamate+receptor+5+modulates+microglial+reactivity+and+neurotoxicity+by+inhibiting+NADPH+oxidase.">Activation of metabotropic glutamate receptor 5 modulates microglial reactivity and neurotoxicity by inhibiting NADPH oxidase.</a> J. Biol. Chem. 284, 15629-15639 (2009).</li></ol>

Mens denne protokol rutinemæssigt anvendes til at producere ren og sund mikroglia for forskning eksperimenter, vil nøje overvejelse af de tekniske aspekter i kritiske dele af proceduren minimere variabilitet i den isolerede mikroglia. Første under dissektionen af ​​hjernevæv fra neonatale rotteunger, der arbejder i tide er nødvendig for at minimere hypoxisk og iskæmisk skade på vævet. Det er imidlertid også vigtigt for fuldstændigt at fjerne meningeal belægningen fra hjernen under dissektion, fordi tilste...

<table border="1"><tbody><tr><td> Navn på reagenset </td><td> Firma </td><td> Katalog nr. </td><td> Kommentarer </td></tr><tr><td> 60 mm x 15 mm petriskåle </td><td> Fisher brand </td><td> 0875713A </td><td></td></tr><tr><td> Skarpe dissekere saks </td><td> Gode ​​Science Tools </td><td> 14094-11 </td><td></td></tr><tr><td> Dumont # 7b pincet-standard tip, kurvede og 11cm </td><td> Gode ​​Science Tools </td><td> 11270-20 </td><td></td></tr><tr><td> Dumont # 5 pincet-standard tip, lige, 11 cm </td><td> Gode ​​Science Tools </td><td> 11251-10 </td><td></td></tr><tr><td> 50 ml koniske centrifugerør </td><td> VWR </td><td> 89039-656 </td><td></td></tr><tr><td> 5 ml serologisk pipette </td><td> Grenier Bio Én </td><td> 606180 </td><td></td></tr><tr><td> 10 ml serologisk pipette </td><td> Grenier Bio Én </td><td> 607180 </td><td></td></tr><tr><td> 100 um sterilt nylon cellefilter </td><td> Falcon </td><td> 35-2360 </td><td></td></tr><tr><td> 75 cm2 vævskulturkolber </td><td> Corning </td><td> 430641 </td><td></td></tr><tr><td> Dulbeccos minimale essentielle medium (DMEM) </td><td> Gibco (Invitrogen) </td><td> 31053-028 </td><td></td></tr><tr><td> Leibovitzs L-15 medium </td><td> Gibco (Invitrogen) </td><td> 11415064 </td><td></td></tr><tr><td> Føtalt bovint serum </td><td> Gibco (Invitrogen) </td><td> 16000-036 </td><td></td></tr><tr><td> Føtalt equint serum </td><td> Fisher </td><td> SH3007402 </td><td></td></tr><tr><td> Penicillin-streptomycin </td><td> Gibco (Invitrogen) </td><td> 15140163 </td><td></td></tr><tr><td> 100% ethanol </td><td> Den Warner Graham Company </td><td> 64-17-5 </td><td></td></tr><tr><td> Phosphatpufret saltopløsning, 10X, pH 7,4 </td><td> Kvalitet Biologisk, inc. </td><td> 119-069-131 </td><td> 1X i sterilt, destilleret vand </td></tr><tr><td> Biohazard tasker </td><td> VWR </td><td> 14220-028 </td><td></td></tr><tr><td> Hæmocytometer </td><td> Hausser Videnskabelig </td><td> 1492 </td><td></td></tr><tr><td> 6-brønds celledyrkningsplader plader med Cellbind overflade </td><td> Corning </td><td> 3335 </td><td></td></tr></tbody></table>

primary microglia isolation from mixed glial cell cultures of neonatal rat brain tissue

Microglia udgør ca 12% af den totale cellepopulation i pattedyrhjernen. Mens neuroner og astrocytter betragtes de primære celletyper i nervesystemet, microglia spiller en væsentlig rolle i normal hjerne fysiologi ved overvågning væv for snavs og patogener, og opretholdelse af homeostase i parenchymet via fagocytisk aktivitet 1,2. Mikroglia aktiveres i løbet af en række skader og sygdomme, herunder neurodegenerative sygdomme, traumatisk hjerneskade, og nervesystemet infektion 3. Under disse aktiverende betingelser øger microglia deres fagocytiske aktivitet, underkastes morpohological og proliferativ ændringer og aktivt udskiller reaktive oxygen-og nitrogenforbindelser, pro-inflammatoriske kemokiner og cytokiner, der ofte aktivere en parakrin eller autokrin sløjfe 4-6. Da disse microgliale reaktioner bidrager til sygdom patogenese i neurologiske lidelser, forskning fokuseret på microglia er berettiget. På grund af cellulær heterogenicitet i hjernen, er det teknisk vanskeligt at opnå tilstrækkelig mikroglial prøvematerialet med høj renhed under in vivo-forsøg. Aktuel forskning i de neuroprotektive og neurotoksiske funktioner mikroglia kræver en rutinemæssig teknisk metode til konsekvent at generere ren og sund mikroglia med tilstrækkelig udbytte for at studere. Vi præsenterer i tekst og video, en protokol til at isolere rene primære mikroglia fra blandede glia kulturer til en række af downstream applikationer. Kort fortalt denne teknik anvender dissocieret hjernevæv fra neonatale rotteunger at fremstille blandede glia-cellekulturer. Efter de blandede glia kulturerne når konfluens, er primære microglia mekanisk isoleret fra kulturen ved en kort varighed af omrystning. De microglia udplades derefter ved høj renhed til eksperimentel undersøgelse. Princippet og protokol af denne metode har væretbeskrevet i litteraturen 7,8. Derudover er alternative metoder til at isolere primære mikroglia velbeskrevet 9-12. Homogeniseret hjernevæv kan adskilles ved densitetsgradientcentrifugering til opnåelse primære microglia 12. Imidlertid centrifugering er af moderat længde (45 min) og kan forårsage cellulær skade og aktivering samt bevirke beriget microglia og andre cellepopulationer. En anden protokol er blevet anvendt til at isolere den primære microglia i en række organismer ved langvarig (16 timer) rystning, mens i kultur 9-11. Efter omrystning mediet supernatanten centrifugeret for at isolere microglia. Denne længere totrins-isolation Fremgangsmåden kan også forstyrre mikroglial funktion og-aktivering. Vi primært bruge følgende mikroglia isolation protokol i vores laboratorium for en række årsager: (1) primær mikroglia simulerer in vivo biologi mere trofast end udødeliggjorde gnaver mikroglia cellelinjer, (2) Nominel mekanisk sprængning minimerer potentialet cellulær dysfunktion eller aktivering, og (3) tilstrækkelig udbytte kan opnås uden passage af de blandede glial cellekulturer. Det er vigtigt at bemærke, at denne protokol bruger hjernevæv fra nyfødte rotteunger at isolere mikroglia og at brugen af ​​ældre rotter til at isolere mikroglia kan i høj grad påvirke udbyttet, aktivering status og funktionelle egenskaber af isolerede mikroglia. Der er tegn på, at aldring er forbundet med mikroglia dysfunktion, øget neuroinflammation og neurodegenerative sygdomme, har det tidligere undersøgelser anvendes ex vivo voksen mikroglia til bedre at forstå betydningen af mikroglia i neurodegenerative sygdomme, hvor ældning er vigtig parameter. Imidlertid kan ex vivo microglia ikke holdes i kultur i længere perioder. Derfor, mens denne protokol forlænger levetiden af ​​primær mikroglia i kultur, skal det bemærkes, at mikroglia opfører differently fra voksne mikroglia og in vitro undersøgelser bør overvejes nøje, når oversættes til en in vivo omgivelser.

Watch this Scientific Journal Video about Primary Microglia Isolation from Mixed Glial Cell Cultures of Neonatal Rat Brain Tissue at JoVE.com

Primary Microglia Isolation from Mixed Glial Cell Cultures of Neonatal Rat Brain Tissue

Isolering primære microglia fra cellulær heterogenicitet i hjernen er vigtigt at undersøge deres rolle i både fysiologiske og patologiske tilstande. Denne protokol beskrives en mekanisk isolation og blandet cellekultur teknik, som tilvejebringer et højt udbytte og høj renhed, levedygtige primære mikrogliaceller celler til<em&gt; In vitro</em&gt; Studie-og downstream-applikationer.

Primære Mikroglia Isolering af blandede gliacelle Kulturer af neonatal rottehjerne Tissue

Microglia account for approximately 12% of the  total cellular population in the mammalian brain. While neurons and astrocytes are considered  the major ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Simple and Efficient Method to Isolate Macrophages from Mixed Primary Cultures of Adult Liver Cells

Kupffer cells are liver-specific resident macrophages and play an important role in the physiological and pathological functions of the liver1-3. Although ...

Generation of Organotypic Raft Cultures from Primary Human Keratinocytes

Generering af Organotypiske Raft Cultures fra primære humane keratinocytter

The development of organotypic epithelial raft cultures has provided researchers with an efficient in vitro system that faithfully recapitulates ...

Culturing Microglia from the Neonatal and Adult Central Nervous System

Dyrkning Mikroglia fra Neonatal og Adult Central Nervous System

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and ...

Isolation of Cortical Microglia with Preserved Immunophenotype and Functionality From Murine Neonates

Isolering af Cortical Mikroglia med bevarede immunofænotype og funktionalitet fra murine Nyfødte

Isolation of microglia from CNS tissue is a powerful investigative tool used to study microglial biology ex vivo. The present method details a procedure ...

Isolation and Intravenous Injection of Murine Bone Marrow Derived Monocytes

Isolation og intravenøs injektion af murine knoglemarv Afledte Monocytter

As a subtype of leukocytes and progenitors of macrophages, monocytes are involved in many important processes of organisms and are often the subject of ...

Isolation of Sertoli Cells and Peritubular Cells from Rat Testes

Isolering af Sertoliceller og peritubulære Celler fra rotte Testikler

The testis, and in particular the male gamete, challenges the immune system in a unique way because differentiated sperm first appear at the time of ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain

Isolering og flowcytometrisk analyse af immunceller fra iskæmisk Mouse Brain

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident ...

Induction of an Inflammatory Response in Primary Hepatocyte Cultures from Mice

Induktion af et inflammatorisk respons i Primary hepatocytkulturer fra mus

The liver plays a decisive role in the regulation of systemic inflammation. In chronic kidney disease in particular, the liver reacts in response to the ...

Assessing Cellular Stress and Inflammation in Discrete Oxytocin-secreting Brain Nuclei in the Neonatal Rat Before and After First Colostrum Feeding

Vurdering af cellulært Stress og Inflammation i diskrete Oxytocin-secernerende hjernen kerner i Neonatal rotten før og efter første råmælk fodring

The goal of this protocol is to isolate oxytocin-receptor rich brain nuclei in the neonatal brain before and after first colostrum feeding. The expression ...

Concomitant Isolation of Primary Astrocytes and Microglia for Protozoa Parasite Infection

Samtidig isolering af primære astrocytter og mikroglia for protozoparasitinfektion

Astrocytes and microglia are the most abundant glial cells. They are responsible for physiological support and homeostasis maintenance in the central ...