Name: fruit volatile analysis using an electronic nose
Uploaded: 2012-03-30T13:00:00
Duration: 11 min 2 s
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Die Autoren danken Bill Copes (Harris Moran Seed Company, Davis) zur Bereitstellung von Melone Früchte für diese Analyse. Dieses Projekt wird von der Sonderkulturen Research Initiative Competitive Grants Program unterstützt gewähren keine. 2009-51181-05783 von der USDA National Institute of Food and Agriculture.

1. Probenvorbereitung <ol><li> Ernte-Früchte an den gewünschten Reifegrad. Spülen mit Leitungswasser, um Schmutz und Staub zu entfernen. </li><li> Wählen Sie Früchte für die Analyse auf die Abwesenheit von externen und internen Fehlern und Größe Homogenität basiert. </li><li> Schneiden Sie das Obst der Länge nach in Keile für flüchtige Probenahme verwendet werden. Entfernen Sie gegebenenfalls Haut, Samen, Samenhöhle Gewebe oder Grube. Obst Gewebe Auswahl muss für das gesamte Experiment konsistent und berücksichtigen die Variabilität innerhalb einer einzigen Frucht (dh Probe erhalten gleichermaßen von der äquatorialen, Blüte und Stiel Endteile). </li><li> Kombinieren Sie die ausgewählten Obst Gewebe, mischen Sie es, um es zufällig, und dann abwiegen 200 g in einen Mixer geben. </li><li> In 200 ml gesättigter CaCl 2-Lösung (372,5 g bei 20 ° C, in 500 ml VE-Wasser) und 50 ul einer 100 mM Lösung von 2-Methylbutyl Isovalerat in Methanol. Die CaCl 2 zur Verwendung als Inhibitor der enzymatischen ac handelntivität, die nach dem Schneiden und Homogenisieren der Fruchtfleisch auftreten könnten. 2-Methylbutyl Isovalerat wird als interner Standard zugesetzt, um die mögliche Verluste von flüchtigen Verbindungen während der Homogenisierung zu überwachen. </li><li> Homogenisieren Mischung in einer Labor-Mixer (Waring, USA), für 30 Sekunden bei 18.000 UpM, dann sofort in Glasflasche mit Teflon-Dichtung und Deckel gießen. Halten Sie das Homogenat in der Flasche bei Raumtemperatur, bis alle Proben vorbereitet werden. </li><li> Nach dem Gießen des Homogenat in die Flasche 10 Minuten warten, um die Trennung von dem Schaum aus der Flüssigkeit, dann 5 ml Aliquots der Flüssigkeit zu ermöglichen, ohne Schaum, in 20 ml Braunglasflasche, Fläschchen und versiegeln Sie die Flaschen mit Schraubverschlüssen Stahl mit Teflon ausgerüstet / Silikon-Septen. Dieses Verfahren eignet sich für Melone und Birne Homogenat Vorbereitung. Wenn andere Früchte für die Analyse verwendet werden, könnte ein Zentrifugationsschritt erforderlich sein. Daher nehmen Sie den Schaum und dann zentrifugiert, um die Flüssigkeit Pellet-Teilchen, die möglicherweisebehindern die Pipette. Bereiten Sie mindestens drei Fläschchen pro Probe zu dienen als technische repliziert. </li><li> An diesem Punkt können die Proben sofort analysiert werden oder in flüssigem Stickstoff schockgefroren und gelagert bei extrem niedrigen Temperaturen (-80 ° C) für eine spätere Analyse. </li><li> Für tiefgefrorene Proben ist auf die Analyse Tag entfernen die Proben aus dem Gefrierschrank und lassen Sie sie für eine Stunde bei Raumtemperatur auftauen. Nach dem Auftauen und vor der Analyse, ersetzen Sie die Kappe der durch eine neue, die eine saubere, trockene Septum hat. Wenn das Septum nicht ersetzt wird, kann Wasser auf dem Septum beim Auftauen kondensiert in das Gerät gezogen werden und es beschädigen. </li></ol> 2. Gaschromatographie-Surface Acoustic Wave (SAW-GC) Set-up-und Datenkommunikation <ol><li> Legen Sie das entsprechende Analyse-Methode für das zNose. Für die Analyse der Ester-reiche flüchtigen Profil von Melone, sind unsere Parameter in der Version 5.44.22 Microsense Software (Newbury Park, CA, USA) wie folgt: Kopfraum Ansaugen in dieEinlass für 20 Sekunden bei 30 ml min -1 über Pumpe; Eintrittstemperatur bei 200 ° C; Tenax-Fallen-Temperatur bei 225 ° C; Trägergas (Helium Reinheit 99,999%) Fließgeschwindigkeit von 2,9 ml min-1; Spalte (DB-5 Spalte 1 m × 0,25 mm ID × 0,25 um Filmdicke) Temperaturprogramm von 45 ° C bis 180 ° C mit einer Geschwindigkeit von 10 ° C s -1; Sensor Temperatur bei 40 ° C, Ventil bei 165 ° C Die gesamte Analyse beträgt 1 Minute pro Probe. </li><li> Schließen Sie eine Nadel aus Edelstahl mit Nicht-Kern versehene Spitze der zNose Einlass und spülen Sie das System mehrmals mit Umgebungsluft, bis die Basislinie stabil ist und keine Spitzen mehr als 200 Counts (Ct) werden erkannt. </li><li> Stimmen Sie das Instrument mit einer Lösung von geradkettigen Alkanen (C6-C14). Die Melodie wird mit dem Instrument-Software verwendet, um die Verweilzeit der eluierten Peaks von Zeiteinheiten umwandeln in Kovats-Index (KI) Einheiten. Folglich, nachdem das System eingestellt ist, werden die Verweilzeiten in KI-Einheiten angegeben. </li&gt; <li> Vor der Analyse der Probe zu ermöglichen für 30 min lang sich ausgleichen. Um eines der Probenfläschchen analysieren, legen Sie eine Nadel in die Fläschchenseptum, um den Druck zu entlasten. Dann führen Sie die Nadel an das Instrument angeschlossenen Einlass in die Fläschchenseptum und initiieren Headspace Sampling. Analysieren Sie mindestens drei technischen Replikate pro Probe. </li><li> Manuelles Starten des Gerätes, indem Sie auf &quot;Play&quot; drücken, die Pumpe aktiviert wird und zieht sich die Dämpfe über der Probe zu präsentieren. Am Ende der Analyse, wird ein Chromatogramm auf dem Bildschirm, und der Sensor wird automatisch auf 150 ° C für 10 Sekunden erhitzt, um es zu reinigen. Wenn das System Status-Box-Taste wieder gelb wird, ist das Instrument bereit, eine weitere Probe zu analysieren. </li><li> Um eine stabile Grundlinie und ordnungsgemäße Reinigung des Systems zu gewährleisten, führen Sie mindestens eine leere Luft zwischen jeder Probe. Um auf mögliche flüchtige Verunreinigungen aus dem Fläschchen und Kappe überwachen, analysieren zwei Fläschchen-Rohlinge (leeres Fläschchen mit Kappe), am Anfang und am Ende des Tages. &lt;/ Li&gt; </ol> 3. Datenexport und-analyse <ol><li> Exportieren Sie die Daten in eine Microsoft Excel-Datei nach der Übernahme mit dem &quot;Peak Logging&quot;-Funktion in Microsense Software. Sobald die Daten exportiert werden, fügen Sie Spalten mit Etiketten für Variablen und repliziert. </li><li> Verwandeln Sie das Datenformat für eine einfachere Manipulation mit dem Python (Version 2.6; frei verfügbaren Online-) Skript, das wir entwickelt, mit dem Namen &quot;reform_data.py&quot; (siehe Abbildung 1 zeigt ein Beispiel für das Datenformat vor und nach mit dem Skript &quot;reform_data. py &quot;). Der Name der Quelldatei (xls-Format) und Blattname für die eingegebenen Daten sowie den gewünschten Dateinamen für die Ausgabe (xls-Format), werden direkt in dem Skript bearbeitet. </li><li> Start &quot;kim_interface.py&quot; (auch in Python 2.6 geschrieben; siehe Abbildung 2), und importieren Sie die Daten aus der Datei im vorigen Schritt generiert. Insbesondere wird die Analyse zum Anzeigen und Analysieren der Anzahl, wie oft jeder KI-Wert festgestellt wurde basierend(&quot;KI Hits&quot;). So zeigt das Programm ein Balkendiagramm der KI Treffern für jedes KI-Wert. </li><li> Werten Sie die KI Treffern spezifischer Untergruppen von Proben, die Analyse jede Gruppe von technischen Replikaten zusammen. Dazu analysieren jede Behandlung oder Variable einzeln, indem Sie / Deaktivieren der entsprechenden Felder ein. Siehe Abbildung 2 Beschriftung für detaillierte Beschreibung der grafischen Benutzeroberfläche (GUI)-Funktionen. </li><li> Nach der Identifizierung der Breite der einzelnen KI-Fenster über die GUI, nach dem Zufallsprinzip auszuwählen einige der entsprechenden Chromatogramme in Microsense Software und bewerten überlappenden Peaks unter den technischen Replikaten. Siehe Abbildung 3 zeigt ein Beispiel für überlagerte Chromatogramme von zwei technischen Replikaten. </li><li> Sobald die KI-Fenster wird individualisiert, verwenden Sie die &quot;Merge&quot;-Funktion finden Sie in der GUI die KIS, die im Fenster fallen, in den am dichtesten bevölkerten KI verschmelzen. Mit Hilfe dieser Funktion werden Peaks mit einer Reihe von KI-Werte beschriftet unter einem KI-Label, allowi konsolidiertng der Behandlung solcher Gipfel als eine einzelne Variable. Um dies zu tun, zuerst auf dem &quot;Merge&quot;-Taste klicken, um die Funktion zu aktivieren und wählen Sie den am dichtesten bevölkerten KI als die Mitte des Fensters mit der linken Maustaste die entsprechende Leiste. Sobald die Leiste ausgewählt wurde, ändert es seine Farbe und wird grün. Um die KIS, die innerhalb des Fensters lassen sich in dem ausgewählten KI verschmelzen, auf den entsprechenden Balken der rechten Maustaste auf, dies bewirkt, dass die Balken rot werden, während ein blauer Balken der entsprechenden Länge auf der Oberseite des zentralen KI hinzugefügt wird (siehe Abbildung 4 ). Nachdem alle ausgewählten KIS haben in den entsprechenden zentralen KI wurden zusammengelegt, auf der &quot;Merge&quot;-Taste erneut klicken, um die Änderungen zu akzeptieren; dies bewirkt die &quot;Merge&quot;-Taste, um vergilben. Bei Fehlern wird die &#39;Unmerge &quot;-Taste zur Verfügung. Um unmergen, klicken Sie auf den &#39;Unmerge&#39; Button in der GUI, dann auf die rote Leiste Sie unmergen rechten Maustaste darauf. Von rot, wird der Balken blau. Klicken Sie auf die &#39;Unmerge&#39; Taste erneut, um die Änderungen zu übernehmen. </li><li> Wenn man versucht, incorrectly verschmelzen zwei Peaks in einer einzigen Probe in einem einzigen KI-Wert, wird eine Fehlermeldung ausgegeben. In einem solchen Fall genau zu prüfen, das Chromatogramm und definieren die KI-Fenster in dieser Region. </li><li> Nachdem alle der fusionierenden Operationen durchgeführt worden sind, speichern Sie die Datei. </li><li> Bevor Sie mit statistischen Auswertung werden die Chromatogramme der Luft und Fläschchen Leerzeichen analysiert, um mögliche Verunreinigungen zu überwachen. Sobald die KI der Spitzen in die Lücken identifiziert worden sind, subtrahiert die Fläche des Peaks in der Luft und / oder Fläschchen-Rohlings aus der Fläche des Peaks in der Probe vorhanden erkannt. Dann mit statistischer Analyse fortzufahren. </li></ol> 4. Repräsentative Ergebnisse Die elektronische Nase war in der Lage, Unterschiede in der flüchtigen Profile unter Melonenfrucht an verschiedenen Reifestadien (Abbildung 5) geerntet zu erkennen. Zwanzig KI Fenster wurden in allen Proben identifiziert. Eine Varianzanalyse zeigte, dass 14 Gipfel Detected durch die elektronische Nase deutlich zwischen Reife Stufen variiert. In Abbildung 6 werden die Protokolldateien der mittleren Peakflächen von diesen 14 Komponenten aufgetragen, um Unterschiede in der Peak-Häufigkeiten zwischen zwei Reifestadien, früh reif und voll reifer Früchte zu zeigen. <img alt="1" src="/files/ftp_upload/3821/3821fig1.jpg" /> 1. Beispiele für Datenformat Gerätesoftware (A) und nach der Transformation unter Verwendung &quot;reform_data.py&quot; Skript (B). Ausgeführt Um die Datenmanipulation und Analyse zu erleichtern, alle eindeutigen KIS in allen Proben identifiziert werden, dann werden die Daten mit der Probe Informationen in Zeilen und Peakfläche in Spalten, entsprechend einzigartigen KIS neu geordnet werden. Wenn ein Peak nicht für eine KI-Wert in einer Probe nachgewiesen, bleibt die entsprechende Zelle leer. <img alt="2" src="/files/ftp_upload/3821/3821fig2.jpg" /> Abbildung 2. Screen Capture aus der Taschet Datei &quot;kim_interface.py&quot;. Das Grundstück in der Mitte zeigt Anzahl der Treffer pro KI gegen KI. &quot;Hit pro KI &#39;ist die Anzahl der Proben, bei denen ein Peak mit diesem spezifischen KI erkannt wurde. Auf der linken Seite gibt es drei gelben Kästen die Steuerung der ausgewählten Daten. Sie zeigen, um den Parameter-Datensatz (Behandlungen, repliziert, qualitative Variablen, etc.) zu unterteilen. In dieser Abbildung sind sie (von oben nach unten): Variety, Bepflanzung Datum und Reifephase bei der Ernte. Auf dem Boden: mit einem Klick auf den 3 Bars und das Bewegen der blaue Balken nach links oder nach rechts, kann man wählen Sie den minimalen und den maximalen Wert des KI-Bereich und der minimalen Peakfläche (&quot;Threshold&quot;). Auf der rechten Seite: die &quot;Merge&quot;-Taste erlaubt das Zusammenführen von manuell ausgewählten KIS einen Klick auf den Balken in der Handlung. Die &#39;Unmerge&#39; Button erlaubt es, den Prozess für ausgewählte Fälle rückgängig zu machen. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/3821/3821fig3.jpg" /> Abbildung 3. Überlagerte Chromatogramme (in<html> schwarz und rot) von zwei technische Replikate aus Melone flüchtigen Kopfraum, um eine Verschiebung der Retentionszeit zu illustrieren. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/3821/3821fig4.jpg" /> Abbildung 4. Beispiel für die Verschmelzung KI Prozedur. In der zentralen Handlung, stellt der grüne Balken (Central KI) das bevölkerungsreichste KI, die als Zentrum der KI-Fenster ausgewählt wurde. KI und KI X Y KIS fallen in das Fenster von Interesse und sie benötigen, um in den zentralen KI zusammengeführt werden. Mit der rechten Maustaste auf KI X-Bar, wird sie rot und, zur gleichen Zeit, wird ein blauer Balken die gleiche Länge von KI X-Bar, auf der Oberseite der grünen. Durch Wiederholen der gleichen Verfahren wie für KI Y, die Länge des blauen Balken (fusioniert KIS) wird der entsprechende Länge zu vergrößern. Sobald alle KIS wurden hinzugefügt, indem Sie auf den grünen &quot;Merge&quot;-Taste, um die Zusammenführung Enden, werden die Änderungen gespeichert, und die Farbe der Schaltfläche wird gelb. / Files/ftp_upload/3821/3821fig5.jpg &quot;/&gt; Abbildung 5. Zwei Chromatogramme von Melone Proben bei verschiedenen Reifestadien geerntet, reifen früh (oben) und vollreife (unten), um die Fähigkeit der elektronischen Nase auf Unterschiede in volatilen Häufigkeiten feststellen zu illustrieren. <img alt="6" src="/files/ftp_upload/3821/3821fig6.jpg" /> Abbildung 6. Radar Diagramm, das die Peakfläche von 14 vorhandenen Komponenten in zwei Melone Proben an zwei verschiedenen Reifestadien, früh reif und voll reif. Die Peakflächen werden in Log-Skala gemeldet, um den Vergleich zu visualisieren. Die Zahl am Ende jedes Strahls stellen die entsprechenden Kovats-Indizes.

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Wir haben nichts zu offenbaren.

Elektronische Nasen sind eine vielversprechende Methode für die schnelle, objektive Bewertung der Aromaprofile aus Früchten oder volatile-reichen Proben. Allerdings verschiebt sich in Verweildauer stellen eine Herausforderung für die Identifizierung der Peaks und könnte zu Fehlinterpretationen der Daten führen, wenn zwei Chromatogramme nicht perfekt ausgerichtet sind. Visuelle Inspektion der Chromatogramme zeigten, dass die Variabilität der Retentionszeiten unter den Proben häufig verursacht die gleiche Spitze mit leicht unterschiedlichen KI-Werte (etwa ± 10) gekennzeichnet werden. Diese in eine übertriebene Anzahl von einzigartigen KIS erkannt übersetzt. Um die Vorteile der Sachlage treffen, dass (a) verschiedene Verbindungen befinden sich in unterschiedlichen Reifestadien vorhanden und (b) technische Replikate sind annähernd identisch, zwei Computer-basierte Skripte (&quot;kim_merge.py&quot;, die die Routinen enthält für das Handling der Daten gewählt ist und &quot;kim_interface.py&quot;, die eine grafische Benutzeroberfläche (GUI) bietet) wurden systematisch entwickeltVergleich von Proben in einem semi-automatisiert, sehr zur Verringerung der Zeit für Chromatogramm Analyse großer Datenmengen benötigt werden. Diese Programme erlauben die Zusammenführung gegebenenfalls von Spitzen mit einer Reihe von KI-Werte unter einem KI Marker markiert ist. Dies dient zwei wichtigen Zwecken: (a) Es ermöglicht eine statistische Analyse auf solche Peaks als eine einzelne Variable zu behandeln, und (b) es ermöglicht Identifizierung der Peaks und Vergleich zu anderen Systemen und veröffentlichten Werten. Hier vorgestellten Ergebnisse zeigen, dass Melone Proben basierend auf Reife und Aroma-Profiling mit dem zNose System in Kombination mit angemessener KI Identifizierung konnte nicht benachteiligt werden. Dies stellt eine viel versprechende neue Technologie für die Analyse von flüchtigen Stoffen, die für die Qualitätskontrolle Programme verwendet werden können.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Calciumchlorid </td><td> MP Biomedical </td><td> 195088 </td><td></td></tr><tr><td> 2-Methylbutyl Isovalerat </td><td> SAFC Globale </td><td> W350613 </td><td> ≥ 98%, Natur-, FCC- </td></tr><tr><td> Methanol </td><td> Fisher Scientific </td><td> A411-4 </td><td></td></tr><tr><td> Phiole </td><td> Sigma / Supelco </td><td> SU860098 </td><td></td></tr><tr><td> Kappe </td><td> Sigma / Supelco </td><td> SU860101 </td><td></td></tr><tr><td> Labormischer </td><td> Waring Laborwissenschaft </td><td> 7009G </td><td> 2-Gang-Mixer, 1 - Liter-Glasbehälter </td></tr><tr><td> Flasche </td><td> Fisher Scientific </td><td> 06 bis 414-1C </td><td> Pyrex, 500 mL; Polypropylen-Plug-Dichtung </td></tr><tr><td> Nadel </td><td> Elektronischer Sensor Technology </td><td> TLC101046 </td><td> Side Loch Luer </td></tr><tr><td> Alkane Lösung </td><td> Elektronischer Sensor Technology </td><td></td><td> C6-C14-Alkanen Lösung in Methanol </td></tr><tr><td> zNose </td><td> Elektronischer Sensor Technology </td><td> Modell 4500 </td><td></td></tr><tr><td> DB-5 GC-Säule </td><td> Elektronischer Sensor Technology </td><td> SYS4500C5 </td><td></td></tr><tr><td> Microsense </td><td> Elektronischer Sensor Technology </td><td> Version 5.44.22 </td><td></td></tr><tr><td> Python 2.6 </td><td></td><td></td><td> Frei verfügbare Online- </td></tr><tr><td> &quot;Reform_data.py&quot; und &quot;kim_interface.py&quot; scripts</td><td></td><td></td><td> Skripten zur Verfügung stehen als ergänzendes Material auf JoVE </td></tr></tbody></table>

fruit volatile analysis using an electronic nose

Zahlreiche und vielfältige physiologische Veränderungen auftreten, während der Fruchtreife, einschließlich der Entwicklung eines spezifischen flüchtigen Mischung, die Fruchtaromen charakterisiert. Reife bei der Ernte ist einer der wichtigsten Einflussfaktoren für den Geschmack Qualität von Obst und Gemüse ein. Die Validierung robuste Methoden, um einer raschen Einschätzung der Fruchtreife und Aroma-Qualität würde eine bessere Bewirtschaftung der fortgeschrittenen Zuchtprogramme, Produktionsverfahren und Ernte Handhabung zu ermöglichen. In den letzten drei Jahrzehnten hat sich viel Forschung durchgeführt, um so genannte elektronische Nasen, die Geräte in der Lage, schnell zu erkennen Geruchs-und Geschmacksstoffe 2-4 sind zu entwickeln. Derzeit gibt es mehrere kommerziell erhältliche elektronische Nasen in der Lage, flüchtige Analyse, auf unterschiedlichen Technologien basieren durchzuführen. Die elektronische Nase in unsere Arbeit verwendet werden (zNose, EST, Newbury Park, CA, USA), besteht aus ultra-schnellen Gaschromatographie mit einem akustischen Oberflächenwellen-Sensor gekoppelt (UFGC-SAW). Reife und Fäulnis Auswertung in Mango-6;; Diese Technologie wurde bereits für seine Fähigkeit, die Qualität von verschiedenen Rohstoffen, einschließlich der Erkennung von Verschlechterung der Apfel 5 überwachen getestet Aroma Profilierung der Thymus Spezies 7; C 6 flüchtigen Verbindungen in Weintrauben 8; Charakterisierung von Pflanzenöl 9 und Nachweis von Verfälschungen in Virgin Coconut Oil 10. Dieses System kann die drei wichtigsten Schritte der Aroma-Analyse: Headspace-Probenahme, die Trennung von flüchtigen Verbindungen, und Detektion. In etwa einer Minute wird der Ausgang, ein Chromatogramm, hergestellt und nach einem Spülzyklus, das Instrument für die weitere Analyse. Die mit dem zNose erhaltenen Ergebnisse können mit denen anderer gaschromatographische Systeme durch Berechnung der Kovats-Indizes (KI) verglichen werden. Sobald das Instrument mit einem Alkan Standardlösung abgestimmt wurde, werden die Retentionszeiten automatisch umgewandeltKIS. Jedoch werden kleine Änderungen in der Temperatur und Flussrate das mit der Zeit auftreten, wodurch Retentionszeiten zu treiben. Auch abhängig von der Polarität der Kolonne stationären Phase kann die Reproduzierbarkeit von KI Berechnungen mehrere Index-Einheiten 11 variieren. Eine Reihe von Programmen und grafische Schnittstellen wurden daher entwickelt, um berechnete KIS zwischen den Proben in einem halb-automatisiert zu vergleichen. Diese Programme reduzieren die Zeit für Chromatogramm Analyse großer Datenmengen erforderlich ist und um das Risiko für Fehlinterpretationen der Daten, wenn Chromatogramme nicht perfekt ausgerichtet. Wir stellen eine Methode zur schnellen Analyse flüchtige Verbindung in Frucht. Probenvorbereitung, Datenaufnahme und Verfahren für den Umgang werden ebenfalls diskutiert.

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Fruit Volatile Analysis Using an Electronic Nose

Eine schnelle Methode zur Analyse flüchtiger Verbindungen in Obst wird beschrieben. Die flüchtigen Verbindungen in dem Kopfraum eines Homogenats der Probe schnell getrennt werden und damit mit ultra-schnellen Gaschromatographie (GC) mit einem Oberflächenwellen (SAW)-Sensor gekoppelt ist. Ein Verfahren zur Datenverarbeitung und-analyse wird ebenfalls diskutiert.

Obst-Volatile-Analyse mit einem elektronische Nase

Numerous and diverse physiological changes occur during fruit ripening, including the development of a specific volatile blend that characterizes fruit ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Studying Aggression in Drosophila (fruit flies)

Aggression is an innate behavior that evolved in the framework of defending or obtaining resources. This complex social behavior is influenced by genetic, hormonal and environmental factors. In many organisms, aggression is critical to survival but controlling and suppressing aggression in distinct contexts also has become increasingly important. In recent years, invertebrates have become increasingly useful as model systems for investigating the genetic and systems biological basis of complex social behavior. This is in part due to the diverse repertoire of behaviors exhibited by these organisms. In the accompanying video, we outline a method for analyzing aggression in Drosophila whose design encompasses important eco-ethological constraints. Details include steps for: making a fighting chamber; isolating and painting flies; adding flies to the fight chamber; and video taping fights. This approach is currently being used to identify candidate genes important in aggression and in elaborating the neuronal circuitry that underlies the output of aggression and other social behaviors.

Studying Aggression in Drosophila fruit flies

Studieren Aggression in Drosophila (Taufliege)

Aggression is an innate behavior that evolved in the framework of defending or obtaining resources.  This complex social behavior is influenced by ...

Forschung

Biologie

Homemade Site Directed Mutagenesis of Whole Plasmids

Site directed mutagenesis of whole plasmids is a simple way to create slightly different variations of an original plasmid. With this method the cloned target gene can be altered by substitution, deletion or insertion of a few bases directly into a plasmid. It works by simply amplifying the whole plasmid, in a non PCR-based thermocycling reaction. During the reaction mutagenic primers, carrying the desired mutation, are integrated into the newly synthesized plasmid. In this video tutorial we demonstrate an easy and cost effective way to introduce base substitutions into a plasmid. The protocol works with standard reagents and is independent from commercial kits, which often are very expensive. Applying this protocol can reduce the total cost of a reaction to an eighth of what it costs using some of the commercial kits. In this video we also comment on critical steps during the process and give detailed instructions on how to design the mutagenic primers.

Site directed mutagenesis of whole plasmids is a simple way to create slightly different variations of an original plasmid. Here we demonstrate an easy and cost effective way to introduce base substitutions into a plasmid using standard reagents.

Hausgemachte Mutagenese von Whole Plasmide

Site directed mutagenesis of whole plasmids is a simple way to create slightly different variations of an original plasmid. With this method the cloned ...

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing measurement of multiple cellular phenotypes within a single assay. In this study, we utilized HCA to develop a novel assay for neurotoxicity. Neurotoxicity assessment represents an important part of drug safety evaluation, as well as being a significant focus of environmental protection efforts. Additionally, neurotoxicity is also a well-accepted in vitro marker of the development of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's and Parkinson's diseases. Recently, the application of HCA to neuronal screening has been reported. By labeling neuronal cells with &beta;III-tubulin, HCA assays can provide high-throughput, non-subjective, quantitative measurements of parameters such as neuronal number, neurite count and neurite length, all of which can indicate neurotoxic effects. However, the role of astrocytes remains unexplored in these models. Astrocytes have an integral role in the maintenance of central nervous system (CNS) homeostasis, and are associated with both neuroprotection and neurodegradation when they are activated in response to toxic substances or disease states. GFAP is an intermediate filament protein expressed predominantly in the astrocytes of the CNS. Astrocytic activation (gliosis) leads to the upregulation of GFAP, commonly accompanied by astrocyte proliferation and hypertrophy. This process of reactive gliosis has been proposed as an early marker of damage to the nervous system. The traditional method for GFAP quantitation is by immunoassay. This approach is limited by an inability to provide information on cellular localization, morphology and cell number. We determined that HCA could be used to overcome these limitations and to simultaneously measure multiple features associated with gliosis - changes in GFAP expression, astrocyte hypertrophy, and astrocyte proliferation - within a single assay. In co-culture studies, astrocytes have been shown to protect neurons against several types of toxic insult and to critically influence neuronal survival. Recent studies have suggested that the use of astrocytes in an in vitro neurotoxicity test system may prove more relevant to human CNS structure and function than neuronal cells alone. Accordingly, we have developed an HCA assay for co-culture of neurons and astrocytes, comprised of protocols and validated, target-specific detection reagents for profiling &beta;III-tubulin and glial fibrillary acidic protein (GFAP). This assay enables simultaneous analysis of neurotoxicity, neurite outgrowth, gliosis, neuronal and astrocytic morphology and neuronal and astrocytic development in a wide variety of cellular models, representing a novel, non-subjective, high-throughput assay for neurotoxicity assessment. The assay holds great potential for enhanced detection of neurotoxicity and improved productivity in neuroscience research and drug discovery.

This article describes a novel protocol and reagent set designed for sensitive measurement of neurotoxic effects of compounds and treatments on co-cultures of neurons and astrocytes using high content analysis. Results demonstrate that high content analysis represents an exciting novel technology for neurotoxicity assessment.

Eine Neuronale und Astrocyte Co-Kultur-Assay für High Content Analyse der Neurotoxizität

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

An Optimized Protocol for Rearing Fopius arisanus, a Parasitoid of Tephritid Fruit Flies

Fopius arisanus (Sonan) is an important parasitoid of Tephritid fruit flies for at least two reasons. First, it is the one of only three opiine parasitoids known to infect the host during the egg stage1. Second, it has a wide range of potential fruit fly hosts. Perhaps due to its life history, F. arisanus has been a successfully used for biological control of fruit flies in multiple tropical regions2-4. One impediment to the wide use of F. arisanus for fruit fly control is that it is difficult to establish a stable laboratory colony5-9. Despite this difficulty, in the 1990s USDA researchers developed a reliable method to maintain laboratory populations of F. arisanus10-12. There is significant interest in F. arisanus biology13,14, especially regarding its ability to colonize a wide variety of Tephritid hosts14-17; interest is especially driven by the alarming spread of Bactrocera fruit fly pests to new continents in the last decade18. Further research on F. arisanus and additional deployments of this species as a biological control agent will benefit from optimizations and improvements of rearing methods. In this protocol and associated video article we describe an optimized method for rearing F. arisanus based on a previously described approach12. The method we describe here allows rearing of F. arisanus in a small scale without the use of fruit, using materials available in tropical regions around the world and with relatively low manual labor requirements.

An Optimized Protocol for Rearing Fopius arisanus, a Parasitoid of Tephritid Fruit Flies

Fopius arisanus is an egg-larval parasitoid of Tephritid fruit flies that is successfully used in biological control of these important tropical pests. We describe here an optimized protocol for rearing F. arisanus on a small scale using readily available materials.

Ein optimiertes Protokoll für die Aufzucht Fopius arisanus, Fliegt ein Parasitoid von Tephritid Fruit

Fopius arisanus (Sonan) is an important parasitoid of Tephritid fruit flies for at least two reasons. First, it is the one of only three opiine ...

Isolation and Biophysical Study of Fruit Cuticles

The cuticle, a hydrophobic protective layer on the aerial parts of terrestrial plants, functions as a versatile defensive barrier to various biotic and abiotic stresses and also regulates water flow from the external environment.1 A biopolyester (cutin) and long-chain fatty acids (waxes) form the principal structural framework of the cuticle; the functional integrity of the cuticular layer depends on the outer 'epicuticular' layer as well as the blend consisting of the cutin biopolymer and 'intracuticular' waxes.2 Herein, we describe a comprehensive protocol to extract waxes exhaustively from commercial tomato (Solanum lycopersicum) fruit cuticles or to remove epicuticular and intracuticular waxes sequentially and selectively from the cuticle composite. The method of Jetter and Sch&auml;ffer (2001) was adapted for the stepwise extraction of epicuticular and intracuticular waxes from the fruit cuticle.3,4 To monitor the process of sequential wax removal, solid-state cross-polarization magic-angle-spinning (CPMAS) 13C NMR spectroscopy was used in parallel with atomic force microscopy (AFM), providing molecular-level structural profiles of the bulk materials complemented by information on the microscale topography and roughness of the cuticular surfaces. To evaluate the cross-linking capabilities of dewaxed cuticles from cultivated wild-type and single-gene mutant tomato fruits, MAS 13C NMR was used to compare the relative proportions of oxygenated aliphatic (CHO and CH2O) chemical moieties.
Exhaustive dewaxing by stepwise Soxhlet extraction with a panel of solvents of varying polarity provides an effective means to isolate wax moieties based on the hydrophobic characteristics of their aliphatic and aromatic constituents, while preserving the chemical structure of the cutin biopolyester. The mechanical extraction of epicuticular waxes and selective removal of intracuticular waxes, when monitored by complementary physical methodologies, provides an unprecedented means to investigate the cuticle assembly: this approach reveals the supramolecular organization and structural integration of various types of waxes, the architecture of the cutin-wax matrix, and the chemical composition of each constituent. In addition, solid-state 13C NMR reveals differences in the relative numbers of CHO and CH2O chemical moieties for wild-type and mutant red ripe tomato fruits. The NMR techniques offer exceptional tools to fingerprint the molecular structure of cuticular materials that are insoluble, amorphous, and chemically heterogeneous. As a noninvasive surface-selective imaging technique, AFM furnishes an effective and direct means to probe the structural organization of the cuticular assembly on the nm-&mu;m length scale.

Aerial plant organs are protected by the cuticle, a supramolecular biopolyester-wax assembly. We present protocols to monitor selective removal of epi- and intracuticular waxes from tomato fruit cuticles on molecular and micro scales by solid-state NMR and atomic force microscopy, respectively, and to assess the cross-linking capacity of engineered cuticular biopolyesters.

Isolierung und biophysikalische Untersuchung der Cuticula

The cuticle, a hydrophobic protective layer on the aerial parts of terrestrial plants, functions as a versatile defensive barrier to various biotic and ...

Analysis of SNARE-mediated Membrane Fusion Using an Enzymatic Cell Fusion Assay

The interactions of SNARE (soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor) proteins on vesicles (v-SNAREs) and on target membranes (t-SNAREs) catalyze intracellular vesicle fusion1-4. Reconstitution assays are essential for dissecting the mechanism and regulation of SNARE-mediated membrane fusion5. In a cell fusion assay6,7, SNARE proteins are expressed ectopically at the cell surface. These "flipped" SNARE proteins drive cell-cell fusion, demonstrating that SNAREs are sufficient to fuse cellular membranes. Because the cell fusion assay is based on microscopic analysis, it is less efficient when used to analyze multiple v- and t-SNARE interactions quantitatively.
Here we describe a new assay8 that quantifies SNARE-mediated cell fusion events by activated expression of &beta;-galactosidase. Two components of the Tet-Off gene expression system9 are used as a readout system: the tetracycline-controlled transactivator (tTA) and a reporter plasmid that encodes the LacZ gene under control of the tetracycline-response element (TRE-LacZ). We transfect tTA into COS-7 cells that express flipped v-SNARE proteins at the cell surface (v-cells) and transfect TRE-LacZ into COS-7 cells that express flipped t-SNARE proteins at the cell surface (t-cells). SNARE-dependent fusion of the v- and t-cells results in the binding of tTA to TRE, the transcriptional activation of LacZ and expression of &beta;-galactosidase. The activity of &beta;-galactosidase is quantified using a colorimetric method by absorbance at 420 nm.
The vesicle-associated membrane proteins (VAMPs) are v-SNAREs that reside in various post-Golgi vesicular compartments10-15. By expressing VAMPs 1, 3, 4, 5, 7 and 8 at the same level, we compare their membrane fusion activities using the enzymatic cell fusion assay. Based on spectrometric measurement, this assay offers a quantitative approach for analyzing SNARE-mediated membrane fusion and for high-throughput studies.

We have developed a cell fusion assay that quantifies SNARE-mediated membrane fusion events by activated expression of &beta;-galactosidase.

Analyse der SNARE-vermittelte Membranfusion Verwendung eines enzymatischen Cell Fusion Assay

The interactions of SNARE (soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor)  proteins on vesicles (v-SNAREs) and on target membranes ...

Laboratory Protocol for Genetic Gut Content Analyses of Aquatic Macroinvertebrates Using Group-specific rDNA Primers

Analyzing food webs is essential for a better understanding of ecosystems. For example, food web interactions can undergo severe changes caused by the invasion of non-indigenous species. However, an exact identification of field predator-prey interactions is difficult in many cases. These analyses are often based on a visual evaluation of gut content or the analysis of stable isotope ratios (&#948;15N and &#948;13C). Such methods require comprehensive knowledge about, respectively, morphologic diversity or isotopic signature from individual prey organisms, leading to obstacles in the exact identification of prey organisms. Visual gut content analyses especially underestimate soft bodied prey organisms, because maceration, ingestion and digestion of prey organisms make identification of specific species difficult. Hence, polymerase chain reaction (PCR) based strategies, for example the use of group-specific primer sets, provide a powerful tool for the investigation of food web interactions. Here, we describe detailed protocols to investigate the gut contents of macroinvertebrate consumers from the field using group-specific primer sets for nuclear ribosomal deoxyribonucleic acid (rDNA). DNA can be extracted either from whole specimens (in the case of small taxa) or out of gut contents of specimens collected in the field. Presence and functional efficiency of the DNA templates need to be confirmed directly from the tested individual using universal primer sets targeting the respective subunit of DNA. We also demonstrate that consumed prey can be determined further down to species level via PCR with unmodified group-specific primers combined with subsequent single strand conformation polymorphism (SSCP) analyses using polyacrylamide gels. Furthermore, we show that the use of different fluorescent dyes as labels enables parallel screening for DNA fragments of different prey groups from multiple gut content samples via automated fragment analysis.

Most common gut content analyses of macroinvertebrates are visual. Requiring intense knowledge about morphological diversity of prey organisms, they miss soft bodied prey and, due to strong comminution of prey, are nearly impossible for some organisms, including amphipods. We provide detailed, novel genetic approaches for macroinvertebrate prey identification in the diet of amphipods.

Laborprotokoll für genetische Darm Inhaltsanalysen der aquatischen Makroinvertebraten Using gruppenspezifische rDNA Primer

Analyzing food webs is essential for a better understanding of ecosystems. For example, food web interactions can undergo severe changes caused by the ...

Simple Homemade Tools to Handle Fruit Flies&#8212;Drosophila melanogaster

The fruit fly, Drosophila melanogaster, is widely used both in biological research and biology education. Handling adult flies is common but difficult in practice, as adult flies fly. Demonstrated here is how to make some simple and cost-effective tools to address difficult issues in the handling of Drosophila. Holes in foam stoppers are made and pipette tips or funnels are inserted into the holes. Flies then move only in one direction into the pipette tip/funnel assemblage, allowing efficient control of the transfer of adult Drosophila into or out of a vial. Existing protocols have been modified for cool-anesthetizing flies by chilling in crushed ice and transferring them onto a cold, hard icepack surface. The icepack is covered with a piece of medical gauze that keeps immobilized flies from the condensed water when examined under a stereomicroscope. The flies are finally euthanized for counting and sorting or discarded by microwaving. A bottle-shaped cage has also been developed for collecting eggs, as well as a labor-saving device and accompanying protocol for cleaning glass culture vials.

Simple Homemade Tools to Handle Fruit Flies&amp;#8212;&lt;em&gt;Drosophila melanogaster&lt;/em&gt;

Described here is the use of several homemade tools to transfer, chill, and kill adult Drosophila, as well as to clean glass culture vials and collect eggs. These tools are easy to make and are rather efficient in handling Drosophila.

Einfache hausgemachte Werkzeuge, um Fruchtfliegen zu behandeln —Drosophila melanogaster

The fruit fly, Drosophila melanogaster, is widely used both in biological research and biology education. Handling adult flies is common but difficult in ...

Topical Application Bioassay to Quantify Insecticide Toxicity for Mosquitoes and Fruit Flies

The continued use of insecticides for public health and agriculture has led to widespread insecticide resistance and hampering of control methods. Insecticide resistance surveillance of mosquito populations is typically done through Centers for Disease Control and Prevention (CDC) bottle bioassays or World Health Organization (WHO) tube tests. However, these methods can result in a high degree of variability in mortality data due to variable insecticide contact with&#160;the insect, the relatively small numbers of organisms tested, extensive variation in mass between populations, and constantly changing environmental conditions, leading to variable outcomes. This paper presents the topical application bioassay, adapted as a high-throughput phenotypic bioassay for both mosquitoes and fruit flies, to test large numbers of insects along&#160;a range of insecticide concentrations.
This assay 1) ensures consistent treatment and insecticide contact with every organism, 2) produces highly specific dose-response curves that account for differences in average mass between strains and sexes (which is particularly important for field-collected organisms), and 3) allows for the calculation of statistically rigorous median lethal doses (LD50), which are necessary for resistance ratio comparisons-an alternative surveillance approach from diagnostic dose mortality, which is also used for larvicide resistance surveillance. This assay will be a complementary tool for accurately phenotyping mosquito populations and, as illustrated using fruit flies, is easily adaptable for use with other insects. We argue that this assay will help fill the gap between genotypic and phenotypic insecticide resistance in multiple insect species.

We describe the methodology and importance of the topical application bioassay to measure insecticide susceptibility in mosquitoes and fruit flies. The presented assay is high-throughput, utilizes insect mass-thus allowing for calculating a mass-relativized lethal dose instead of concentration-and likely has lower variability than other similar methods.

Topische Anwendung Bioassay zur Quantifizierung der Insektizidtoxizität für Moskitos und Fruchtfliegen

The continued use of insecticides for public health and agriculture has led to widespread insecticide resistance and hampering of control methods. ...

Protocols for CRISPR/Cas9 Mutagenesis of the Oriental Fruit Fly Bactrocera dorsalis

The Oriental fruit fly, Bactrocera dorsalis, is a highly invasive and adaptive pest species that causes damage to citrus and over 150 other fruit crops worldwide. Since adult fruit flies have great flight capacity and females lay their eggs under the skins of fruit, insecticides requiring direct contact with the pest usually perform poorly in the field. With the development of molecular biological tools and high-throughput sequencing technology, many scientists are attempting to develop environmentally friendly pest management strategies. These include RNAi or gene editing-based pesticides that downregulate or silence genes (molecular targets), such as olfactory genes involved in searching behavior, in various insect pests. To adapt these strategies for Oriental fruit fly control, effective methods for functional gene research are needed. Genes with critical functions in the survival and reproduction of B. dorsalis serve as good molecular targets for gene knockdown and/or silencing. The CRISPR/Cas9 system is a reliable technique used for gene editing, especially in insects. This paper presents a systematic method for CRISPR/Cas9 mutagenesis of B. dorsalis, including the design and synthesis of guide RNAs, collecting embryos, embryo injection, insect rearing, and mutant screening. These protocols will serve as a useful guide for generating mutant flies for researchers interested in functional gene studies in B. dorsalis.

Protocols for CRISPR/Cas9 Mutagenesis of the Oriental Fruit Fly Bactrocera dorsalis

This paper presents the step-by-step protocols for CRISPR/Cas9 mutagenesis of the Oriental fruit fly Bactrocera dorsalis. Detailed steps provided by this standardized protocol will serve as a useful guide for generating mutant flies for functional gene studies in B. dorsalis.

Protokolle für CRISPR/Cas9-Mutagenese der Orientalischen Fruchtfliege Bactrocera dorsalis

The Oriental fruit fly, Bactrocera dorsalis, is a highly invasive and adaptive pest species that causes damage to citrus and over 150 other fruit crops ...