Name: fruit volatile analysis using an electronic nose
Uploaded: 2012-03-30T13:00:00
Duration: 11 min 2 s
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Gli autori ringraziano Copes Bill (Harris Seed Company Moran, Davis) per fornire frutti di melone per questa analisi. Questo progetto è supportato dal Altre coltivazioni Competitive Research Grants programma di iniziativa non concede. 2009-51181-05783 dalla Nazionale USDA Institute of Food and Agriculture.

1. Preparazione del campione <ol><li> Raccogliere i frutti in fase di maturità desiderata. Risciacquare con acqua di rubinetto, al fine di rimuovere lo sporco e la polvere. </li><li> Selezionare frutti per l&#39;analisi basate sulla mancanza di difetti esterni e interni, e sulla loro omogeneità dimensioni. </li><li> Tagliare frutti longitudinalmente a spicchi essere utilizzati per il campionamento volatile. Se necessario, togliere la pelle, i semi, cavità tessuto di seme, o buca. Tessuto selezione di frutta deve essere coerente in tutta l&#39;esperimento e tener conto della variabilità all&#39;interno di un frutto (ad esempio, ottenere campione pari dal equatoriale, fiore e le parti finali staminali). </li><li> Combina il tessuto selezionato frutta, mescolare in modo da randomizzare, e poi pesare 200 g in un frullatore. </li><li> Aggiungere 200 mL di soluzione di CaCl 2 satura (372,5 g a 20 ° C, in 500 mL di acqua deionizzata) e 50 pl di una soluzione 100 mM di 2-metilbutile isovalerato in metanolo. Il CaCl 2 è destinato ad agire come un inibitore enzimatico di acproduttività, che potrebbero verificarsi dopo il taglio e omogeneizzando la polpa del frutto. 2-metilbutile isovalerato viene aggiunto come standard interno per controllare le eventuali perdite di composti volatili durante il processo di omogeneizzazione. </li><li> Omogeneizzare composto in un frullatore laboratorio (Waring, USA), per 30 secondi a 18.000 giri al minuto, quindi versare immediatamente in bottiglia di vetro con coperchio e guarnizione in Teflon. Mantenere l&#39;omogeneizzato in bottiglia a temperatura ambiente fino a che tutti i campioni vengono preparati. </li><li> Dopo aver versato l&#39;omogeneizzato nella bottiglia, attendere 10 minuti per consentire la separazione della schiuma dal liquido, quindi pipette aliquote di 5 ml di liquido, senza schiuma, in 20 ml in vetro ambra fiale e sigillare le fiale con tappi a vite dotati di acciaio Teflon / silicone setti. Questa procedura è adatta per il melone e pera preparazione omogeneizzato. Se altri frutti vengono utilizzati per l&#39;analisi, una fase di centrifugazione può essere richiesto. Pertanto, rimuovere la schiuma e centrifugare il liquido di particelle che potrebbero pelletostruire la pipetta. Preparare almeno tre fiale per campione a servire come tecnico replica. </li><li> A questo punto, i campioni possono essere analizzati immediatamente o rapidamente congelati in azoto liquido e conservati a temperatura ultra-bassa (-80 ° C) per una successiva analisi. </li><li> Per i campioni congelati, il giorno analisi rimuovere i campioni dal congelatore e consentire loro di scongelare per un&#39;ora a temperatura ambiente. Dopo lo scongelamento, e prima analisi, sostituire il tappo del flaconcino con una nuova che ha un ambiente pulito, asciutto setto. Se il setto non è sostituito, acqua condensata sul setto durante scongelamento possono essere aspirati nello strumento e danneggiarlo. </li></ol> 2. Gas cromatografia-superficie Acoustic Wave (SAW-GC) Set-up e acquisizione dati <ol><li> Caricare il metodo appropriato analisi sulla zNose. Per l&#39;analisi del estere ricco profilo aromatico volatile di melone, i nostri parametri nella versione 5.44.22 MicroSense software (Newbury Park, CA, USA) sono i seguenti: aspirazione spazio di testa iningresso per 20 secondi a 30 mL min -1 tramite pompa; temperatura di entrata a 200 ° C; trappola Tenax temperatura a 225 ° C, tasso di flusso di gas vettore (elio purezza 99,999%) di 2,9 ml min-1; colonna (DB-5 colonna, 1 m × 0,25 millimetri ID × 0,25 spessore pellicola um) programma di temperatura da 45 ° C a 180 ° C ad una velocità di 10 ° C sec -1; sensore di temperatura a 40 ° C; valvola a 165 ° C. Il tempo di analisi totale è di 1 minuto per campione. </li><li> Collegare un ago in acciaio inossidabile con carotaggio non punta verso l&#39;ingresso del zNose e spurgare il sistema più volte con aria ambiente fino a quando la linea di base è stabile e non picchi superiori a 200 Conti (Ct) vengono rilevati. </li><li> Accordare lo strumento usando una soluzione di alcani a catena lineare (C6-C14). Il risultato brano viene utilizzato dal software dello strumento per convertire il tempo di ritenzione dei picchi eluiti dalla unità di tempo in Kovats Index (KI) unità. Di conseguenza, dopo che il sistema è sintonizzato, i tempi di ritenzione sono riportati in unità KI. </li&gt; <li> Prima dell&#39;analisi, consente al campione di equilibrare per 30 minuti. Per analizzare una delle fiale di esempio, inserire un ago nel setto flacone per alleviare la pressione. Quindi inserire l&#39;ago connesso all&#39;ingresso strumento nel setto del flacone e avviare campionamento spazio di testa. Analizzare almeno tre repliche tecniche per campione. </li><li> Avviare manualmente lo strumento cliccando sul pulsante &quot;Play&quot;, si attiva pompa e ritira i vapori presenti al di sopra del campione. Alla fine dell&#39;analisi, un cromatogramma appare sullo schermo, e il sensore viene automaticamente riscaldato a 150 ° C per 10 secondi per pulirlo. Quando lo stato del pulsante del sistema di casella diventa verde ancora una volta, lo strumento è pronto ad analizzare un altro campione. </li><li> Per garantire una linea di base stabile e adeguato sistema di pulizia, eseguire almeno uno spazio d&#39;aria tra ciascun campione. Per monitorare la possibile contaminazione volatile dalla fiala e tappo, analizzare due fiala di sbozzati (flaconcino vuoto con tappo), all&#39;inizio e alla fine della giornata. &lt;/ Li&gt; </ol> 3. Esporta dati e analisi <ol><li> Esportare i dati in un file di Microsoft Excel dopo l&#39;acquisto con il &quot;Peak logging&quot; in funzione di software MicroSense. Una volta che i dati vengono esportati, aggiungere colonne contenenti le etichette per le variabili e replicati. </li><li> Trasformare il formato dei dati per facilitare la manipolazione utilizzando il Python (versione 2.6, disponibile gratuitamente on-line) script che abbiamo sviluppato, chiamato &quot;reform_data.py&quot; (vedi Figura 1 per un esempio del formato dei dati prima e dopo usando lo script &quot;reform_data. py &quot;). Il nome del file sorgente (in formato xls) e il nome del foglio per i dati di input, così come il nome del file desiderato per l&#39;uscita (formato xls), sono modificate direttamente nello script. </li><li> Start &quot;kim_interface.py&quot; (anche scritto in Python 2.6, vedi figura 2), e importare i dati dal file generato nel passaggio precedente. In particolare, l&#39;analisi si basa sulla visualizzazione e analisi il numero di volte ogni valore KI è stato rilevato(&quot;Risultati KI&quot;). Così il programma visualizza un grafico a barre di visite per ogni valore KI KI. </li><li> Valutare i successi KI di specifici sottoinsiemi di campioni, analisi di ogni gruppo di tecnici replicati insieme. Per fare ciò, analizzare ogni trattamento o variabile separatamente selezionando / deselezionando le caselle corrispondenti. Vedi figura 2 didascalia per una descrizione dettagliata dell&#39;interfaccia utente grafica (GUI) caratteristiche. </li><li> Dopo aver identificato la larghezza di ciascuna finestra KI utilizzando la GUI, selezionare casualmente alcuni dei cromatogrammi corrispondenti software Microsense e valutare sovrapposizione picchi tra il tecnico replicati. Vedi Figura 3 per un esempio di cromatogrammi sovrapposti di due tecnici repliche. </li><li> Una volta che la finestra di KI è individuato, utilizzare il &#39;Merge&#39; funzione disponibile nella GUI per unire le Kis che cadono nella finestra, in KI più popolata. Utilizzando questa funzione, picchi marcati con un intervallo di valori KI sono consolidate sotto un unico marchio KI, allowing trattare cime come una singola variabile. Per farlo, clicca prima sul pulsante &#39;Merge&#39; per attivare la funzione e selezionare il KI più popolosa come il centro della finestra facendo clic nella barra corrispondente. Una volta che la barra è stata selezionata, cambia colore e diventa verde. Per unire i Kis che rientrano dalla finestra nel KI selezionato, tasto destro del mouse sulle barre corrispondenti; questo fa sì che le barre a diventare rosso, mentre una barra blu della lunghezza corrispondente viene aggiunto in cima alla KI centrale (vedi figura 4 ). Una volta che tutti i Kis selezionati sono stati uniti nel KI pertinente ufficio centrale, fare clic sul pulsante &#39;Merge&#39; di nuovo per accettare le modifiche, questo fa sì che il pulsante &#39;Merge&#39; a ingiallire. In caso di errori, il pulsante &#39;Unmerge&#39; è inoltre disponibile. Per unmerge, fare clic sul pulsante &#39;Unmerge&#39; nella GUI, quindi fare clic destro sulla barra rossa che si desidera unmerge. Dal rosso, la barra diventa blu. Fare clic sul pulsante &#39;Unmerge&#39; per accettare le modifiche. </li><li> Se si cerca di incorrectly unire due picchi in un singolo campione in un valore di KI singolo, un messaggio di errore viene stampato. In tali circostanze, strettamente controllare il cromatogramma e ridefinire la finestra KI in quella regione. </li><li> Una volta che tutte le operazioni di fusione sono state eseguite, salvare il file. </li><li> Prima di procedere con l&#39;analisi statistica, i cromatogrammi dell&#39;aria e sbozzati fiala vengono analizzati per controllare possibili contaminazioni. Una volta che la KI dei picchi negli sbozzati sono stati identificati, sottrarre l&#39;area del picco rilevata in aria e / o fiala-vuoto dalla zona della presente picco nel campione. Quindi procedere con l&#39;analisi statistica. </li></ol> 4. Risultati rappresentativi Il naso elettronico è in grado di rilevare differenze nei profili di volatili tra melone raccolte a stadi diversi di maturità (Figura 5). Venti KI finestre sono stati identificati in tutti i campioni. L&#39;analisi della varianza ha mostrato che 14 vette detected dal naso elettronico varia notevolmente tra gli stadi di maturità. In Figura 6, il registro delle aree di picco media di questi 14 componenti sono tracciate per mostrare le differenze nelle abbondanze di punta tra le due fasi di maturità, i primi frutti maturi e pienamente matura. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3821/3821fig1.jpg" /> Figura 1. Esempi di formato dei dati esportati da software dello strumento (A) e dopo la trasformazione, eseguita tramite script &quot;reform_data.py&quot; (B). Per facilitare la manipolazione e l&#39;analisi dei dati, tutti i KIS unici sono identificati in tutti i campioni, quindi i dati sono riordinate informazioni campione in righe e colonne di picco nella zona, corrispondenti a KIS unici. Se un picco non viene rilevato un valore di KI in un campione, la cella corrispondente rimane vuoto. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3821/3821fig2.jpg" /> Figura 2. Cattura schermo dal script file &quot;kim_interface.py&quot;. La trama al centro visualizza il numero di visite per rispetto KI KI. &#39;Hit per KI&#39; è il numero di campioni in cui è stato rilevato con un picco che KI specifico. Sul lato sinistro, vi sono tre scatole gialle che controllano i dati selezionati. Essi mostrano i parametri di dividere il set di dati (trattamenti, replica, le variabili qualitative, ecc.) In questa figura, sono (dall&#39;alto verso il basso): Variety, la data di impianto e la fase di maturità al momento del raccolto. Sul fondo: facendo clic sui 3 bar e spostando la barra blu verso sinistra o verso destra, si può selezionare il minimo e il valore massimo della gamma KI, e l&#39;area di picco minimo (&#39;Threshold&#39;). A destra: il tasto &#39;Merge&#39; permette la fusione Kis selezionati manualmente cliccando sulle barre nel grafico. Il pulsante &#39;Unmerge&#39; permette di invertire il processo per i casi selezionati. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3821/3821fig3.jpg" /> Figura 3. Cromatogrammi sovrapposto (in<html> nero e rosso) di due tecnici replica da spazio di testa melone volatile, per illustrare uno spostamento nel tempo di ritenzione. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3821/3821fig4.jpg" /> Figura 4. Esempio di KI fusione procedura. Nella trama centrale, la barra verde (Central KI) rappresenta il KI più popolata, che è stato scelto come centro della finestra del KI. KI KI X e Y sono KIS che rientrano nella finestra di interesse e hanno bisogno di essere uniti nel KI centrale. Cliccando col tasto destro sulla barra KI X, esso diventa rosso e, al tempo stesso, una barra blu della stessa lunghezza della barra KI X, appare in cima al verde. Ripetendo la stessa procedura per KI Y, la lunghezza della barra blu (KIS Fusione) aumenterà della lunghezza corrispondente. Una volta che tutti i Kis sono stati aggiunti, facendo clic sul pulsante verde &#39;Merge&#39;, le estremità del processo di fusione, le modifiche vengono salvate, e il colore del pulsante diventa giallo. / Files/ftp_upload/3821/3821fig5.jpg &quot;/&gt; Figura 5. Due cromatogrammi di campioni di melone raccolte a stadi diversi di maturità, presto maturo (in alto) e pienamente matura (in basso), per illustrare la capacità del naso elettronico per rilevare le differenze di abbondanze volatili. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/3821/3821fig6.jpg" /> Figura 6. Plot radar che mostra l&#39;area di picco di 14 componenti presenti in due campioni di melone in due diverse fasi di maturità, presto maturi e pienamente matura. Le aree dei picchi sono riportati in scala logaritmica per aiutare a visualizzare il confronto. I numeri alla fine di ogni raggio rappresentano gli indici corrispondenti Kovats.

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Non abbiamo nulla da rivelare.

I nasi elettronici rappresentano un metodo promettente per la rapida valutazione oggettiva dei profili aromatici dalla frutta o da volatile, ricchi di campioni. Tuttavia, si sposta in tempo di ritenzione rappresentano una sfida per l&#39;identificazione di picco e potrebbe portare a interpretazioni errate dei dati quando due cromatogrammi non sono perfettamente allineati. Ispezione visiva dei cromatogrammi indicato che la variabilità dei tempi di ritenzione tra i campioni spesso causato lo stesso picco da etichettare con valori leggermente diversi KI (circa ± 10). Ciò si è tradotto in un numero esagerato di KIS unici rilevati. Al fine di sfruttare il fatto che (a) composti sono presenti differenti stadi di scadenza diverse e (b) tecniche replicati sono approssimativamente uguali, due script basati su computer (&quot;kim_merge.py&quot;, che contiene le routine di elaborazione dati set, e &quot;kim_interface.py&quot;, che fornisce un&#39;interfaccia utente grafica (GUI)) sono stati sviluppati in modo sistematicocomparazione di campioni in una semi-automatica della moda, riducendo notevolmente il tempo necessario per l&#39;analisi cromatogramma di grandi insiemi di dati. Questi programmi consentono il consolidamento, se del caso, di picchi marcati con un intervallo di valori KI sotto un unico marchio KI. Questo serve a due scopi importanti: (a) permette una analisi statistica per il trattamento di tali picchi come una singola variabile, e (b) agevola l&#39;identificazione di picco e rispetto ad altri sistemi e valori pubblicati. I risultati qui presentati indicano che i campioni di melone può essere discriminato sulla base di maturità e profiling aroma utilizzando il sistema zNose in combinazione con l&#39;identificazione KI adeguata. Questo rappresenta una promettente nuova tecnologia per l&#39;analisi delle sostanze volatili che possono essere utilizzati per programmi di controllo qualità.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reattivo </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Comments </td></tr><tr><td> Cloruro di calcio </td><td> MP Biomedical </td><td> 195088 </td><td></td></tr><tr><td> 2-metilbutile isovalerato </td><td> Ripartire globale </td><td> W350613 </td><td> ≥ 98%, naturale, FCC </td></tr><tr><td> Metanolo </td><td> Fisher Scientific </td><td> A411-4 </td><td></td></tr><tr><td> Fiala </td><td> Sigma / Supelco </td><td> SU860098 </td><td></td></tr><tr><td> Cappuccio </td><td> Sigma / Supelco </td><td> SU860101 </td><td></td></tr><tr><td> Laboratorio frullatore </td><td> Waring Science Laboratory </td><td> 7009G </td><td> 2 velocità frullatore, 1 - contenitore di vetro da un litro </td></tr><tr><td> Bottiglia </td><td> Fisher Scientific </td><td> 06-414-1C </td><td> Pyrex, 500 mL; polipropilene plug-guarnizione </td></tr><tr><td> Ago </td><td> Sensore di Tecnologia Elettronica </td><td> TLC101046 </td><td> Foro laterale luer </td></tr><tr><td> Alcani soluzione </td><td> Sensore di Tecnologia Elettronica </td><td></td><td> C6-C14 alcani soluzione in metanolo </td></tr><tr><td> zNose </td><td> Sensore di Tecnologia Elettronica </td><td> Modello 4500 </td><td></td></tr><tr><td> DB-5 GC colonna </td><td> Sensore di Tecnologia Elettronica </td><td> SYS4500C5 </td><td></td></tr><tr><td> MicroSense </td><td> Sensore di Tecnologia Elettronica </td><td> Versione 5.44.22 </td><td></td></tr><tr><td> Python 2.6 </td><td></td><td></td><td> Liberamente disponibili on-line </td></tr><tr><td> &quot;Reform_data.py&quot; e &quot;scripts&quot; kim_interface.py</td><td></td><td></td><td> Script disponibili come materiale supplementare sul JOVE </td></tr></tbody></table>

fruit volatile analysis using an electronic nose

Numerosi cambiamenti fisiologici e diversificata si verificano durante la maturazione dei frutti, compreso lo sviluppo di una miscela specifica volatile che caratterizza aroma di frutta. Maturazione alla raccolta è uno dei fattori chiave che influenzano la qualità sapore di frutta e verdura 1. La convalida di metodi robusti che rapidamente valutare la maturità e la qualità di frutta aroma consentirebbe una migliore gestione dei programmi di miglioramento genetico avanzati, pratiche di produzione e la gestione post raccolta. Negli ultimi tre decenni, molte ricerche sono state condotte per sviluppare nasi elettronici cosiddetti, che sono dispositivi in grado di rilevare rapidamente gli odori e sapori 2-4. Attualmente ci sono diversi nasi elettronici disponibili in commercio in grado di effettuare analisi volatile, basati su tecnologie diverse. Il naso elettronico utilizzato nel nostro lavoro (zNose, EST, Newbury Park, CA, USA), è composto da ultra-veloce gas cromatografia accoppiata con un sensore di onde acustiche di superficie (UFGC-SAW). Questa tecnologia è già stato testato per la sua capacità di monitorare la qualità delle materie prime, tra cui il rilevamento di deterioramento della mela 5, maturazione e la valutazione marciume in mango 6; profiling aroma delle specie di timo 7; C 6 composti volatili in acini d&#39;uva 8; caratterizzazione di olio vegetale 9 e il rilevamento di sostanze adulteranti in olio vergine di cocco 10. Questo sistema può eseguire le tre fasi principali di analisi aroma: campionamento dello spazio di testa, separazione dei composti volatili, e la rilevazione. In circa un minuto, l&#39;uscita, un cromatogramma, è prodotto e, dopo un ciclo di spurgo, lo strumento è pronto per ulteriori analisi. I risultati ottenuti con il zNose possono essere paragonate a quelle di altri gas-cromatografiche sistemi di calcolo degli indici Kovats (KI). Una volta che lo strumento è stato messo a punto con una soluzione standard di alcano, i tempi di ritenzione vengono automaticamente convertiti inKis. Tuttavia, lievi variazioni di temperatura e la portata ci si aspetta che si verifichino nel corso del tempo, causando tempi di ritenzione ad andare alla deriva. Inoltre, a seconda della polarità della fase stazionaria colonna, la riproducibilità di calcoli KI può variare da unità indici diversi 11. Una serie di programmi e di interfacce grafiche sono quindi sviluppati per confrontare Kis calcolati tra i campioni in una semi-automatica della moda. Questi programmi ridurre il tempo necessario per l&#39;analisi cromatogramma di grandi insiemi di dati e minimizzare il rischio di errata interpretazione dei dati quando cromatogrammi non perfettamente allineati. Vi presentiamo un metodo per una rapida analisi di composti volatili in frutti. Esempi di procedure di preparazione, di acquisizione dati e la gestione vengono anche discussi.

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Fruit Volatile Analysis Using an Electronic Nose

Un metodo rapido per l&#39;analisi di composti volatili in frutta viene descritto. I composti volatili presenti nello spazio di testa di un omogenato del campione vengono rapidamente separati e determinati con ultraveloce gas cromatografia (GC) accoppiato con un&#39;onda acustica di superficie (SAW) sensore. Una procedura per la gestione dei dati e di analisi è anche discusso.

Fruit Analisi Volatile Utilizzando un naso elettronico

Numerous and diverse physiological changes occur during fruit ripening, including the development of a specific volatile blend that characterizes fruit ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Studying Aggression in Drosophila (fruit flies)

Aggression is an innate behavior that evolved in the framework of defending or obtaining resources. This complex social behavior is influenced by genetic, hormonal and environmental factors. In many organisms, aggression is critical to survival but controlling and suppressing aggression in distinct contexts also has become increasingly important. In recent years, invertebrates have become increasingly useful as model systems for investigating the genetic and systems biological basis of complex social behavior. This is in part due to the diverse repertoire of behaviors exhibited by these organisms. In the accompanying video, we outline a method for analyzing aggression in Drosophila whose design encompasses important eco-ethological constraints. Details include steps for: making a fighting chamber; isolating and painting flies; adding flies to the fight chamber; and video taping fights. This approach is currently being used to identify candidate genes important in aggression and in elaborating the neuronal circuitry that underlies the output of aggression and other social behaviors.

Studying Aggression in Drosophila fruit flies

Studiare Aggressione in Drosophila (moscerino della frutta)

Aggression is an innate behavior that evolved in the framework of defending or obtaining resources.  This complex social behavior is influenced by ...

Ricerca

Biologia

Homemade Site Directed Mutagenesis of Whole Plasmids

Site directed mutagenesis of whole plasmids is a simple way to create slightly different variations of an original plasmid. With this method the cloned target gene can be altered by substitution, deletion or insertion of a few bases directly into a plasmid. It works by simply amplifying the whole plasmid, in a non PCR-based thermocycling reaction. During the reaction mutagenic primers, carrying the desired mutation, are integrated into the newly synthesized plasmid. In this video tutorial we demonstrate an easy and cost effective way to introduce base substitutions into a plasmid. The protocol works with standard reagents and is independent from commercial kits, which often are very expensive. Applying this protocol can reduce the total cost of a reaction to an eighth of what it costs using some of the commercial kits. In this video we also comment on critical steps during the process and give detailed instructions on how to design the mutagenic primers.

Site directed mutagenesis of whole plasmids is a simple way to create slightly different variations of an original plasmid. Here we demonstrate an easy and cost effective way to introduce base substitutions into a plasmid using standard reagents.

Mutagenesi sito fatto in casa Regia di Plasmidi Whole

Site directed mutagenesis of whole plasmids is a simple way to create slightly different variations of an original plasmid. With this method the cloned ...

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing measurement of multiple cellular phenotypes within a single assay. In this study, we utilized HCA to develop a novel assay for neurotoxicity. Neurotoxicity assessment represents an important part of drug safety evaluation, as well as being a significant focus of environmental protection efforts. Additionally, neurotoxicity is also a well-accepted in vitro marker of the development of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's and Parkinson's diseases. Recently, the application of HCA to neuronal screening has been reported. By labeling neuronal cells with &beta;III-tubulin, HCA assays can provide high-throughput, non-subjective, quantitative measurements of parameters such as neuronal number, neurite count and neurite length, all of which can indicate neurotoxic effects. However, the role of astrocytes remains unexplored in these models. Astrocytes have an integral role in the maintenance of central nervous system (CNS) homeostasis, and are associated with both neuroprotection and neurodegradation when they are activated in response to toxic substances or disease states. GFAP is an intermediate filament protein expressed predominantly in the astrocytes of the CNS. Astrocytic activation (gliosis) leads to the upregulation of GFAP, commonly accompanied by astrocyte proliferation and hypertrophy. This process of reactive gliosis has been proposed as an early marker of damage to the nervous system. The traditional method for GFAP quantitation is by immunoassay. This approach is limited by an inability to provide information on cellular localization, morphology and cell number. We determined that HCA could be used to overcome these limitations and to simultaneously measure multiple features associated with gliosis - changes in GFAP expression, astrocyte hypertrophy, and astrocyte proliferation - within a single assay. In co-culture studies, astrocytes have been shown to protect neurons against several types of toxic insult and to critically influence neuronal survival. Recent studies have suggested that the use of astrocytes in an in vitro neurotoxicity test system may prove more relevant to human CNS structure and function than neuronal cells alone. Accordingly, we have developed an HCA assay for co-culture of neurons and astrocytes, comprised of protocols and validated, target-specific detection reagents for profiling &beta;III-tubulin and glial fibrillary acidic protein (GFAP). This assay enables simultaneous analysis of neurotoxicity, neurite outgrowth, gliosis, neuronal and astrocytic morphology and neuronal and astrocytic development in a wide variety of cellular models, representing a novel, non-subjective, high-throughput assay for neurotoxicity assessment. The assay holds great potential for enhanced detection of neurotoxicity and improved productivity in neuroscience research and drug discovery.

This article describes a novel protocol and reagent set designed for sensitive measurement of neurotoxic effects of compounds and treatments on co-cultures of neurons and astrocytes using high content analysis. Results demonstrate that high content analysis represents an exciting novel technology for neurotoxicity assessment.

Un neuronale e astrociti Co-Cultura Assay per l&#39;analisi dei contenuti elevati di neurotossicità

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

An Optimized Protocol for Rearing Fopius arisanus, a Parasitoid of Tephritid Fruit Flies

Fopius arisanus (Sonan) is an important parasitoid of Tephritid fruit flies for at least two reasons. First, it is the one of only three opiine parasitoids known to infect the host during the egg stage1. Second, it has a wide range of potential fruit fly hosts. Perhaps due to its life history, F. arisanus has been a successfully used for biological control of fruit flies in multiple tropical regions2-4. One impediment to the wide use of F. arisanus for fruit fly control is that it is difficult to establish a stable laboratory colony5-9. Despite this difficulty, in the 1990s USDA researchers developed a reliable method to maintain laboratory populations of F. arisanus10-12. There is significant interest in F. arisanus biology13,14, especially regarding its ability to colonize a wide variety of Tephritid hosts14-17; interest is especially driven by the alarming spread of Bactrocera fruit fly pests to new continents in the last decade18. Further research on F. arisanus and additional deployments of this species as a biological control agent will benefit from optimizations and improvements of rearing methods. In this protocol and associated video article we describe an optimized method for rearing F. arisanus based on a previously described approach12. The method we describe here allows rearing of F. arisanus in a small scale without the use of fruit, using materials available in tropical regions around the world and with relatively low manual labor requirements.

An Optimized Protocol for Rearing Fopius arisanus, a Parasitoid of Tephritid Fruit Flies

Fopius arisanus is an egg-larval parasitoid of Tephritid fruit flies that is successfully used in biological control of these important tropical pests. We describe here an optimized protocol for rearing F. arisanus on a small scale using readily available materials.

Un protocollo ottimizzato per la cura dei Fopius arisanus, Un parassitoide di frutta Tephritid mosche

Fopius arisanus (Sonan) is an important parasitoid of Tephritid fruit flies for at least two reasons. First, it is the one of only three opiine ...

Isolation and Biophysical Study of Fruit Cuticles

The cuticle, a hydrophobic protective layer on the aerial parts of terrestrial plants, functions as a versatile defensive barrier to various biotic and abiotic stresses and also regulates water flow from the external environment.1 A biopolyester (cutin) and long-chain fatty acids (waxes) form the principal structural framework of the cuticle; the functional integrity of the cuticular layer depends on the outer 'epicuticular' layer as well as the blend consisting of the cutin biopolymer and 'intracuticular' waxes.2 Herein, we describe a comprehensive protocol to extract waxes exhaustively from commercial tomato (Solanum lycopersicum) fruit cuticles or to remove epicuticular and intracuticular waxes sequentially and selectively from the cuticle composite. The method of Jetter and Sch&auml;ffer (2001) was adapted for the stepwise extraction of epicuticular and intracuticular waxes from the fruit cuticle.3,4 To monitor the process of sequential wax removal, solid-state cross-polarization magic-angle-spinning (CPMAS) 13C NMR spectroscopy was used in parallel with atomic force microscopy (AFM), providing molecular-level structural profiles of the bulk materials complemented by information on the microscale topography and roughness of the cuticular surfaces. To evaluate the cross-linking capabilities of dewaxed cuticles from cultivated wild-type and single-gene mutant tomato fruits, MAS 13C NMR was used to compare the relative proportions of oxygenated aliphatic (CHO and CH2O) chemical moieties.
Exhaustive dewaxing by stepwise Soxhlet extraction with a panel of solvents of varying polarity provides an effective means to isolate wax moieties based on the hydrophobic characteristics of their aliphatic and aromatic constituents, while preserving the chemical structure of the cutin biopolyester. The mechanical extraction of epicuticular waxes and selective removal of intracuticular waxes, when monitored by complementary physical methodologies, provides an unprecedented means to investigate the cuticle assembly: this approach reveals the supramolecular organization and structural integration of various types of waxes, the architecture of the cutin-wax matrix, and the chemical composition of each constituent. In addition, solid-state 13C NMR reveals differences in the relative numbers of CHO and CH2O chemical moieties for wild-type and mutant red ripe tomato fruits. The NMR techniques offer exceptional tools to fingerprint the molecular structure of cuticular materials that are insoluble, amorphous, and chemically heterogeneous. As a noninvasive surface-selective imaging technique, AFM furnishes an effective and direct means to probe the structural organization of the cuticular assembly on the nm-&mu;m length scale.

Aerial plant organs are protected by the cuticle, a supramolecular biopolyester-wax assembly. We present protocols to monitor selective removal of epi- and intracuticular waxes from tomato fruit cuticles on molecular and micro scales by solid-state NMR and atomic force microscopy, respectively, and to assess the cross-linking capacity of engineered cuticular biopolyesters.

Isolamento e studio della biofisica cuticole di frutta

The cuticle, a hydrophobic protective layer on the aerial parts of terrestrial plants, functions as a versatile defensive barrier to various biotic and ...

Analysis of SNARE-mediated Membrane Fusion Using an Enzymatic Cell Fusion Assay

The interactions of SNARE (soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor) proteins on vesicles (v-SNAREs) and on target membranes (t-SNAREs) catalyze intracellular vesicle fusion1-4. Reconstitution assays are essential for dissecting the mechanism and regulation of SNARE-mediated membrane fusion5. In a cell fusion assay6,7, SNARE proteins are expressed ectopically at the cell surface. These "flipped" SNARE proteins drive cell-cell fusion, demonstrating that SNAREs are sufficient to fuse cellular membranes. Because the cell fusion assay is based on microscopic analysis, it is less efficient when used to analyze multiple v- and t-SNARE interactions quantitatively.
Here we describe a new assay8 that quantifies SNARE-mediated cell fusion events by activated expression of &beta;-galactosidase. Two components of the Tet-Off gene expression system9 are used as a readout system: the tetracycline-controlled transactivator (tTA) and a reporter plasmid that encodes the LacZ gene under control of the tetracycline-response element (TRE-LacZ). We transfect tTA into COS-7 cells that express flipped v-SNARE proteins at the cell surface (v-cells) and transfect TRE-LacZ into COS-7 cells that express flipped t-SNARE proteins at the cell surface (t-cells). SNARE-dependent fusion of the v- and t-cells results in the binding of tTA to TRE, the transcriptional activation of LacZ and expression of &beta;-galactosidase. The activity of &beta;-galactosidase is quantified using a colorimetric method by absorbance at 420 nm.
The vesicle-associated membrane proteins (VAMPs) are v-SNAREs that reside in various post-Golgi vesicular compartments10-15. By expressing VAMPs 1, 3, 4, 5, 7 and 8 at the same level, we compare their membrane fusion activities using the enzymatic cell fusion assay. Based on spectrometric measurement, this assay offers a quantitative approach for analyzing SNARE-mediated membrane fusion and for high-throughput studies.

We have developed a cell fusion assay that quantifies SNARE-mediated membrane fusion events by activated expression of &beta;-galactosidase.

Analisi delle SNARE-mediata fusione della membrana L&#39;utilizzo di un test enzimatico fusione cellulare

The interactions of SNARE (soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor)  proteins on vesicles (v-SNAREs) and on target membranes ...

Laboratory Protocol for Genetic Gut Content Analyses of Aquatic Macroinvertebrates Using Group-specific rDNA Primers

Analyzing food webs is essential for a better understanding of ecosystems. For example, food web interactions can undergo severe changes caused by the invasion of non-indigenous species. However, an exact identification of field predator-prey interactions is difficult in many cases. These analyses are often based on a visual evaluation of gut content or the analysis of stable isotope ratios (&#948;15N and &#948;13C). Such methods require comprehensive knowledge about, respectively, morphologic diversity or isotopic signature from individual prey organisms, leading to obstacles in the exact identification of prey organisms. Visual gut content analyses especially underestimate soft bodied prey organisms, because maceration, ingestion and digestion of prey organisms make identification of specific species difficult. Hence, polymerase chain reaction (PCR) based strategies, for example the use of group-specific primer sets, provide a powerful tool for the investigation of food web interactions. Here, we describe detailed protocols to investigate the gut contents of macroinvertebrate consumers from the field using group-specific primer sets for nuclear ribosomal deoxyribonucleic acid (rDNA). DNA can be extracted either from whole specimens (in the case of small taxa) or out of gut contents of specimens collected in the field. Presence and functional efficiency of the DNA templates need to be confirmed directly from the tested individual using universal primer sets targeting the respective subunit of DNA. We also demonstrate that consumed prey can be determined further down to species level via PCR with unmodified group-specific primers combined with subsequent single strand conformation polymorphism (SSCP) analyses using polyacrylamide gels. Furthermore, we show that the use of different fluorescent dyes as labels enables parallel screening for DNA fragments of different prey groups from multiple gut content samples via automated fragment analysis.

Most common gut content analyses of macroinvertebrates are visual. Requiring intense knowledge about morphological diversity of prey organisms, they miss soft bodied prey and, due to strong comminution of prey, are nearly impossible for some organisms, including amphipods. We provide detailed, novel genetic approaches for macroinvertebrate prey identification in the diet of amphipods.

Protocollo di laboratorio per analisi genetiche del contenuto dell'intestino del rDNA acquatica macroinvertebrati Using Group-specific Primers

Analyzing food webs is essential for a better understanding of ecosystems. For example, food web interactions can undergo severe changes caused by the ...

Simple Homemade Tools to Handle Fruit Flies&#8212;Drosophila melanogaster

The fruit fly, Drosophila melanogaster, is widely used both in biological research and biology education. Handling adult flies is common but difficult in practice, as adult flies fly. Demonstrated here is how to make some simple and cost-effective tools to address difficult issues in the handling of Drosophila. Holes in foam stoppers are made and pipette tips or funnels are inserted into the holes. Flies then move only in one direction into the pipette tip/funnel assemblage, allowing efficient control of the transfer of adult Drosophila into or out of a vial. Existing protocols have been modified for cool-anesthetizing flies by chilling in crushed ice and transferring them onto a cold, hard icepack surface. The icepack is covered with a piece of medical gauze that keeps immobilized flies from the condensed water when examined under a stereomicroscope. The flies are finally euthanized for counting and sorting or discarded by microwaving. A bottle-shaped cage has also been developed for collecting eggs, as well as a labor-saving device and accompanying protocol for cleaning glass culture vials.

Simple Homemade Tools to Handle Fruit Flies&amp;#8212;&lt;em&gt;Drosophila melanogaster&lt;/em&gt;

Described here is the use of several homemade tools to transfer, chill, and kill adult Drosophila, as well as to clean glass culture vials and collect eggs. These tools are easy to make and are rather efficient in handling Drosophila.

Semplici strumenti fatti in casa per gestire le mosche della frutta -Drosophila melanogaster

The fruit fly, Drosophila melanogaster, is widely used both in biological research and biology education. Handling adult flies is common but difficult in ...

Topical Application Bioassay to Quantify Insecticide Toxicity for Mosquitoes and Fruit Flies

The continued use of insecticides for public health and agriculture has led to widespread insecticide resistance and hampering of control methods. Insecticide resistance surveillance of mosquito populations is typically done through Centers for Disease Control and Prevention (CDC) bottle bioassays or World Health Organization (WHO) tube tests. However, these methods can result in a high degree of variability in mortality data due to variable insecticide contact with&#160;the insect, the relatively small numbers of organisms tested, extensive variation in mass between populations, and constantly changing environmental conditions, leading to variable outcomes. This paper presents the topical application bioassay, adapted as a high-throughput phenotypic bioassay for both mosquitoes and fruit flies, to test large numbers of insects along&#160;a range of insecticide concentrations.
This assay 1) ensures consistent treatment and insecticide contact with every organism, 2) produces highly specific dose-response curves that account for differences in average mass between strains and sexes (which is particularly important for field-collected organisms), and 3) allows for the calculation of statistically rigorous median lethal doses (LD50), which are necessary for resistance ratio comparisons-an alternative surveillance approach from diagnostic dose mortality, which is also used for larvicide resistance surveillance. This assay will be a complementary tool for accurately phenotyping mosquito populations and, as illustrated using fruit flies, is easily adaptable for use with other insects. We argue that this assay will help fill the gap between genotypic and phenotypic insecticide resistance in multiple insect species.

We describe the methodology and importance of the topical application bioassay to measure insecticide susceptibility in mosquitoes and fruit flies. The presented assay is high-throughput, utilizes insect mass-thus allowing for calculating a mass-relativized lethal dose instead of concentration-and likely has lower variability than other similar methods.

Biotest di applicazione topica per quantificare la tossicità degli insetticidi per zanzare e moscerini della frutta

The continued use of insecticides for public health and agriculture has led to widespread insecticide resistance and hampering of control methods. ...

Protocols for CRISPR/Cas9 Mutagenesis of the Oriental Fruit Fly Bactrocera dorsalis

The Oriental fruit fly, Bactrocera dorsalis, is a highly invasive and adaptive pest species that causes damage to citrus and over 150 other fruit crops worldwide. Since adult fruit flies have great flight capacity and females lay their eggs under the skins of fruit, insecticides requiring direct contact with the pest usually perform poorly in the field. With the development of molecular biological tools and high-throughput sequencing technology, many scientists are attempting to develop environmentally friendly pest management strategies. These include RNAi or gene editing-based pesticides that downregulate or silence genes (molecular targets), such as olfactory genes involved in searching behavior, in various insect pests. To adapt these strategies for Oriental fruit fly control, effective methods for functional gene research are needed. Genes with critical functions in the survival and reproduction of B. dorsalis serve as good molecular targets for gene knockdown and/or silencing. The CRISPR/Cas9 system is a reliable technique used for gene editing, especially in insects. This paper presents a systematic method for CRISPR/Cas9 mutagenesis of B. dorsalis, including the design and synthesis of guide RNAs, collecting embryos, embryo injection, insect rearing, and mutant screening. These protocols will serve as a useful guide for generating mutant flies for researchers interested in functional gene studies in B. dorsalis.

Protocols for CRISPR/Cas9 Mutagenesis of the Oriental Fruit Fly Bactrocera dorsalis

This paper presents the step-by-step protocols for CRISPR/Cas9 mutagenesis of the Oriental fruit fly Bactrocera dorsalis. Detailed steps provided by this standardized protocol will serve as a useful guide for generating mutant flies for functional gene studies in B. dorsalis.

Protocolli per la mutagenesi CRISPR/Cas9 del moscerino orientale della frutta Bactrocera dorsalis

The Oriental fruit fly, Bactrocera dorsalis, is a highly invasive and adaptive pest species that causes damage to citrus and over 150 other fruit crops ...