Name: fruit volatile analysis using an electronic nose
Uploaded: 2012-03-30T13:00:00
Duration: 11 min 2 s
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著者らは、この分析のためのメロンの果実を提供するためのビル対処を（ハリスモランシード社デイビス）に感謝。このプロジェクトは特殊作物研究イニシアティブ競争的資金プログラムがないの助成金によってサポートされています。食と農の米農務省国立研究所から2009-51181-05783。

1。試料調製<ol><li>希望の成熟段階での収穫の果物。汚れやほこりを除去するために水道水で洗い流してください。 </li><li>外部と内部の欠陥の有無、大きさの均一性に基づく分析のために果物を選択します。 </li><li>揮発性のサンプリングに使用するくさびに長手方向に果物をカットします。該当する場合は、皮膚、種子、種子キャビティ組織、またはピットを削除します。果実組織の選択は、実験全体を通して一貫性のある（すなわち、赤道、花と茎の端部から均等にサンプルを取得する）を考慮し、単一の果実内でのばらつきを取る必要があります。 </li><li>選択した果実の組織を組み合わせ、それをランダム化するためにそれをミックスし、ブレンダーに200グラムを重量を量る。 </li><li>飽和CaCl 2溶液（20℃372.5グラム°C、脱イオン水500 mL中）および2 -メチルブチ ​​ルの100 mM溶液をメタノールにイソ吉草酸の50μLの200mLを追加します。 CaCl 2を酵素的交流の阻害剤として作用することを目的としてい果肉をカットし、均質化後に発生する可能性のある感度、。 2 - メチルブチルイソ吉草酸は、均質化の過程で揮発性化合物の任意の損失の可能性を監視するための内部標準として追加されます。 </li><li>研究室ブレンダー（Waring氏、アメリカ）の混合物を均質化、18,000 rpmで30秒間、その後すぐにテフロンの蓋のガラスのボトルやシールに注ぐ。すべてのサンプルが用意されるまで、室温で瓶の中にホモジネートを保持します。 </li><li>ボトルにホモジネートを注入後、20mLのガラスアンバーバイアルに、発泡することなく、液体からの泡の分離、液体のその後ピペット5mLのアリコートを可能にするために10分待ってから、テフロン装備スチールスクリューキャップでバイアルを密封する/シリコンセプタム。この手順では、メロンと洋梨のホモジネートを調製するために適しています。他の果物を分析に使用されている場合は、遠心分離工程が必要になる場合があります。したがって、フォームを削除してからかもしれないペレット粒子に液体を遠心ピペットを妨げる。技術が複製として機能するようにサンプルごとに少なくとも3つのバイアルを準備します。 </li><li>この時点で、試料を直ちに分析されるか、または液体窒素で急速冷凍し、後で解析するために超低温（-80℃）で保存されます。 </li><li>凍結サンプルについては、分析の日に冷凍庫からサンプルを削除して、室温で1時間解凍することができます。解凍後、分析する前に、清潔で乾燥した隔壁を持って新しいものとバイアルのキャップを交換してください。セプタムを交換していない場合は、解凍時にセプタムで結露した水は、測定器に吸い込まれて、それを損傷することができます。 </li></ol> 2。ガスクロマトグラフィー - 表面弾性波（GC-SAW）のセットアップとデータ収集<ol><li> zNoseに適切な分析法をロードします。 メロンのエステル豊富な揮発性プロファイルの分析については、MicroSenseバージョン5.44.22ソフトウェア（Newbury Park、カリフォルニア州、米国）我々のパラメータは次のとおりです。にヘッド吸引ポンプを介して30 mLの分-1で20秒の入口、200入口温度℃、225℃テナックストラップの温度℃、2.9 mLのmin-1のキャリアガス（ヘリウム純度99.999％）流量、カラム（DB-5 45列、1メートル×0.25ミリメートルID×0.25μmの膜厚）温度プログラム°C〜180°C 10の割合で°C秒-1; 40℃センサー温度℃、165℃のバルブ総分析時間は、サンプルあたり1分です。 </li><li> zNoseインレットに非掘削先端にステンレス製の針を接続し、ベースラインが安定しており、200カウント（CT）よりも大きくないピークが検出されなくなるまで周囲の空気を使用してシステムを数回パージします。 </li><li>直鎖アルカン（C6-C14）の溶液を用いて楽器をチューニングします。チューンの結果はコヴァッツ指数（KI）単位に時間の単位から溶出したピークの保持時間を変換する機器のソフトウェアで使用されます。システムをチューニングした後、その結果、保持時間は、KI単位で報告されています。 </li&gt; <li>分析する前に、サンプルを30分間平衡化することができます。サンプルバイアルのいずれかを分析するには、圧力を和らげるためにバイアルセプタムに針を挿入します。その後バイアルセプタムに楽器の入口に接続されている針を挿入し、ヘッドスペースサンプリングを開始します。少なくとも3つの技術を分析すると、サンプルごとに複製します。 </li><li>手動で &quot;Play&quot;ボタンをクリックしてインストゥルメントを起動します。ポンプの活性化と脱退は、蒸気は、サンプルの上に提示します。分析の終了時に、クロマトグラムは、画面上に表示され、センサーが自動的にそれをきれいにするために10秒間150℃に加熱されています。システムステータスボックスのボタンが再び緑色に点灯したときに、測定器は別のサンプルを分析する準備ができています。 </li><li>安定したベースラインとシステムの適切な洗浄を確実にするために、各サンプルの間に少なくとも一つの空気を空白にして実行します。バイアルとキャップから可能な揮発性の汚染を監視するため、一日の始めと終わりに、2バイアル·ブランク（キャップ​​付き空のバイアル）を分析します。&lt;は/ LI&gt; </ol> 3。データのエクスポートと分析<ol><li> MicroSenseソフトウェアの &quot;ピークのロギング&quot;機能を使用して取得した後、Microsoft Excelファイルにデータをエクスポートします。データがエクスポートされると、変数、および複製するためのラベルを含む列を追加します。 </li><li> &quot;reform_data.py&quot;（前とスクリプト&quot;reform_dataを使用した後にデータ形式の例については図1を参照してくださいという我々が開発したスクリプト、Pythonを（オンラインで自由に利用できるバージョン2.6）を使用して簡単に操作するためのデータ形式を変換します。 PY &quot;）。入力データと同様に、出力（xls形式）の所望のファイル名のソースファイル（xls形式）と、シート名の名前は、スクリプト内で直接編集されています。 </li><li> &quot;kim_interface.pyを&quot;（また、Python 2.6で書かれた、 図2を参照 ）を起動し、前のステップで生成されたファイルからデータをインポートします。具体的には、分析は各KIの値が検出された回数を表示および分析に基づいています（ &quot;KI·ヒット&quot;）。したがって、プログラムは、各KI値のKIヒットのバーグラフが表示されます。 </li><li>技術の各グループが一緒に複製され、分析試料の特定のサブセットのKIのヒットを評価します。これを行うには、対応するボックスをチェック/チェックを外すことで別々にすべての治療または変数を分析します。グラフィカルユーザインタフェース（GUI）の機能の詳細については、 図2のキャプションを参照してください。 </li><li> GUIを使用して、各KIウィンドウの幅を識別した後、無作為にMicrosenseソフトウェアで対応するクロマトグラムの一部を選択して、技術的複製するの間で重複ピークを評価します。複製する二つの技術のオーバーレイクロマトグラムの例については、 図3を参照してください。 </li><li> KIウィンドウがindividuatedされると、最も人口のKIに、ウィンドウに落ちるKISをマージするためのGUIで利用できる &quot;マージ&quot;機能を使用します。この機能を使用して、KIの値の範囲で標識されたピークは、単一のKIのラベル、allowiの下に統合されていますngは、単一の変数のようなピークを治療する。 これを行うには、まず機能を有効にする &quot;マージ&quot;ボタンをクリックして、対応するバーを左クリックすると、ウィンドウの中心地として最も人口の多いKI]を選択します。バーが選択されていたら、色を変更すると緑色に変わります。選択したKIにウィンドウ内に収まるKISをマージするには、対応するバーを右クリックして、これは対応する長さの青いバーが中央KI（ 図4を参照の上に追加されている間のバーが赤くさせる。）一度選択したすべてのKISは、適切な中央のKIにマージされました、変更を受け入れるには、再度 &quot;マージ&quot;ボタンをクリックして、これは &quot;マージ&quot;ボタンが黄色になります。ミスの場合には、 &quot;マージ解除&quot;ボタンも用意されています。 unmergeするには、unmergeする必要赤いバー上で右クリックし、GUIで &quot;マージ解除&quot;ボタンをクリックします。赤から、バーが青に変わります。変更を受け入れるには、再度 &quot;マージ解除&quot;ボタンをクリックします。 </li><li>もし私が1つの試みncorrectly単一のKI値に単一のサンプルで2つのピークをマージすると、エラーメッセージが表示されます。このような状況では、密接にクロマトグラムを確認し、その地域のKIウィンドウを再定義します。 </li><li>一度マージするすべての操作が実行されている、ファイルを保存します。 </li><li>統計分析に進む前に、空気とバイアルブランクのクロマトグラムは、可能な汚染を監視するために分析されています。ブランクのピークのKIが識別されると、試料中に存在するピークの面積から空気および/またはバイアルの空白で検​​出されたピークの面積を減算します。 その後、統計分析に進みます。 </li></ol> 4。代表的な結果電子鼻は、さまざまな成熟段階（ 図5）で収穫メロン果実の中で揮発性プロファイルの違いを検出することができた。二十KIウィンドウはすべてのサンプル全体で同定された。分散分析は、14のピークがdeteことが明らかになった成熟段階の間に有意な変化電子鼻でCTED。 図6では、これらの14成分の平均ピーク面積のログが2成熟段階、早期に成熟しており、完全に熟した果実の間にピークアバンダンスの違いを表示するためにプロットされます。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/3821/3821fig1.jpg" /> 図1：測定器ソフトウェアからエクスポートされたデータフォーマットの例（）と変換した後、 &quot;reform_data.py&quot;スクリプト（B）を使用して実行。データ操作と分析を容易にするために、すべての一意のKISは、すべてのサンプル全体で識別され、データは行とユニークなKISに対応する列内のピーク面積のサンプル情報を使用して並べ替えられます。ピークは、試料中のKI値のために検出されない場合は、対応するセルは空のままです。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/3821/3821fig2.jpg" /> 袋から図2のスクリーンキャプチャーTファイル &quot;kim_interface.py&quot;。中央のプロットは、KI KI対あたりのヒット数を表示します。 &quot;KI当たりヒット &#39;は、その特定のKIのピークが検出されたサンプル数です。左側に、選択したデータを制御する3つの黄色のボックスがあります。彼らは、データ·セット（トリートメント、複製され、質的変数など）を分割するためのパラメータを表示します。この図では、彼らは（上から下まで）は次のとおりです。収穫時のバラエティ、植栽日付と成熟段階。下に：3つのバーをクリックして左または右に青色のバーを移動することによって、1は、最小とKI範囲の最大値、最小ピーク面積（ &#39;しきい値&#39;）を選択することができます。右側： &quot;マージ&quot;ボタンは、手動でプロットのバーをクリックして選択したKISをマージすることができます。 &quot;マージ解除&quot;ボタンは1つが選択された場合のプロセスを逆にすることができます。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/3821/3821fig3.jpg" /> 図3。オーバーレイクロマトグラム（内<html>二つの技術の黒と赤）は、保持時間のシフトを説明するために、メロン揮発性のヘッドスペースから複製されます。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/3821/3821fig4.jpg" /> 図4の手順を実行し、マージKIの例。中央のプロットでは、緑のバー（中央KI）はKIウィンドウの中心地として選択されている最も人口のKIを表しています。 KI KI XとYは、KISは、目的のウィンドウに下落していると、彼らは中央のKIにマージする必要があります。 KI Xのバーを右クリックして、それが赤に変わり、同時に、KI Xのバーの長さが同じ、青色のバーが緑色のものの上に表示されます。 KI Y、青色のバーの長さ（合併KIS）のために同じ手順を繰り返すことにより、対応する長さが増加します。一度すべてのKISは、マージプロセスが終了すると、緑色の &quot;マージ&quot;ボタンをクリックして、追加、変更が保存され、ボタンの色は黄色にされています。 / files/ftp_upload/3821/3821fig5.jpg &quot;/&gt; 図5異なる成熟段階で収穫メロンサンプルの二つのクロマトグラムは、早期に成熟した（上）と完全に熟した（下）、揮発性の存在量の違いを検出する電子鼻の能力を説明する。 <img alt="図6" src="/files/ftp_upload/3821/3821fig6.jpg" /> 図6初期の成熟した、完全に熟した二つの異なる成熟段階、二つのメロンの試料中に存在する14の成分のピーク面積を示すレーダープロット。ピーク面積は、比較を視覚化するために対数スケールで報告されている。各光線の末尾の数値は、対応するコヴァッツ指数を表しています。

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我々は、開示することは何もありません。

電子鼻は、果物や揮発性の豊富なサンプルからの香気プロファイルの迅速な、客観的な評価のための有望な方法を表しています。しかし、保持時間のシフトは、ピーク同定のための挑戦を表しており、2グラムが完全に揃っていないときに、データの誤った解釈につながる可能性があります。クロマトグラムの目視検査は、サンプル間の保持時間の変動が頻繁にわずかに異なるKI値（約±10）で標識され、同じピークを引き起こしたことが示された。これは、検出されたユニークなKISの誇張された数に変換されます。 （a）の異なる化合物が異なる成熟段階で存在し、（b）技術が複製、データを処理するためのルーチンが含まれていつのコンピュータベースのスクリプト（ &quot;kim_merge.py&quot;、ほぼ同じであることを事実を活用するためにセット、およびグラフィカルユーザインタフェース（GUI）を提供する &quot;kim_interface.py&quot;は）、体系的に開発されました非常に大規模なデータセットのクロマトグラム分析のために必要な時間を短縮、半自動化された方法でサンプルを比較します。必要に応じてこれらのプログラムは、単一のKIのラベルの下にKIの値の範囲で標識されたピークの、統合を可能にします。これは二つの重要な役割を果たします。（a）は、単一の変数のようなピークを治療するために統計分析を可能にし、（b）はそれがピーク同定や他のシステムと公表値との比較を容易にします。ここで示された結果は、メロンのサンプルが十分なKIの識別との組み合わせでzNoseシステムを使用して、成熟度と香りのプロファイルに基づいて判別することができることを示しています。これは品質管理プログラムのために使用することができる揮発性物質の分析のための有望な新技術を表しています。

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント </td></tr><tr><td>塩化カルシウム</td><td> MPバイオメディカル</td><td> 195088 </td><td></td></tr><tr><td> 2 - メチルブチルイソ吉草酸</td><td> SAFCグローバル</td><td> W350613 </td><td> ≥98％、自然、FCC </td></tr><tr><td>メタノール</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> A411-4 </td><td></td></tr><tr><td>バイアル</td><td>シグマ/スペルコ</td><td> SU860098 </td><td></td></tr><tr><td>キャップ</td><td>シグマ/スペルコ</td><td> SU860101 </td><td></td></tr><tr><td>実験室ブレンダー</td><td>ワーリング研究所科学</td><td> 7009G </td><td> 2速ブレンダー、1 - リットルのガラス容器</td></tr><tr><td>ボトル</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> 06から414-1C </td><td>パイレックス、500mLの、ポリプロピレンプラグシール</td></tr><tr><td>針</td><td>電子センサー技術</td><td> TLC101046 </td><td>側穴ルアー</td></tr><tr><td>アルカン溶液を</td><td>電子センサー技術</td><td></td><td>メタノールのC6-C14アルカンソリューション</td></tr><tr><td> zNose </td><td>電子センサー技術</td><td>モデル4500 </td><td></td></tr><tr><td> DB-5 GCカラム</td><td>電子センサー技術</td><td> SYS4500C5 </td><td></td></tr><tr><td> MicroSense </td><td>電子センサー技術</td><td>バージョン5.44.22 </td><td></td></tr><tr><td> Python 2.6から</td><td></td><td></td><td>ライン上で自由に利用できる</td></tr><tr><td> &quot;reform_data.py&quot;と &quot;kim_interface.py&quot;スクリプト</td><td></td><td></td><td> Joveの上での補助教材として使用可能なスクリプト</td></tr></tbody></table>

fruit volatile analysis using an electronic nose

多数の多様な生理的変化は、果実の香りを特徴づける特定の揮発性のブレンドの開発を含む、果実の成熟中に発生します。収穫時の成熟度は、果物や野菜1の味の質に影響を与える重要な要因の一つです。急速に果実の成熟と香りの質を評価する強力な方法の検証が改善された高度な繁殖プログラムの管理、生産慣行と収穫後の処理ができるようになります。 最後の三十年にわたって、多くの研究が急速に臭気と風味2-4を検出することができるデバイスである、いわゆる電子鼻を開発するために実施されています。現在さまざまな技術に基づいて、揮発性の分析を行うことができるいくつかの市販の電子鼻があります。我々の仕事で使用される電子鼻（zNose、EST、Newbury Park、カリフォルニア州、米国）は、弾性表面波センサ（UFGC-相まって超高速ガスクロマトグラフィーで構成されていますSAW）。マンゴー6の成熟と腐敗の評価;この技術はすでにリンゴ5の劣化の検出を含む様々な商品の品質を監視するその能力について試験された胸腺種の香りプロファイリング7、ブドウ果実の8のC 6揮発性化合物;特性の植物油9とバージンココナッツオイル10 adulterantsの検出。 ヘッドスペースサンプリング、揮発性化合物の分離、検出：このシステムは、香りの分析の3つの主要手順を実行することができます。約1分で、出力は、クロマトグラムが生成され、そして、パージサイクルの後、機器はさらなる分析のために準備ができています。 zNoseで得られた結果は、コヴァッツ指数（KI）の計算により、他のガスクロマトグラフィーシステムのものと比較することができます。楽器はアルカン標準溶液で調整した後、保持時間は、自動的に変換されます。KIS。しかし、温度や流量のわずかな変化は保持時間がドリフトを引き起こし、時間の経過とともに発生すると予想される。また、カラム固定相の極性に応じて、KIの計算の再現性は、いくつかのインデックスユニット11によって異なる場合があります。プログラムとグラフィカルインターフェイスのシリーズは、従って、半自動化された方法でサンプル間の計算されたKISを比較するために開発されました。これらのプログラムは、大規模なデータセットのクロマトグラムの分析に要する時間を短縮し、クロマトグラムが完全に揃っていないデータの解釈の可能性を最小限に抑えることができます。 我々は、果実の急速な揮発性化合物分析のための手法を提案する。サンプルの準備、データ収集と処理手順についても説明します。

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Fruit Volatile Analysis Using an Electronic Nose

果実の揮発性化合物分析のための迅速な方法が記載されている。サンプルのホモジネートのヘッドスペース内に存在する揮発性化合物は急速に分離し、弾性表面波（SAW）センサと相まって超高速ガスクロマトグラフィ（GC）で検出されています。データ処理と分析のための手順についても説明されています。

電子鼻を使用した果実の揮発性の分析

Numerous and diverse physiological changes occur during fruit ripening, including the development of a specific volatile blend that characterizes fruit ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Studying Aggression in Drosophila (fruit flies)

Aggression is an innate behavior that evolved in the framework of defending or obtaining resources. This complex social behavior is influenced by genetic, hormonal and environmental factors. In many organisms, aggression is critical to survival but controlling and suppressing aggression in distinct contexts also has become increasingly important. In recent years, invertebrates have become increasingly useful as model systems for investigating the genetic and systems biological basis of complex social behavior. This is in part due to the diverse repertoire of behaviors exhibited by these organisms. In the accompanying video, we outline a method for analyzing aggression in Drosophila whose design encompasses important eco-ethological constraints. Details include steps for: making a fighting chamber; isolating and painting flies; adding flies to the fight chamber; and video taping fights. This approach is currently being used to identify candidate genes important in aggression and in elaborating the neuronal circuitry that underlies the output of aggression and other social behaviors.

Studying Aggression in Drosophila fruit flies

ショウジョウバエの勉強攻撃（ミバエ類）

Aggression is an innate behavior that evolved in the framework of defending or obtaining resources.  This complex social behavior is influenced by ...

生物学

Homemade Site Directed Mutagenesis of Whole Plasmids

Site directed mutagenesis of whole plasmids is a simple way to create slightly different variations of an original plasmid. With this method the cloned target gene can be altered by substitution, deletion or insertion of a few bases directly into a plasmid. It works by simply amplifying the whole plasmid, in a non PCR-based thermocycling reaction. During the reaction mutagenic primers, carrying the desired mutation, are integrated into the newly synthesized plasmid. In this video tutorial we demonstrate an easy and cost effective way to introduce base substitutions into a plasmid. The protocol works with standard reagents and is independent from commercial kits, which often are very expensive. Applying this protocol can reduce the total cost of a reaction to an eighth of what it costs using some of the commercial kits. In this video we also comment on critical steps during the process and give detailed instructions on how to design the mutagenic primers.

Site directed mutagenesis of whole plasmids is a simple way to create slightly different variations of an original plasmid. Here we demonstrate an easy and cost effective way to introduce base substitutions into a plasmid using standard reagents.

全プラスミドの自家製のサイトが特異的突然変異誘発

Site directed mutagenesis of whole plasmids is a simple way to create slightly different variations of an original plasmid. With this method the cloned ...

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing measurement of multiple cellular phenotypes within a single assay. In this study, we utilized HCA to develop a novel assay for neurotoxicity. Neurotoxicity assessment represents an important part of drug safety evaluation, as well as being a significant focus of environmental protection efforts. Additionally, neurotoxicity is also a well-accepted in vitro marker of the development of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's and Parkinson's diseases. Recently, the application of HCA to neuronal screening has been reported. By labeling neuronal cells with &beta;III-tubulin, HCA assays can provide high-throughput, non-subjective, quantitative measurements of parameters such as neuronal number, neurite count and neurite length, all of which can indicate neurotoxic effects. However, the role of astrocytes remains unexplored in these models. Astrocytes have an integral role in the maintenance of central nervous system (CNS) homeostasis, and are associated with both neuroprotection and neurodegradation when they are activated in response to toxic substances or disease states. GFAP is an intermediate filament protein expressed predominantly in the astrocytes of the CNS. Astrocytic activation (gliosis) leads to the upregulation of GFAP, commonly accompanied by astrocyte proliferation and hypertrophy. This process of reactive gliosis has been proposed as an early marker of damage to the nervous system. The traditional method for GFAP quantitation is by immunoassay. This approach is limited by an inability to provide information on cellular localization, morphology and cell number. We determined that HCA could be used to overcome these limitations and to simultaneously measure multiple features associated with gliosis - changes in GFAP expression, astrocyte hypertrophy, and astrocyte proliferation - within a single assay. In co-culture studies, astrocytes have been shown to protect neurons against several types of toxic insult and to critically influence neuronal survival. Recent studies have suggested that the use of astrocytes in an in vitro neurotoxicity test system may prove more relevant to human CNS structure and function than neuronal cells alone. Accordingly, we have developed an HCA assay for co-culture of neurons and astrocytes, comprised of protocols and validated, target-specific detection reagents for profiling &beta;III-tubulin and glial fibrillary acidic protein (GFAP). This assay enables simultaneous analysis of neurotoxicity, neurite outgrowth, gliosis, neuronal and astrocytic morphology and neuronal and astrocytic development in a wide variety of cellular models, representing a novel, non-subjective, high-throughput assay for neurotoxicity assessment. The assay holds great potential for enhanced detection of neurotoxicity and improved productivity in neuroscience research and drug discovery.

This article describes a novel protocol and reagent set designed for sensitive measurement of neurotoxic effects of compounds and treatments on co-cultures of neurons and astrocytes using high content analysis. Results demonstrate that high content analysis represents an exciting novel technology for neurotoxicity assessment.

神経毒性の高いコンテンツ分析のための神経とアストロサイト共培養アッセイ

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

An Optimized Protocol for Rearing Fopius arisanus, a Parasitoid of Tephritid Fruit Flies

Fopius arisanus (Sonan) is an important parasitoid of Tephritid fruit flies for at least two reasons. First, it is the one of only three opiine parasitoids known to infect the host during the egg stage1. Second, it has a wide range of potential fruit fly hosts. Perhaps due to its life history, F. arisanus has been a successfully used for biological control of fruit flies in multiple tropical regions2-4. One impediment to the wide use of F. arisanus for fruit fly control is that it is difficult to establish a stable laboratory colony5-9. Despite this difficulty, in the 1990s USDA researchers developed a reliable method to maintain laboratory populations of F. arisanus10-12. There is significant interest in F. arisanus biology13,14, especially regarding its ability to colonize a wide variety of Tephritid hosts14-17; interest is especially driven by the alarming spread of Bactrocera fruit fly pests to new continents in the last decade18. Further research on F. arisanus and additional deployments of this species as a biological control agent will benefit from optimizations and improvements of rearing methods. In this protocol and associated video article we describe an optimized method for rearing F. arisanus based on a previously described approach12. The method we describe here allows rearing of F. arisanus in a small scale without the use of fruit, using materials available in tropical regions around the world and with relatively low manual labor requirements.

An Optimized Protocol for Rearing Fopius arisanus, a Parasitoid of Tephritid Fruit Flies

Fopius arisanus is an egg-larval parasitoid of Tephritid fruit flies that is successfully used in biological control of these important tropical pests. We describe here an optimized protocol for rearing F. arisanus on a small scale using readily available materials.

子育てに最適化されたプロトコル Fopius arisanus、Tephritid果実の寄生ハエ

Fopius arisanus (Sonan) is an important parasitoid of Tephritid fruit flies for at least two reasons. First, it is the one of only three opiine ...

Isolation and Biophysical Study of Fruit Cuticles

The cuticle, a hydrophobic protective layer on the aerial parts of terrestrial plants, functions as a versatile defensive barrier to various biotic and abiotic stresses and also regulates water flow from the external environment.1 A biopolyester (cutin) and long-chain fatty acids (waxes) form the principal structural framework of the cuticle; the functional integrity of the cuticular layer depends on the outer 'epicuticular' layer as well as the blend consisting of the cutin biopolymer and 'intracuticular' waxes.2 Herein, we describe a comprehensive protocol to extract waxes exhaustively from commercial tomato (Solanum lycopersicum) fruit cuticles or to remove epicuticular and intracuticular waxes sequentially and selectively from the cuticle composite. The method of Jetter and Sch&auml;ffer (2001) was adapted for the stepwise extraction of epicuticular and intracuticular waxes from the fruit cuticle.3,4 To monitor the process of sequential wax removal, solid-state cross-polarization magic-angle-spinning (CPMAS) 13C NMR spectroscopy was used in parallel with atomic force microscopy (AFM), providing molecular-level structural profiles of the bulk materials complemented by information on the microscale topography and roughness of the cuticular surfaces. To evaluate the cross-linking capabilities of dewaxed cuticles from cultivated wild-type and single-gene mutant tomato fruits, MAS 13C NMR was used to compare the relative proportions of oxygenated aliphatic (CHO and CH2O) chemical moieties.
Exhaustive dewaxing by stepwise Soxhlet extraction with a panel of solvents of varying polarity provides an effective means to isolate wax moieties based on the hydrophobic characteristics of their aliphatic and aromatic constituents, while preserving the chemical structure of the cutin biopolyester. The mechanical extraction of epicuticular waxes and selective removal of intracuticular waxes, when monitored by complementary physical methodologies, provides an unprecedented means to investigate the cuticle assembly: this approach reveals the supramolecular organization and structural integration of various types of waxes, the architecture of the cutin-wax matrix, and the chemical composition of each constituent. In addition, solid-state 13C NMR reveals differences in the relative numbers of CHO and CH2O chemical moieties for wild-type and mutant red ripe tomato fruits. The NMR techniques offer exceptional tools to fingerprint the molecular structure of cuticular materials that are insoluble, amorphous, and chemically heterogeneous. As a noninvasive surface-selective imaging technique, AFM furnishes an effective and direct means to probe the structural organization of the cuticular assembly on the nm-&mu;m length scale.

Aerial plant organs are protected by the cuticle, a supramolecular biopolyester-wax assembly. We present protocols to monitor selective removal of epi- and intracuticular waxes from tomato fruit cuticles on molecular and micro scales by solid-state NMR and atomic force microscopy, respectively, and to assess the cross-linking capacity of engineered cuticular biopolyesters.

果実キューティクルの単離と生物物理学的研究

The cuticle, a hydrophobic protective layer on the aerial parts of terrestrial plants, functions as a versatile defensive barrier to various biotic and ...

Analysis of SNARE-mediated Membrane Fusion Using an Enzymatic Cell Fusion Assay

The interactions of SNARE (soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor) proteins on vesicles (v-SNAREs) and on target membranes (t-SNAREs) catalyze intracellular vesicle fusion1-4. Reconstitution assays are essential for dissecting the mechanism and regulation of SNARE-mediated membrane fusion5. In a cell fusion assay6,7, SNARE proteins are expressed ectopically at the cell surface. These "flipped" SNARE proteins drive cell-cell fusion, demonstrating that SNAREs are sufficient to fuse cellular membranes. Because the cell fusion assay is based on microscopic analysis, it is less efficient when used to analyze multiple v- and t-SNARE interactions quantitatively.
Here we describe a new assay8 that quantifies SNARE-mediated cell fusion events by activated expression of &beta;-galactosidase. Two components of the Tet-Off gene expression system9 are used as a readout system: the tetracycline-controlled transactivator (tTA) and a reporter plasmid that encodes the LacZ gene under control of the tetracycline-response element (TRE-LacZ). We transfect tTA into COS-7 cells that express flipped v-SNARE proteins at the cell surface (v-cells) and transfect TRE-LacZ into COS-7 cells that express flipped t-SNARE proteins at the cell surface (t-cells). SNARE-dependent fusion of the v- and t-cells results in the binding of tTA to TRE, the transcriptional activation of LacZ and expression of &beta;-galactosidase. The activity of &beta;-galactosidase is quantified using a colorimetric method by absorbance at 420 nm.
The vesicle-associated membrane proteins (VAMPs) are v-SNAREs that reside in various post-Golgi vesicular compartments10-15. By expressing VAMPs 1, 3, 4, 5, 7 and 8 at the same level, we compare their membrane fusion activities using the enzymatic cell fusion assay. Based on spectrometric measurement, this assay offers a quantitative approach for analyzing SNARE-mediated membrane fusion and for high-throughput studies.

We have developed a cell fusion assay that quantifies SNARE-mediated membrane fusion events by activated expression of &beta;-galactosidase.

酵素による細胞融合アッセイを使用して、SNARE媒介膜融合の解析

The interactions of SNARE (soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor)  proteins on vesicles (v-SNAREs) and on target membranes ...

Laboratory Protocol for Genetic Gut Content Analyses of Aquatic Macroinvertebrates Using Group-specific rDNA Primers

Analyzing food webs is essential for a better understanding of ecosystems. For example, food web interactions can undergo severe changes caused by the invasion of non-indigenous species. However, an exact identification of field predator-prey interactions is difficult in many cases. These analyses are often based on a visual evaluation of gut content or the analysis of stable isotope ratios (&#948;15N and &#948;13C). Such methods require comprehensive knowledge about, respectively, morphologic diversity or isotopic signature from individual prey organisms, leading to obstacles in the exact identification of prey organisms. Visual gut content analyses especially underestimate soft bodied prey organisms, because maceration, ingestion and digestion of prey organisms make identification of specific species difficult. Hence, polymerase chain reaction (PCR) based strategies, for example the use of group-specific primer sets, provide a powerful tool for the investigation of food web interactions. Here, we describe detailed protocols to investigate the gut contents of macroinvertebrate consumers from the field using group-specific primer sets for nuclear ribosomal deoxyribonucleic acid (rDNA). DNA can be extracted either from whole specimens (in the case of small taxa) or out of gut contents of specimens collected in the field. Presence and functional efficiency of the DNA templates need to be confirmed directly from the tested individual using universal primer sets targeting the respective subunit of DNA. We also demonstrate that consumed prey can be determined further down to species level via PCR with unmodified group-specific primers combined with subsequent single strand conformation polymorphism (SSCP) analyses using polyacrylamide gels. Furthermore, we show that the use of different fluorescent dyes as labels enables parallel screening for DNA fragments of different prey groups from multiple gut content samples via automated fragment analysis.

Most common gut content analyses of macroinvertebrates are visual. Requiring intense knowledge about morphological diversity of prey organisms, they miss soft bodied prey and, due to strong comminution of prey, are nearly impossible for some organisms, including amphipods. We provide detailed, novel genetic approaches for macroinvertebrate prey identification in the diet of amphipods.

水生動物使用グループ固有の rDNA プライマーの遺伝的腸内容分析の研究プロトコル

Analyzing food webs is essential for a better understanding of ecosystems. For example, food web interactions can undergo severe changes caused by the ...

Simple Homemade Tools to Handle Fruit Flies&#8212;Drosophila melanogaster

The fruit fly, Drosophila melanogaster, is widely used both in biological research and biology education. Handling adult flies is common but difficult in practice, as adult flies fly. Demonstrated here is how to make some simple and cost-effective tools to address difficult issues in the handling of Drosophila. Holes in foam stoppers are made and pipette tips or funnels are inserted into the holes. Flies then move only in one direction into the pipette tip/funnel assemblage, allowing efficient control of the transfer of adult Drosophila into or out of a vial. Existing protocols have been modified for cool-anesthetizing flies by chilling in crushed ice and transferring them onto a cold, hard icepack surface. The icepack is covered with a piece of medical gauze that keeps immobilized flies from the condensed water when examined under a stereomicroscope. The flies are finally euthanized for counting and sorting or discarded by microwaving. A bottle-shaped cage has also been developed for collecting eggs, as well as a labor-saving device and accompanying protocol for cleaning glass culture vials.

Simple Homemade Tools to Handle Fruit Flies&amp;#8212;&lt;em&gt;Drosophila melanogaster&lt;/em&gt;

Described here is the use of several homemade tools to transfer, chill, and kill adult Drosophila, as well as to clean glass culture vials and collect eggs. These tools are easy to make and are rather efficient in handling Drosophila.

フルーツハエを扱うシンプルな自家製ツール -ショウジョウバエメラノガスター

The fruit fly, Drosophila melanogaster, is widely used both in biological research and biology education. Handling adult flies is common but difficult in ...

Topical Application Bioassay to Quantify Insecticide Toxicity for Mosquitoes and Fruit Flies

The continued use of insecticides for public health and agriculture has led to widespread insecticide resistance and hampering of control methods. Insecticide resistance surveillance of mosquito populations is typically done through Centers for Disease Control and Prevention (CDC) bottle bioassays or World Health Organization (WHO) tube tests. However, these methods can result in a high degree of variability in mortality data due to variable insecticide contact with&#160;the insect, the relatively small numbers of organisms tested, extensive variation in mass between populations, and constantly changing environmental conditions, leading to variable outcomes. This paper presents the topical application bioassay, adapted as a high-throughput phenotypic bioassay for both mosquitoes and fruit flies, to test large numbers of insects along&#160;a range of insecticide concentrations.
This assay 1) ensures consistent treatment and insecticide contact with every organism, 2) produces highly specific dose-response curves that account for differences in average mass between strains and sexes (which is particularly important for field-collected organisms), and 3) allows for the calculation of statistically rigorous median lethal doses (LD50), which are necessary for resistance ratio comparisons-an alternative surveillance approach from diagnostic dose mortality, which is also used for larvicide resistance surveillance. This assay will be a complementary tool for accurately phenotyping mosquito populations and, as illustrated using fruit flies, is easily adaptable for use with other insects. We argue that this assay will help fill the gap between genotypic and phenotypic insecticide resistance in multiple insect species.

We describe the methodology and importance of the topical application bioassay to measure insecticide susceptibility in mosquitoes and fruit flies. The presented assay is high-throughput, utilizes insect mass-thus allowing for calculating a mass-relativized lethal dose instead of concentration-and likely has lower variability than other similar methods.

蚊やショウジョウバエに対する殺虫剤毒性を定量するための局所適用バイオアッセイ

The continued use of insecticides for public health and agriculture has led to widespread insecticide resistance and hampering of control methods. ...

Protocols for CRISPR/Cas9 Mutagenesis of the Oriental Fruit Fly Bactrocera dorsalis

The Oriental fruit fly, Bactrocera dorsalis, is a highly invasive and adaptive pest species that causes damage to citrus and over 150 other fruit crops worldwide. Since adult fruit flies have great flight capacity and females lay their eggs under the skins of fruit, insecticides requiring direct contact with the pest usually perform poorly in the field. With the development of molecular biological tools and high-throughput sequencing technology, many scientists are attempting to develop environmentally friendly pest management strategies. These include RNAi or gene editing-based pesticides that downregulate or silence genes (molecular targets), such as olfactory genes involved in searching behavior, in various insect pests. To adapt these strategies for Oriental fruit fly control, effective methods for functional gene research are needed. Genes with critical functions in the survival and reproduction of B. dorsalis serve as good molecular targets for gene knockdown and/or silencing. The CRISPR/Cas9 system is a reliable technique used for gene editing, especially in insects. This paper presents a systematic method for CRISPR/Cas9 mutagenesis of B. dorsalis, including the design and synthesis of guide RNAs, collecting embryos, embryo injection, insect rearing, and mutant screening. These protocols will serve as a useful guide for generating mutant flies for researchers interested in functional gene studies in B. dorsalis.

Protocols for CRISPR/Cas9 Mutagenesis of the Oriental Fruit Fly Bactrocera dorsalis

This paper presents the step-by-step protocols for CRISPR/Cas9 mutagenesis of the Oriental fruit fly Bactrocera dorsalis. Detailed steps provided by this standardized protocol will serve as a useful guide for generating mutant flies for functional gene studies in B. dorsalis.

オリエンタルショウジョウバエバクトセラ背側のCRISPR/Cas9変異誘発のためのプロトコル

The Oriental fruit fly, Bactrocera dorsalis, is a highly invasive and adaptive pest species that causes damage to citrus and over 150 other fruit crops ...