Name: primary microglia isolation from mixed glial cell cultures of neonatal rat brain tissue
Uploaded: 2012-08-15T12:00:00
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Financiado pelo programa intramural na Universidade Militar.

1. Dissecção da Tissue Neonatal cérebro de rato <ol><li> L-15 de Leibovitz frio meios condicionados (Leibowitz L-15 + 0,1% de BSA + Pen 1% / Strep) a 4 ° C. Meios de cultura quentes (DMEM + 10% FBS + 1% de penicilina / estreptomicina) para 37 ° C. Prepare 4 60x15 mm pratos de Petri com 4-5 ml de L-condicionado de 15 meios de comunicação sobre o gelo. Esterilizar todos os instrumentos cirúrgicos com 100% de etanol. </li><li> Lavar as P2 filhotes rap neonatais com etanol 70%. (Crias de ratos neonatais com idades...

<ol>
	<li>Ransohoff, R. M., Perry, V. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+physiology:+unique+stimuli,+specialized+responses.">Microglial physiology: unique stimuli, specialized responses.</a> Annu. Rev. Immunol. 27, 119-145 (2009).</li><li>Raivich, G., Bohatschek, M., Kloss, C. U., Werner, A., Jones, L. L., Kreutzberg, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroglial+activation+repertoire+in+the+injured+brain:+graded+response,+molecular+mechanisms+and+cues+to+physiological+function.">Neuroglial activation repertoire in the injured brain: graded response, molecular mechanisms and cues to physiological function.</a> Brain Res. Brain Res. Rev. 30, 77-105 (1999).</li><li>Loane, D. J., Byrnes, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+microglia+in+neurotrauma.">Role of microglia in neurotrauma.</a> Neurotherapeutics. 7, 245-265 (2010).</li><li>Glass, C. K., Saijo, K., Winner, B., Marchetto, M. C., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+underlying+inflammation+in+neurodegeneration.">Mechanisms underlying inflammation in neurodegeneration.</a> Cell. 140, 918-934 (2010).</li><li>Pocock, J. M., Liddle, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+signalling+cascades+in+neurodegenerative+disease.">Microglial signalling cascades in neurodegenerative disease.</a> Prog. Brain Res. 132, 555-565 (2001).</li><li>Block, M. L., Hong, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+microglial+activation+and+progressive+dopaminergic+neurotoxicity.">Chronic microglial activation and progressive dopaminergic neurotoxicity.</a> Biochem. Soc. Trans. 35, 1127-1132 (2007).</li><li>Barger, S. W., Basile, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+microglia+by+secreted+amyloid+percursor+protein+evokes+release+of+glutamate+by+cystine+exchange+and+attenuates+synpatic+function.">Activation of microglia by secreted amyloid percursor protein evokes release of glutamate by cystine exchange and attenuates synpatic function.</a> J. Neurochem. 76, 846-854 (2001).</li><li>Ni, M., Aschner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neonatal+rat+primary+microglia:+isolation,+culturing,+and+selected+applications.">Neonatal rat primary microglia: isolation, culturing, and selected applications.</a> Curr. Protoc. Toxicol. Chapter 12, Unit 12.17 (2010).</li><li>Hassan, N. F., Rifat, S., Campbell, D. E., McCawley, L. J., Douglas, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+flow+cytometric+characterization+of+newborn+mouse+brain-derived+microglia+maintained+in+vitro.">Isolation and flow cytometric characterization of newborn mouse brain-derived microglia maintained in vitro.</a> J. Leukoc. Biol. 50, 86-92 (1991).</li><li>Hassan, N. F., Prakash, K., Chehimi, J., McCawley, L. J., Douglas, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+newborn+rabbit+brain-derived+microglia.">Isolation and characterization of newborn rabbit brain-derived microglia.</a> Clin. Immunol. Immunopathol. 59, 426-435 (1991).</li><li>Hassan, N. F., Campbell, D. E., Rifat, S., Douglas, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+human+fetal+brain-derived+microglia+in+in+vitro+culture.">Isolation and characterization of human fetal brain-derived microglia in in vitro culture.</a> Neuroscience. 41, 149-158 (1991).</li><li>Frank, M. G., Wieseler-Frank, J. L., Watkins, L. R., Maier, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+isolation+of+highly+enriched+and+quiescent+microglia+from+adult+rat+hippocampus:+immunophenotypic+and+functional+characteristics.">Rapid isolation of highly enriched and quiescent microglia from adult rat hippocampus: immunophenotypic and functional characteristics.</a> J. Neurosci. Methods. 151, 121-130 (2006).</li><li>Byrnes, K. R., Stoica, B., Loane, D. J., Riccio, A., Davis, M. I., Faden, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabotropic+glutamate+receptor+5+activation+inhibits+microglial+associated+inflammation+and+neurotoxicity.">Metabotropic glutamate receptor 5 activation inhibits microglial associated inflammation and neurotoxicity.</a> Glia. 57, 550-560 (2009).</li><li>Loane, D. J., Stoica, B. A., Pajoohesh-Ganji, A., Byrnes, K. R., Faden, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+metabotropic+glutamate+receptor+5+modulates+microglial+reactivity+and+neurotoxicity+by+inhibiting+NADPH+oxidase.">Activation of metabotropic glutamate receptor 5 modulates microglial reactivity and neurotoxicity by inhibiting NADPH oxidase.</a> J. Biol. Chem. 284, 15629-15639 (2009).</li></ol>

Embora este protocolo é rotineiramente utilizado para produzir microglia puro e saudável para experimentos de pesquisa, uma análise cuidadosa dos aspectos técnicos, durante partes críticas do procedimento minimizar a variabilidade na microglia isolado. Primeiro, durante a dissecção do tecido do cérebro de filhotes de ratos neonatos, trabalhando em tempo hábil é necessário para minimizar os danos e hipóxico isquêmica do tecido. No entanto, é também importante para remover completamente o revestimento mení...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de Catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> 60 mm x 15 mm, placas de Petri </td><td> Fisher marca </td><td> 0875713A </td><td></td></tr><tr><td> Afiadas tesouras de dissecação </td><td> Belas Ferramentas Ciência </td><td> 14094-11 </td><td></td></tr><tr><td> Dumont # 7b fórceps padrão pontas, curvas, 11cm </td><td> Belas Ferramentas Ciência </td><td> 11270-20 </td><td></td></tr><tr><td> Dumont # 5 fórceps padrão dicas, em linha reta, 11 cm </td><td> Belas Ferramentas Ciência </td><td> 11251-10 </td><td></td></tr><tr><td> Cónico de 50 ml de tubos de centrifugação </td><td> VWR </td><td> 89039-656 </td><td></td></tr><tr><td> 5 ml pipetas sorológicas </td><td> Grenier Bio One </td><td> 606180 </td><td></td></tr><tr><td> 10 ml pipetas sorológicas </td><td> Grenier Bio One </td><td> 607180 </td><td></td></tr><tr><td> 100 filtro célula mM estéril nylon </td><td> Falcão </td><td> 35-2360 </td><td></td></tr><tr><td> 75 cm 2 de cultura de tecidos frascos </td><td> Corning </td><td> 430641 </td><td></td></tr><tr><td> Meio mínimo essencial de Dulbecco (DMEM) </td><td> Gibco (Invitrogen) </td><td> 31053-028 </td><td></td></tr><tr><td> L-15 de Leibovitz médio </td><td> Gibco (Invitrogen) </td><td> 11415064 </td><td></td></tr><tr><td> Soro fetal de bovino </td><td> Gibco (Invitrogen) </td><td> 16000-036 </td><td></td></tr><tr><td> Fetal soro eqüino </td><td> Pescador </td><td> SH3007402 </td><td></td></tr><tr><td> Penicilina-Estreptomicina </td><td> Gibco (Invitrogen) </td><td> 15140163 </td><td></td></tr><tr><td> Etanol a 100% </td><td> A Warner Empresa Graham </td><td> 64-17-5 </td><td></td></tr><tr><td> Solução salina tamponada com fosfato, 10X, pH 7,4 </td><td> Qualidade Biológica, inc. </td><td> 119-069-131 </td><td> 1X em água destilada estéril </td></tr><tr><td> Sacos de Biohazard </td><td> VWR </td><td> 14220-028 </td><td></td></tr><tr><td> Hemocitómetro </td><td> Hausser Científico </td><td> 1492 </td><td></td></tr><tr><td> 6-poços de células placas de cultura com a superfície Cellbind </td><td> Corning </td><td> 3335 </td><td></td></tr></tbody></table>

primary microglia isolation from mixed glial cell cultures of neonatal rat brain tissue

Microglia conta para aproximadamente 12% do total da população celular no cérebro de mamíferos. Embora os neurónios e astrócitos são considerados os tipos de células principais do sistema nervoso, microglia desempenhar um papel significativo na fisiologia normal do cérebro através da monitorização do tecido para que os detritos e os agentes patogénicos e manutenção da homeostase do parênquima através 1,2 actividade fagocítica. A microglia é ativada durante uma série de lesões e doença, incluindo doenças neurodegenerativas, lesões cerebrais traumáticas e infecção do sistema nervoso 3. Sob estas condições de ativação, microglia aumentar sua atividade fagocitária, passam por mudanças morpohological e proliferativa, e ativamente secretam espécies reativas de oxigênio e nitrogênio, pró-inflamatórias quimiocinas e citocinas, muitas vezes, ativando um loop parácrina ou autócrina 4-6. Como essas respostas microgliais contribuir para a patogênese da doença em condições neurológicas, a pesquisa focada em microglia se justifica. Devido à heterogeneidade celular do cérebro, é tecnicamente difícil a obtenção de material de amostra suficiente microglial com pureza elevada durante experiências in vivo. A pesquisa atual sobre as funções neuroprotetoras e neurotóxico de microglia exigir um método de rotina técnica para gerar consistentemente microglia puro e saudável, com rendimento suficiente para o estudo. Apresentamos, no texto e vídeo, um protocolo para isolar microglia primário puro a partir de culturas da glia mistos para uma variedade de aplicações a jusante. Resumidamente, esta técnica utiliza tecido cerebral dissociada crias de rato neonatal para produzir mistos culturas de células gliais. Após as culturas mistas gliais atingir a confluência, microglia primárias são mecanicamente isolado a partir da cultura por um breve duração de agitação. Os microglia são então plaqueadas a elevada pureza para o estudo experimental. O princípio e protocolo desta metodologia ter sidodescrito na literatura 7,8. Além disso, as metodologias alternativos para isolar microglia primários estão bem descritos 9-12. Tecido cerebral homogeneizado podem ser separados por centrifugação em gradiente de densidade para produzir microglia primário 12. No entanto, a centrifugação é de comprimento moderado (45 min) e pode causar danos celulares e activação, assim como, causar enriquecido microglia e outras populações celulares. Outro protocolo tem sido utilizada para isolar a microglia primária em uma variedade de organismos por prolongada (16 horas), agitando ao mesmo tempo em cultura 9-11. Após agitação, o sobrenadante é centrifugado meios para isolar a microglia. Este método de isolamento de mais duas etapas também podem perturbar a função e ativação da microglia. Nós principalmente utilizar o protocolo de isolamento seguinte microglia no nosso laboratório para um número de razões: (1) primária microglia simular em biologia in vivo mais fielmente que imortalizadas linhas celulares de roedores microglia, (2) Uma ruptura nominal mecânica minimiza disfunção celular potencial ou activação, e (3) o rendimento suficiente pode ser obtida sem passagem das culturas mistas de células gliais. É importante notar que este protocolo utiliza o tecido cerebral de crias de rato neonatal para isolar microglia e que a utilização de ratos mais velhos para isolar microglia pode ter um impacto significativo no rendimento, estado de activação, e as propriedades funcionais da microglia isolado. Há evidências de que o envelhecimento está relacionada com a disfunção microglia, neuroinflamação aumentada e patologias neurodegenerativas, assim estudos anteriores têm utilizado ex vivo adulto microglia para compreender melhor o papel da microglia em doenças neurodegenerativas, onde o envelhecimento é parâmetro importante. No entanto, ex vivo microglia não pode ser mantido em cultura durante períodos prolongados de tempo. Consequentemente, embora este protocolo prolonga a vida da microglia primária em cultura, deve notar-se que a microglia comportar differently de adulto microglia e estudos in vitro deve ser cuidadosamente considerado quando traduzido para uma definição em vivo.

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Primary Microglia Isolation from Mixed Glial Cell Cultures of Neonatal Rat Brain Tissue

Isolar microglia primária a partir da heterogeneidade celular do cérebro é essencial para investigar o seu papel em ambas as condições fisiológicas e patológicas. Este protocolo descreve um isolamento mecânico e técnica de cultura mista de células que fornece alto rendimento e elevada pureza, viáveis ​​primárias células microgliais para<em&gt; In vitro</em&gt; Estudo e aplicações a jusante.

Isolamento Microglia primária a partir de cultura mista de células gliais de tecido de cérebro de rato neonatal

Microglia account for approximately 12% of the  total cellular population in the mammalian brain. While neurons and astrocytes are considered  the major ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Simple and Efficient Method to Isolate Macrophages from Mixed Primary Cultures of Adult Liver Cells

Um método simples e eficiente para isolar Macrófagos de Mixed culturas primárias de células do fígado Adulto

Kupffer cells are liver-specific resident macrophages and play an important role in the physiological and pathological functions of the liver1-3. Although ...

Imunologia e Infecção

Generation of Organotypic Raft Cultures from Primary Human Keratinocytes

Geração de Culturas Raft organotípicas de queratinócitos humanos primários

The development of organotypic epithelial raft cultures has provided researchers with an efficient in vitro system that faithfully recapitulates ...

Culturing Microglia from the Neonatal and Adult Central Nervous System

Microglia cultura do Sistema Nervoso Central Neonatal e Adulto

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and ...

Isolation of Cortical Microglia with Preserved Immunophenotype and Functionality From Murine Neonates

Isolamento de Cortical Microglia com Imunofenótipo preservada e funcionalidades de murino Os recém-nascidos

Isolation of microglia from CNS tissue is a powerful investigative tool used to study microglial biology ex vivo. The present method details a procedure ...

Isolation and Intravenous Injection of Murine Bone Marrow Derived Monocytes

Isolamento e injecção intravenosa de Murino de Medula Óssea Derivado monócitos

As a subtype of leukocytes and progenitors of macrophages, monocytes are involved in many important processes of organisms and are often the subject of ...

Isolation of Sertoli Cells and Peritubular Cells from Rat Testes

Isolamento de células de Sertoli e as células de rato peritubular Testículos

The testis, and in particular the male gamete, challenges the immune system in a unique way because differentiated sperm first appear at the time of ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain

Isolamento e análise de citometria de fluxo de células imunes do cérebro isquêmico Rato

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident ...

Induction of an Inflammatory Response in Primary Hepatocyte Cultures from Mice

A indução de uma resposta inflamatória em culturas primárias de hepatócitos de ratinhos

The liver plays a decisive role in the regulation of systemic inflammation. In chronic kidney disease in particular, the liver reacts in response to the ...

Assessing Cellular Stress and Inflammation in Discrete Oxytocin-secreting Brain Nuclei in the Neonatal Rat Before and After First Colostrum Feeding

Avaliação de estresse celular e inflamação em discreta secretoras de ocitocina núcleos de cérebro em ratos Neonatal antes e depois da primeira mamada do colostro

The goal of this protocol is to isolate oxytocin-receptor rich brain nuclei in the neonatal brain before and after first colostrum feeding. The expression ...

Concomitant Isolation of Primary Astrocytes and Microglia for Protozoa Parasite Infection

Isolamento concomitante de astrócitos primários e microglia para infecção por parasitas protozoários

Astrocytes and microglia are the most abundant glial cells. They are responsible for physiological support and homeostasis maintenance in the central ...