Name: fruit volatile analysis using an electronic nose
Uploaded: 2012-03-30T13:00:00
Duration: 11 min 2 s
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Les auteurs tiennent à remercier Copes le projet de loi (Société Harris Moran Seed, Davis) pour fournir des fruits de melon pour cette analyse. Ce projet est soutenu par les cultures spéciales de l&#39;Initiative de recherche sur programme de subventions concurrentiel accorder aucune. 2009-51181-05783 de l&#39;Institut national de l&#39;USDA pour l&#39;alimentation et l&#39;agriculture.

1. Préparation de l&#39;échantillon <ol><li> Cueillent des fruits au stade de maturité souhaité. Rincer à l&#39;eau du robinet afin d&#39;enlever la saleté et la poussière. </li><li> Sélectionnez les fruits d&#39;analyse basé sur l&#39;absence de défauts internes et externes, et l&#39;homogénéité de taille. </li><li> Coupez les fruits en quartiers longitudinalement à être utilisés pour l&#39;échantillonnage volatile. Le cas échéant, enlever la peau, les graines, tissus cavité des graines, ou de la fosse. La sélection des tissus du fruit doit être uniforme dans l&#39;expérience et de prendre en compte la variabilité au sein d&#39;un seul fruit (c.-à-obtenir un échantillon aussi de la zone équatoriale, la fleur et des parties d&#39;extrémité de tige). </li><li> Combinez le tissu fruit sélectionné, le mélanger afin de tirer au hasard, puis peser 200 g dans un mélangeur. </li><li> Ajouter 200 ml de solution de CaCl 2 saturée (372,5 g à 20 ° C, dans 500 ml d&#39;eau déminéralisée) et 50 ul d&#39;une solution 100 mM de 2-méthylbutyle isovalérate dans le méthanol. Le CaCl 2 est destiné à agir comme un inhibiteur de courant alternatif enzymatiquetivité, qui pourrait se produire après la coupe et l&#39;homogénéisation de la pulpe du fruit. 2-méthylbutyle isovalérate est ajouté comme étalon interne pour surveiller les éventuelles pertes de composés volatils au cours du processus d&#39;homogénéisation. </li><li> Homogénéiser le mélange dans un mélangeur de laboratoire (Waring, États-Unis), pendant 30 secondes à 18.000 rpm, puis verser immédiatement dans le flacon en verre et le joint avec couvercle en téflon. Gardez l&#39;homogénat dans la bouteille à la température ambiante jusqu&#39;à ce que tous les échantillons sont préparés. </li><li> Après avoir versé l&#39;homogénat dans la bouteille, attendre 10 minutes pour permettre la séparation de la mousse à partir du liquide, puis aliquotes pipette 5 ml de liquide, sans mousse, en flacons de 20 ml en verre ambré et sceller les flacons avec des bouchons à vis en acier munies de Teflon / silicone cloisons. Cette procédure est appropriée pour le melon et de poire préparation homogénat. Si d&#39;autres fruits sont utilisés pour l&#39;analyse, une étape de centrifugation peut être nécessaire. Par conséquent, enlever la mousse, puis centrifuger le liquide à particules de granulés qui pourraientobstruer la pipette. Préparer au moins trois flacons par échantillon pour servir de techniques répétitions. </li><li> À ce stade, les échantillons peuvent être analysés immédiatement ou flash-congelés dans l&#39;azote liquide et conservés à très basse température (-80 ° C) pour une analyse ultérieure. </li><li> Pour les échantillons congelés, le jour l&#39;analyse des échantillons de retirer du congélateur et laissez-les dégeler pendant une heure à température ambiante. Après décongélation, et avant l&#39;analyse, de remplacer le bouchon du flacon avec un nouveau qui a un propre, le septum sec. Si la cloison n&#39;est pas remplacé, l&#39;eau condensée sur le septum lors de la décongélation peut être aspiré dans l&#39;instrument et l&#39;endommager. </li></ol> 2. Acoustic Wave chromatographie en phase gazeuse de la surface (GC-SAW) Mise en place et d&#39;acquisition de données <ol><li> Chargez la méthode d&#39;analyse appropriée sur le zNose. Pour l&#39;analyse de l&#39;ester riche en profil volatile de melon, de nos paramètres dans la version 5.44.22 du logiciel Microsense (Newbury Park, CA, USA) sont les suivants: l&#39;espace de tête d&#39;aspiration dans leentrée pendant 20 secondes à 30 -1 ml min par l&#39;intermédiaire de la pompe; température d&#39;entrée à 200 ° C; température du piège Tenax à 225 ° C, débit de gaz porteur (hélium pur à 99,999%) de 2,9 ml min-1; colonne (DB-5 la colonne, une m × 0,25 mm programme d&#39;identification température × 0,25 épaisseur de film um) de 45 ° C à 180 ° C à une vitesse de 10 ° C sec -1; capteur de température à 40 ° C; soupape à 165 ° C. Le temps total d&#39;analyse est de 1 minute par échantillon. </li><li> Connectez une aiguille en acier inoxydable avec des non-carottage pointe à l&#39;entrée zNose et purger le système plusieurs fois avec de l&#39;air ambiant jusqu&#39;à ce que la base est stable et exempt de pics de plus de 200 chefs d&#39;accusation (Ct) sont détectés. </li><li> Accorder l&#39;instrument en utilisant une solution de alcanes à chaîne droite (C6-C14). Le résultat air est utilisé par le logiciel de l&#39;instrument pour convertir le temps de rétention des pics éluées à partir des unités de temps en indice de Kovats de (KI) unités. Par conséquent, après que le système est à l&#39;écoute, les temps de rétention sont déclarés en unités KI. </li&gt; <li> Avant l&#39;analyse, l&#39;échantillon à s&#39;équilibrer pendant 30 minutes. Pour analyser l&#39;un des flacons, insérer une aiguille dans le septum du flacon pour libérer la pression. Puis introduire l&#39;aiguille reliée à l&#39;entrée de l&#39;instrument dans le septum du flacon de prélèvement et d&#39;initier l&#39;espace de tête. Analyser au moins trois répétitions par échantillon technique. </li><li> Démarrer manuellement l&#39;instrument en cliquant sur bouton &quot;Play&quot;; la pompe s&#39;active et se retire des vapeurs présenter dessus de l&#39;échantillon. À la fin de l&#39;analyse, un chromatogramme apparaît sur l&#39;écran, et le capteur est automatiquement chauffé à 150 ° C pendant 10 secondes pour nettoyer. Lorsque le bouton de la boîte d&#39;état du système se transforme de nouveau en vert, l&#39;appareil est prêt à analyser un autre échantillon. </li><li> Afin d&#39;assurer une base stable et le nettoyage correct du système, exécuter au moins une ébauche de l&#39;air entre chaque échantillon. Pour surveiller la contamination volatile possible à partir du flacon et du bouchon, d&#39;analyser deux flacon flans (flacon vide avec bouchon), au début et à la fin de la journée. &lt;/ Li&gt; </ol> 3. Export des données et analyse <ol><li> Exportez les données dans un fichier Microsoft Excel après l&#39;acquisition en utilisant la &quot;journalisation Peak&quot; fonction dans le logiciel Microsense. Une fois que les données sont exportées, ajouter des colonnes contenant des étiquettes pour les variables et réplique. </li><li> Transformer le format de données pour une manipulation plus aisée à l&#39;aide du Python (version 2.6; librement disponible en ligne), nous avons développé un script, nommé &quot;reform_data.py&quot; (voir la figure 1 pour un exemple du format de données avant et après l&#39;utilisation du script &quot;reform_data. py &quot;). Le nom du fichier source (format xls) et nom de la feuille pour les données d&#39;entrée, ainsi que le nom du fichier désiré pour la sortie (format xls), sont éditées directement dans le script. </li><li> Démarrer &quot;kim_interface.py&quot; (également écrit en Python 2.6, voir Figure 2), et d&#39;importer les données dans le fichier généré à l&#39;étape précédente. Plus précisément, l&#39;analyse est basée sur la visualisation et l&#39;analyse du nombre de fois où chaque valeur de KI a été détecté(&quot;Hits&quot; KI). Ainsi, le programme affiche un histogramme des hits de KI pour chaque valeur de KI. </li><li> Évaluer les résultats de KI sous-ensembles spécifiques d&#39;échantillons, l&#39;analyse de chaque groupe de répétitions techniques ensemble. Pour ce faire, analyser chaque traitement ou variable séparément en cochant / décochant les cases correspondantes. Voir la figure 2 légende pour une description détaillée de l&#39;interface utilisateur graphique (GUI) caractéristiques. </li><li> Après avoir identifié la largeur de chaque fenêtre KI utilisant l&#39;interface graphique, choisir au hasard quelques-uns des chromatogrammes correspondants dans le logiciel Microsense et évaluer chevauchement des pics parmi les techniques répétitions. Voir Figure 3 pour un exemple de chromatogrammes superposés de deux techniques répétitions. </li><li> Une fois la fenêtre KI est individuée, utilisez la fonctionnalité disponible «fusionner» dans l&#39;interface graphique de fusionner les informateurs clés qui tombent dans la fenêtre, dans le KI la plus peuplée. En utilisant cette fonctionnalité, les pics marqués avec une gamme de valeurs de KI sont regroupés sous un label unique KI, allowing traiter ces pics comme une variable unique. Pour ce faire, cliquez d&#39;abord sur le bouton &quot;Merge&quot; pour activer la fonction et sélectionnez le KI plus peuplée que le centre de la fenêtre par un clic gauche de la barre correspondante. Une fois que la barre a été sélectionné, il change de couleur et devient vert. Pour fusionner les informateurs clés qui relèvent de la fenêtre dans le KI sélectionné, cliquez-droit sur ​​les barres correspondantes, ce qui provoque des barres à virer au rouge, tandis que la barre bleue de la longueur correspondant est ajouté au-dessus du KI centrale (voir la figure 4 ). Une fois que tous les informateurs clés sélectionnés ont été fusionnés dans le KI central approprié, cliquez sur le bouton «fusionner» pour accepter les changements, ce qui provoque le bouton «fusionner» à jaunir. En cas d&#39;erreur, le bouton &#39;Unmerge&#39; est également disponible. Pour annuler la fusion, cliquez sur le bouton &#39;Unmerge&#39; dans l&#39;interface graphique, puis cliquez à droite sur la barre rouge que vous voulez désinstaller. Du rouge, la barre devient bleue. Cliquez sur le Unmerge &#39;nouveau sur la touche pour accepter les modifications. </li><li> Si l&#39;on cherche à incorrectly fusionner deux sommets dans un seul échantillon en une valeur unique KI, un message d&#39;erreur est imprimé. Dans de telles circonstances, vérifiez attentivement le chromatogramme et de redéfinir la fenêtre KI dans cette région. </li><li> Une fois toutes les opérations de fusion ont été effectuées, enregistrez le fichier. </li><li> Avant de procéder à une analyse statistique, les chromatogrammes de l&#39;air et des blancs flacons sont analysés afin de surveiller les contaminations possibles. Une fois que le KI des pics dans les flans ont été identifiés, soustraire la surface du pic détecté dans l&#39;air et / ou un flacon-vide de la zone de la crête présente dans l&#39;échantillon. Puis procéder à l&#39;analyse statistique. </li></ol> 4. Les résultats représentatifs Le nez électronique a été en mesure de détecter des différences dans les profils volatils parmi les fruits récoltés au melon stades de maturité différents (figure 5). Vingt KI fenêtres ont été identifiés dans tous les échantillons. Une analyse de variance a montré que 14 sommets de détéDirection exécutive du Comité par le nez électronique varié significativement entre les stades de maturité. Dans la figure 6, le journal des surfaces moyennes de pointe de ces 14 composants sont tracées pour montrer les différences dans l&#39;abondance de pointe entre deux stades de maturité, début matures et fruits bien mûrs. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3821/3821fig1.jpg" /> Figure 1. Exemples de format de données exportées à partir de logiciel de l&#39;instrument (A) et après la transformation, réalisée à l&#39;aide &quot;reform_data.py&quot; script (B). Pour faciliter la manipulation des données et l&#39;analyse, tous les informateurs clés uniques sont identifiés dans tous les échantillons, puis les données sont réorganisés avec informations sur l&#39;échantillon en lignes et en colonnes de la zone de pointe, correspondant à informateurs clés uniques. Si un pic n&#39;est pas détecté par une valeur de KI dans un échantillon, la cellule correspondante reste vide. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/3821/3821fig2.jpg" /> Capture d&#39;écran Figure 2. De la scripfichier t &quot;kim_interface.py&quot;. L&#39;intrigue dans le centre affiche le nombre de visites par rapport à KI KI. &#39;Hit par KI&#39; est le nombre d&#39;échantillons dans lesquels une crête avec celle KI spécifique a été détectés. Sur le côté gauche, il ya trois cases jaunes qui contrôlent les données sélectionnées. Ils afficher les paramètres de diviser l&#39;ensemble de données (traitements, les répétitions, les variables qualitatives, etc.) Dans cette figure, ils sont (de haut en bas): variété, date de plantation et le stade de maturité à la récolte. Sur le fond: en cliquant sur les 3 bars et le déplacement de la barre bleue vers la gauche ou vers la droite, on peut choisir le minimum et la valeur maximale de la gamme KI, et la surface du pic minimum («seuil»). Sur la droite: le bouton &quot;Merge&quot; permet de fusionner informateurs clés sélectionnés manuellement en cliquant sur les barres dans le complot. Le bouton &#39;Unmerge&#39; permet d&#39;inverser le processus dans des cas sélectionnés. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/3821/3821fig3.jpg" /> Figure 3. Chromatogrammes superposés (dans<html> noir et rouge) de deux techniques réplique à partir de l&#39;espace de tête de melon volatile pour illustrer un décalage dans le temps de rétention. <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/3821/3821fig4.jpg" /> Figure 4. Exemple de la fusion KI procédure. Dans l&#39;intrigue principale, la barre verte (centrale KI) représente la plus peuplée KI, qui a été choisi comme centre de la fenêtre KI. KI KI X et Y sont informateurs clés tombant dans la fenêtre d&#39;intérêt et dont ils ont besoin d&#39;être fusionné dans le KI centrale. Par un clic droit sur la barre de KI X, il devient rouge et, dans le même temps, une barre bleue de la même longueur de la barre de KI X, apparaît en haut de la verte. En répétant la même procédure pour KI Y, la longueur de la barre bleue (KIS fusionnées) va augmenter de la durée correspondante. Une fois que tous les informateurs clés ont été ajoutés, en cliquant sur le bouton vert «fusionner», la fin du processus de fusion, les modifications sont enregistrées, et la couleur du bouton devient jaune. / Files/ftp_upload/3821/3821fig5.jpg &quot;/&gt; Figure 5. Deux chromatogrammes d&#39;échantillons de melon récolté à un stade de maturité différents, au début de maturité (en haut) et à pleine maturité (en bas), pour illustrer la capacité du nez électronique pour détecter des différences dans l&#39;abondance volatils. <img alt="Figure 6" src="/files/ftp_upload/3821/3821fig6.jpg" /> Figure 6. Parcelle radar montrant la surface du pic de 14 composants présents dans deux échantillons de melon à deux stades de maturité différents, au début matures et bien mûrs. Les surfaces des pics sont signalés en échelle logarithmique pour aider à visualiser la comparaison. Les chiffres à la fin de chaque rayon de représenter les indices correspondants Kovats.

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Nous n&#39;avons rien à communiquer.

Les nez électroniques représentent une méthode prometteuse pour le rapide, l&#39;évaluation objective des profils aromatiques de fruits ou volatile riches échantillons. Toutefois, les changements dans les temps de rétention représentent un défi pour l&#39;identification des pics et pourrait conduire à une interprétation erronée des données lorsque deux chromatogrammes ne sont pas parfaitement alignés. L&#39;inspection visuelle des chromatogrammes a indiqué que la variabilité des temps de rétention des échantillons fréquemment causé le même pic à être étiquetés avec des valeurs légèrement différentes KI (environ ± 10). Cela s&#39;est traduit par un nombre exagéré de Kis uniques détectés. Afin de tirer parti des faits qui (a) différents composés sont présents à différents stades de maturité et (b) technique répétitions sont sensiblement identiques, deux scripts par ordinateur (&quot;kim_merge.py&quot;, qui contient les routines pour la manipulation des données ensemble, et «kim_interface.py&quot;, qui fournit une interface utilisateur graphique (GUI)) ont été élaborés de façon systématiquecomparer des échantillons d&#39;une manière semi-automatique, ce qui réduit considérablement le temps nécessaire pour l&#39;analyse chromatogramme de grands ensembles de données. Ces programmes permettent la consolidation, le cas échéant, des pics marqués avec une plage de valeurs KI KI sous un label unique. Cela sert à deux fins importantes: (a) elle permet une analyse statistique pour traiter ces pics comme une variable unique, et (b) il facilite l&#39;identification des pics et la comparaison à d&#39;autres systèmes et les valeurs publiées. Les résultats présentés ici indiquent que les échantillons de melon pourrait être victime de discrimination fondée sur la maturité et le profilage arôme en utilisant le système zNose en combinaison avec l&#39;identification KI adéquate. Cela représente une nouvelle technologie prometteuse pour l&#39;analyse des composés volatils qui peuvent être utilisés pour les programmes de contrôle de la qualité.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> Le chlorure de calcium </td><td> MP Biomedical </td><td> 195088 </td><td></td></tr><tr><td> 2-méthylbutyle isovalérate </td><td> SAFC mondial </td><td> W350613 </td><td> ≥ 98%, naturelle, de la FCC </td></tr><tr><td> Le méthanol </td><td> Fisher Scientific </td><td> A411-4 </td><td></td></tr><tr><td> Ampoule </td><td> Sigma / Supelco </td><td> SU860098 </td><td></td></tr><tr><td> Chapeau </td><td> Sigma / Supelco </td><td> SU860101 </td><td></td></tr><tr><td> Laboratoire mélangeur </td><td> Waring Science Laboratory </td><td> 7009G </td><td> 2-Vitesse Mixeur; 1 - récipient en verre Litres </td></tr><tr><td> Bouteille </td><td> Fisher Scientific </td><td> 06-414-1C </td><td> Pyrex, 500 ml; polypropylène plug-joint </td></tr><tr><td> Aiguille </td><td> Le capteur électronique </td><td> TLC101046 </td><td> Trou latéral luer </td></tr><tr><td> Solution Alcanes </td><td> Le capteur électronique </td><td></td><td> C6-C14 solution alcanes dans le méthanol </td></tr><tr><td> zNose </td><td> Le capteur électronique </td><td> Modèle 4500 </td><td></td></tr><tr><td> Colonne DB-5 GC </td><td> Le capteur électronique </td><td> SYS4500C5 </td><td></td></tr><tr><td> Microsense </td><td> Le capteur électronique </td><td> Version 5.44.22 </td><td></td></tr><tr><td> Python 2.6 </td><td></td><td></td><td> Librement disponible en ligne </td></tr><tr><td> &quot;Reform_data.py&quot; et &quot;kim_interface.py&quot; scripts</td><td></td><td></td><td> Scripts disponibles comme matériel supplémentaire sur JoVE </td></tr></tbody></table>

fruit volatile analysis using an electronic nose

De nombreux et divers changements physiologiques se produisent au cours de la maturation des fruits, y compris l&#39;élaboration d&#39;un mélange spécifique volatile qui caractérise l&#39;arôme des fruits. Maturité à la récolte est l&#39;un des facteurs clés qui influencent la qualité de la saveur des fruits et légumes 1. La validation des méthodes fiables qui évaluent rapidement la maturité du fruit et de la qualité aromatique permettrait d&#39;améliorer la gestion des programmes de sélection avancées, les pratiques de production et de manipulation post-récolte. Au cours des trois dernières décennies, beaucoup de recherches ont été menées afin de développer soi-disant le nez électroniques, qui sont des dispositifs capables de détecter rapidement les odeurs et les saveurs 2-4. Actuellement, il ya plusieurs disponibles dans le commerce nez électroniques capables d&#39;effectuer une analyse volatile, basé sur des technologies différentes. Le nez électronique utilisé dans notre travail (zNose, HNE, Newbury Park, CA, USA), se compose de chromatographie en phase gazeuse ultra-rapide couplé avec un capteur d&#39;ondes acoustiques de surface (UFGC-SAW). Cette technologie a déjà été testé pour sa capacité à contrôler la qualité des divers produits, y compris la détection de la détérioration de la pomme 5; maturité et de l&#39;évaluation pourriture dans la mangue 6; profilage arôme des espèces thymus 7; C 6 composés volatils dans les grains de raisin 8; caractérisation des 9 de l&#39;huile végétale et de la détection des falsifications dans huile de coco vierge 10. Ce système permet d&#39;effectuer les trois étapes principales de l&#39;analyse arôme: l&#39;échantillonnage espace libre, la séparation des composés volatils, et de détection. Dans environ une minute, la sortie, un chromatogramme, est produite et, après un cycle de purge, l&#39;instrument est prêt pour une analyse plus approfondie. Les résultats obtenus avec le zNose peuvent être comparés à ceux d&#39;autres systèmes chromatographie en phase gazeuse par le calcul des indices de Kovats (KI). Une fois que l&#39;instrument a été réglé avec une solution alcane standard, les temps de rétention sont automatiquement converties enKis. Toutefois, de légers changements de température et de débit sont censées se produire au fil du temps, entraînant des temps de rétention à la dérive. Également, en fonction de la polarité de la phase de colonne stationnaire, la reproductibilité des calculs KI peut varier de 11 unités d&#39;index plusieurs. Une série de programmes et des interfaces graphiques ont donc été mis au point pour comparer les informateurs clés calculé parmi les échantillons dans un mode semi-automatique. Ces programmes permettent de réduire le temps nécessaire pour l&#39;analyse chromatogramme de grands ensembles de données et de minimiser les risques de mauvaise interprétation des données lors de chromatogrammes ne sont pas parfaitement alignés. Nous présentons une méthode pour l&#39;analyse rapide composé volatile dans les fruits. Exemples des procédures de préparation, d&#39;acquisition de données et de manutention sont également discutés.

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Fruit Volatile Analysis Using an Electronic Nose

Une méthode rapide pour l&#39;analyse des composés volatils dans les fruits est décrite. Les composés volatils présents dans l&#39;espace de tête d&#39;un homogénat de l&#39;échantillon sont séparés et détectés rapidement à la chromatographie gazeuse ultra-rapide (GC) couplée à une onde acoustique de surface (SAW) du capteur. Une procédure de traitement des données et l&#39;analyse est également discuté.

Analyse de fruits instable avec un nez électronique

Numerous and diverse physiological changes occur during fruit ripening, including the development of a specific volatile blend that characterizes fruit ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Studying Aggression in Drosophila (fruit flies)

Aggression is an innate behavior that evolved in the framework of defending or obtaining resources. This complex social behavior is influenced by genetic, hormonal and environmental factors. In many organisms, aggression is critical to survival but controlling and suppressing aggression in distinct contexts also has become increasingly important. In recent years, invertebrates have become increasingly useful as model systems for investigating the genetic and systems biological basis of complex social behavior. This is in part due to the diverse repertoire of behaviors exhibited by these organisms. In the accompanying video, we outline a method for analyzing aggression in Drosophila whose design encompasses important eco-ethological constraints. Details include steps for: making a fighting chamber; isolating and painting flies; adding flies to the fight chamber; and video taping fights. This approach is currently being used to identify candidate genes important in aggression and in elaborating the neuronal circuitry that underlies the output of aggression and other social behaviors.

Studying Aggression in Drosophila fruit flies

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Recherche

Biologie

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Site directed mutagenesis of whole plasmids is a simple way to create slightly different variations of an original plasmid. With this method the cloned ...

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing measurement of multiple cellular phenotypes within a single assay. In this study, we utilized HCA to develop a novel assay for neurotoxicity. Neurotoxicity assessment represents an important part of drug safety evaluation, as well as being a significant focus of environmental protection efforts. Additionally, neurotoxicity is also a well-accepted in vitro marker of the development of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's and Parkinson's diseases. Recently, the application of HCA to neuronal screening has been reported. By labeling neuronal cells with &beta;III-tubulin, HCA assays can provide high-throughput, non-subjective, quantitative measurements of parameters such as neuronal number, neurite count and neurite length, all of which can indicate neurotoxic effects. However, the role of astrocytes remains unexplored in these models. Astrocytes have an integral role in the maintenance of central nervous system (CNS) homeostasis, and are associated with both neuroprotection and neurodegradation when they are activated in response to toxic substances or disease states. GFAP is an intermediate filament protein expressed predominantly in the astrocytes of the CNS. Astrocytic activation (gliosis) leads to the upregulation of GFAP, commonly accompanied by astrocyte proliferation and hypertrophy. This process of reactive gliosis has been proposed as an early marker of damage to the nervous system. The traditional method for GFAP quantitation is by immunoassay. This approach is limited by an inability to provide information on cellular localization, morphology and cell number. We determined that HCA could be used to overcome these limitations and to simultaneously measure multiple features associated with gliosis - changes in GFAP expression, astrocyte hypertrophy, and astrocyte proliferation - within a single assay. In co-culture studies, astrocytes have been shown to protect neurons against several types of toxic insult and to critically influence neuronal survival. Recent studies have suggested that the use of astrocytes in an in vitro neurotoxicity test system may prove more relevant to human CNS structure and function than neuronal cells alone. Accordingly, we have developed an HCA assay for co-culture of neurons and astrocytes, comprised of protocols and validated, target-specific detection reagents for profiling &beta;III-tubulin and glial fibrillary acidic protein (GFAP). This assay enables simultaneous analysis of neurotoxicity, neurite outgrowth, gliosis, neuronal and astrocytic morphology and neuronal and astrocytic development in a wide variety of cellular models, representing a novel, non-subjective, high-throughput assay for neurotoxicity assessment. The assay holds great potential for enhanced detection of neurotoxicity and improved productivity in neuroscience research and drug discovery.

This article describes a novel protocol and reagent set designed for sensitive measurement of neurotoxic effects of compounds and treatments on co-cultures of neurons and astrocytes using high content analysis. Results demonstrate that high content analysis represents an exciting novel technology for neurotoxicity assessment.

Un neuronale et astrocytes de co-culture de dosage pour l&#39;analyse du contenu haute de la neurotoxicité

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

An Optimized Protocol for Rearing Fopius arisanus, a Parasitoid of Tephritid Fruit Flies

Fopius arisanus (Sonan) is an important parasitoid of Tephritid fruit flies for at least two reasons. First, it is the one of only three opiine parasitoids known to infect the host during the egg stage1. Second, it has a wide range of potential fruit fly hosts. Perhaps due to its life history, F. arisanus has been a successfully used for biological control of fruit flies in multiple tropical regions2-4. One impediment to the wide use of F. arisanus for fruit fly control is that it is difficult to establish a stable laboratory colony5-9. Despite this difficulty, in the 1990s USDA researchers developed a reliable method to maintain laboratory populations of F. arisanus10-12. There is significant interest in F. arisanus biology13,14, especially regarding its ability to colonize a wide variety of Tephritid hosts14-17; interest is especially driven by the alarming spread of Bactrocera fruit fly pests to new continents in the last decade18. Further research on F. arisanus and additional deployments of this species as a biological control agent will benefit from optimizations and improvements of rearing methods. In this protocol and associated video article we describe an optimized method for rearing F. arisanus based on a previously described approach12. The method we describe here allows rearing of F. arisanus in a small scale without the use of fruit, using materials available in tropical regions around the world and with relatively low manual labor requirements.

An Optimized Protocol for Rearing Fopius arisanus, a Parasitoid of Tephritid Fruit Flies

Fopius arisanus is an egg-larval parasitoid of Tephritid fruit flies that is successfully used in biological control of these important tropical pests. We describe here an optimized protocol for rearing F. arisanus on a small scale using readily available materials.

Un protocole optimisé pour l&#39;élevage Fopius arisanus, Un parasitoïde des mouches des fruits Tephritidae

Fopius arisanus (Sonan) is an important parasitoid of Tephritid fruit flies for at least two reasons. First, it is the one of only three opiine ...

Isolation and Biophysical Study of Fruit Cuticles

The cuticle, a hydrophobic protective layer on the aerial parts of terrestrial plants, functions as a versatile defensive barrier to various biotic and abiotic stresses and also regulates water flow from the external environment.1 A biopolyester (cutin) and long-chain fatty acids (waxes) form the principal structural framework of the cuticle; the functional integrity of the cuticular layer depends on the outer 'epicuticular' layer as well as the blend consisting of the cutin biopolymer and 'intracuticular' waxes.2 Herein, we describe a comprehensive protocol to extract waxes exhaustively from commercial tomato (Solanum lycopersicum) fruit cuticles or to remove epicuticular and intracuticular waxes sequentially and selectively from the cuticle composite. The method of Jetter and Sch&auml;ffer (2001) was adapted for the stepwise extraction of epicuticular and intracuticular waxes from the fruit cuticle.3,4 To monitor the process of sequential wax removal, solid-state cross-polarization magic-angle-spinning (CPMAS) 13C NMR spectroscopy was used in parallel with atomic force microscopy (AFM), providing molecular-level structural profiles of the bulk materials complemented by information on the microscale topography and roughness of the cuticular surfaces. To evaluate the cross-linking capabilities of dewaxed cuticles from cultivated wild-type and single-gene mutant tomato fruits, MAS 13C NMR was used to compare the relative proportions of oxygenated aliphatic (CHO and CH2O) chemical moieties.
Exhaustive dewaxing by stepwise Soxhlet extraction with a panel of solvents of varying polarity provides an effective means to isolate wax moieties based on the hydrophobic characteristics of their aliphatic and aromatic constituents, while preserving the chemical structure of the cutin biopolyester. The mechanical extraction of epicuticular waxes and selective removal of intracuticular waxes, when monitored by complementary physical methodologies, provides an unprecedented means to investigate the cuticle assembly: this approach reveals the supramolecular organization and structural integration of various types of waxes, the architecture of the cutin-wax matrix, and the chemical composition of each constituent. In addition, solid-state 13C NMR reveals differences in the relative numbers of CHO and CH2O chemical moieties for wild-type and mutant red ripe tomato fruits. The NMR techniques offer exceptional tools to fingerprint the molecular structure of cuticular materials that are insoluble, amorphous, and chemically heterogeneous. As a noninvasive surface-selective imaging technique, AFM furnishes an effective and direct means to probe the structural organization of the cuticular assembly on the nm-&mu;m length scale.

Aerial plant organs are protected by the cuticle, a supramolecular biopolyester-wax assembly. We present protocols to monitor selective removal of epi- and intracuticular waxes from tomato fruit cuticles on molecular and micro scales by solid-state NMR and atomic force microscopy, respectively, and to assess the cross-linking capacity of engineered cuticular biopolyesters.

Isolement et étude biophysique des cuticules de fruits

The cuticle, a hydrophobic protective layer on the aerial parts of terrestrial plants, functions as a versatile defensive barrier to various biotic and ...

Analysis of SNARE-mediated Membrane Fusion Using an Enzymatic Cell Fusion Assay

The interactions of SNARE (soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor) proteins on vesicles (v-SNAREs) and on target membranes (t-SNAREs) catalyze intracellular vesicle fusion1-4. Reconstitution assays are essential for dissecting the mechanism and regulation of SNARE-mediated membrane fusion5. In a cell fusion assay6,7, SNARE proteins are expressed ectopically at the cell surface. These "flipped" SNARE proteins drive cell-cell fusion, demonstrating that SNAREs are sufficient to fuse cellular membranes. Because the cell fusion assay is based on microscopic analysis, it is less efficient when used to analyze multiple v- and t-SNARE interactions quantitatively.
Here we describe a new assay8 that quantifies SNARE-mediated cell fusion events by activated expression of &beta;-galactosidase. Two components of the Tet-Off gene expression system9 are used as a readout system: the tetracycline-controlled transactivator (tTA) and a reporter plasmid that encodes the LacZ gene under control of the tetracycline-response element (TRE-LacZ). We transfect tTA into COS-7 cells that express flipped v-SNARE proteins at the cell surface (v-cells) and transfect TRE-LacZ into COS-7 cells that express flipped t-SNARE proteins at the cell surface (t-cells). SNARE-dependent fusion of the v- and t-cells results in the binding of tTA to TRE, the transcriptional activation of LacZ and expression of &beta;-galactosidase. The activity of &beta;-galactosidase is quantified using a colorimetric method by absorbance at 420 nm.
The vesicle-associated membrane proteins (VAMPs) are v-SNAREs that reside in various post-Golgi vesicular compartments10-15. By expressing VAMPs 1, 3, 4, 5, 7 and 8 at the same level, we compare their membrane fusion activities using the enzymatic cell fusion assay. Based on spectrometric measurement, this assay offers a quantitative approach for analyzing SNARE-mediated membrane fusion and for high-throughput studies.

We have developed a cell fusion assay that quantifies SNARE-mediated membrane fusion events by activated expression of &beta;-galactosidase.

Analyse de la fusion membranaire médiée SNARE en utilisant un dosage enzymatique cellulaire Fusion

The interactions of SNARE (soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor)  proteins on vesicles (v-SNAREs) and on target membranes ...

Laboratory Protocol for Genetic Gut Content Analyses of Aquatic Macroinvertebrates Using Group-specific rDNA Primers

Analyzing food webs is essential for a better understanding of ecosystems. For example, food web interactions can undergo severe changes caused by the invasion of non-indigenous species. However, an exact identification of field predator-prey interactions is difficult in many cases. These analyses are often based on a visual evaluation of gut content or the analysis of stable isotope ratios (&#948;15N and &#948;13C). Such methods require comprehensive knowledge about, respectively, morphologic diversity or isotopic signature from individual prey organisms, leading to obstacles in the exact identification of prey organisms. Visual gut content analyses especially underestimate soft bodied prey organisms, because maceration, ingestion and digestion of prey organisms make identification of specific species difficult. Hence, polymerase chain reaction (PCR) based strategies, for example the use of group-specific primer sets, provide a powerful tool for the investigation of food web interactions. Here, we describe detailed protocols to investigate the gut contents of macroinvertebrate consumers from the field using group-specific primer sets for nuclear ribosomal deoxyribonucleic acid (rDNA). DNA can be extracted either from whole specimens (in the case of small taxa) or out of gut contents of specimens collected in the field. Presence and functional efficiency of the DNA templates need to be confirmed directly from the tested individual using universal primer sets targeting the respective subunit of DNA. We also demonstrate that consumed prey can be determined further down to species level via PCR with unmodified group-specific primers combined with subsequent single strand conformation polymorphism (SSCP) analyses using polyacrylamide gels. Furthermore, we show that the use of different fluorescent dyes as labels enables parallel screening for DNA fragments of different prey groups from multiple gut content samples via automated fragment analysis.

Most common gut content analyses of macroinvertebrates are visual. Requiring intense knowledge about morphological diversity of prey organisms, they miss soft bodied prey and, due to strong comminution of prey, are nearly impossible for some organisms, including amphipods. We provide detailed, novel genetic approaches for macroinvertebrate prey identification in the diet of amphipods.

Protocole de laboratoire pour les Analyses de contenu Gut génétiques de macroinvertébrés aquatiques Using Group-specific ADNr amorces

Analyzing food webs is essential for a better understanding of ecosystems. For example, food web interactions can undergo severe changes caused by the ...

Simple Homemade Tools to Handle Fruit Flies&#8212;Drosophila melanogaster

The fruit fly, Drosophila melanogaster, is widely used both in biological research and biology education. Handling adult flies is common but difficult in practice, as adult flies fly. Demonstrated here is how to make some simple and cost-effective tools to address difficult issues in the handling of Drosophila. Holes in foam stoppers are made and pipette tips or funnels are inserted into the holes. Flies then move only in one direction into the pipette tip/funnel assemblage, allowing efficient control of the transfer of adult Drosophila into or out of a vial. Existing protocols have been modified for cool-anesthetizing flies by chilling in crushed ice and transferring them onto a cold, hard icepack surface. The icepack is covered with a piece of medical gauze that keeps immobilized flies from the condensed water when examined under a stereomicroscope. The flies are finally euthanized for counting and sorting or discarded by microwaving. A bottle-shaped cage has also been developed for collecting eggs, as well as a labor-saving device and accompanying protocol for cleaning glass culture vials.

Simple Homemade Tools to Handle Fruit Flies&amp;#8212;&lt;em&gt;Drosophila melanogaster&lt;/em&gt;

Described here is the use of several homemade tools to transfer, chill, and kill adult Drosophila, as well as to clean glass culture vials and collect eggs. These tools are easy to make and are rather efficient in handling Drosophila.

Outils faits maison simples pour manipuler les mouches des fruits—Drosophila melanogaster

The fruit fly, Drosophila melanogaster, is widely used both in biological research and biology education. Handling adult flies is common but difficult in ...

Topical Application Bioassay to Quantify Insecticide Toxicity for Mosquitoes and Fruit Flies

The continued use of insecticides for public health and agriculture has led to widespread insecticide resistance and hampering of control methods. Insecticide resistance surveillance of mosquito populations is typically done through Centers for Disease Control and Prevention (CDC) bottle bioassays or World Health Organization (WHO) tube tests. However, these methods can result in a high degree of variability in mortality data due to variable insecticide contact with&#160;the insect, the relatively small numbers of organisms tested, extensive variation in mass between populations, and constantly changing environmental conditions, leading to variable outcomes. This paper presents the topical application bioassay, adapted as a high-throughput phenotypic bioassay for both mosquitoes and fruit flies, to test large numbers of insects along&#160;a range of insecticide concentrations.
This assay 1) ensures consistent treatment and insecticide contact with every organism, 2) produces highly specific dose-response curves that account for differences in average mass between strains and sexes (which is particularly important for field-collected organisms), and 3) allows for the calculation of statistically rigorous median lethal doses (LD50), which are necessary for resistance ratio comparisons-an alternative surveillance approach from diagnostic dose mortality, which is also used for larvicide resistance surveillance. This assay will be a complementary tool for accurately phenotyping mosquito populations and, as illustrated using fruit flies, is easily adaptable for use with other insects. We argue that this assay will help fill the gap between genotypic and phenotypic insecticide resistance in multiple insect species.

We describe the methodology and importance of the topical application bioassay to measure insecticide susceptibility in mosquitoes and fruit flies. The presented assay is high-throughput, utilizes insect mass-thus allowing for calculating a mass-relativized lethal dose instead of concentration-and likely has lower variability than other similar methods.

Essai biologique d’application topique pour quantifier la toxicité des insecticides pour les moustiques et les mouches des fruits

The continued use of insecticides for public health and agriculture has led to widespread insecticide resistance and hampering of control methods. ...

Protocols for CRISPR/Cas9 Mutagenesis of the Oriental Fruit Fly Bactrocera dorsalis

The Oriental fruit fly, Bactrocera dorsalis, is a highly invasive and adaptive pest species that causes damage to citrus and over 150 other fruit crops worldwide. Since adult fruit flies have great flight capacity and females lay their eggs under the skins of fruit, insecticides requiring direct contact with the pest usually perform poorly in the field. With the development of molecular biological tools and high-throughput sequencing technology, many scientists are attempting to develop environmentally friendly pest management strategies. These include RNAi or gene editing-based pesticides that downregulate or silence genes (molecular targets), such as olfactory genes involved in searching behavior, in various insect pests. To adapt these strategies for Oriental fruit fly control, effective methods for functional gene research are needed. Genes with critical functions in the survival and reproduction of B. dorsalis serve as good molecular targets for gene knockdown and/or silencing. The CRISPR/Cas9 system is a reliable technique used for gene editing, especially in insects. This paper presents a systematic method for CRISPR/Cas9 mutagenesis of B. dorsalis, including the design and synthesis of guide RNAs, collecting embryos, embryo injection, insect rearing, and mutant screening. These protocols will serve as a useful guide for generating mutant flies for researchers interested in functional gene studies in B. dorsalis.

Protocols for CRISPR/Cas9 Mutagenesis of the Oriental Fruit Fly Bactrocera dorsalis

This paper presents the step-by-step protocols for CRISPR/Cas9 mutagenesis of the Oriental fruit fly Bactrocera dorsalis. Detailed steps provided by this standardized protocol will serve as a useful guide for generating mutant flies for functional gene studies in B. dorsalis.

Protocoles pour la mutagenèse CRISPR/Cas9 de la mouche orientale des fruits Bactrocera dorsalis

The Oriental fruit fly, Bactrocera dorsalis, is a highly invasive and adaptive pest species that causes damage to citrus and over 150 other fruit crops ...