Name: fruit volatile analysis using an electronic nose
Uploaded: 2012-03-30T13:00:00
Duration: 11 min 2 s
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저자는이 분석을 위해 멜론 열매를 제공해 주셔서 빌 Copes을 (해리스 모란의 종자 회사, 데이비스) 감사합니다. 이 프로젝트는 특수 작물 연구 사업 경쟁력 보조금 프로그램에서 지원하는 것은 아무런을 부여 없습니다. 식량 농업의 USDA 국립 연구소에서 2009-51181-05783.

1. 샘플 준비 <ol><li> 원하는 성숙도 단계에서 수확 과일. 먼지와 먼지를 제거하기 위해 수돗물로 씻어. </li><li> 외부 및 내부 결함, 그리고 크기 균질성의 부재를 기반으로 분석을 위해 과일을 선택합니다. </li><li> 휘발성 시료 채취에 사용되는 웨지로 길이 방향 과일을 잘라. 해당되는 경우, 피부, 씨앗, 씨앗 캐비티 조직, 또는 구덩이를 제거합니다. 과일 조직 선택 실험을하는 동안 일관하게 하나의 과일 (즉, 똑같이 적도, 꽃과 줄기 끝 부분에서 샘플을 얻을) 이내에 계정 다양성을 고려한다. </li><li> 선택한 과일 조직을 결합, 그것을 무작위하기 위하여 그것을 섞어 다음 믹서에 200g을 달다. </li><li> 포화 CaCl 2 용액 (20에서 372.5 g ° C, 탈이온수 500 ML) 및 2-methylbutyl의 100 MM 솔루션 메탄올에 isovalerate 50 μL 200 ML을 추가합니다. CaCl의 2 효소 교류의 억제제 역할을하기위한 것입니다절단 및 과일 살을 homogenizing 후 발생할 수 tivity. 2 Methylbutyl isovalerate은 균질화 과정에서 휘발성 화합물의 가능한 손실에 대해 모니터하는 내부 표준으로 추가됩니다. </li><li> 18,000 rpm으로 30 초 동안 실험실 믹서기 (경고의, 미국)에서 혼합 Homogenize 후 즉시 테플론 뚜껑이있는 유리병과 인감로 붓는다. 모든 샘플이 준비되기 전에는 상온에서 병에 homogenate 보관하십시오. </li><li> 병 속으로 homogenate를 따르고 후 20 ML 유리 호박 튜브로, 거품없이 액체의 거품의 분리, 액체 후 피펫 5 ML의 aliquots 수 있도록 10 분 기다렸다 테플론 들으며 강철 스크류 캡으로 튜브를 밀봉 / 실리콘 septa. 이 절차는 멜론과 배 homogenate 준비에 적합합니다. 다른 과일은 분석에 사용하는 경우에는 원심 분리 단계가 필요할 수 있습니다. 따라서 거품을 제거한 다음 펠렛 입자로 액체 원심 분리기 그 수도피펫을 방해. 기술은 복제의 목적으로 시료마다 적어도 세 튜브를 준비합니다. </li><li> 이때 샘플은 즉시 분석되거나 액화 질소에 플래시 냉동하고 나중에 분석을위한 초저 온도 (-80 ℃)에 저장됩니다. </li><li> 냉동 샘플은 분석 당일 냉동실에서 샘플을 제거하고 그들을 실온에 한 시간 동안 해동 수 있습니다. 해동 및 분석하기 전에 깨끗하고 마른 심장을 가진 새로운 하나를 유리병 뚜껑을 교체 후. 심장이 교체되지 않으면 해동하는 동안 심장에 응축 물을 계기로 그려진하고 손상을하실 수 있습니다. </li></ol> 2. 가스 크로마 토그래피 - 표면 탄성파 (GC-SAW) 설정 및 데이터 수집 <ol><li> zNose에 적절한 분석 방법을로드합니다. 멜론의 에스테르 풍부한 휘발성 프로파일의 분석 내용 MicroSense 버전 5.44.22 소프트웨어 (Newbury 공원, CA, 미국)에있는 매개 변수는 다음과 같습니다로 상부 흡입펌프를 통해 30 ML 분 -1시 20 초 동안 유입 200의 유입 온도 ° C, 225에서 Tenax 트랩 온도 ° C, 2.9 ML 분-1 캐리어 가스 (헬륨 순도 99.999 %) 유량, 열 (DB-5 45 열, 1m × 0.25mm ID × 0.25 μm의 필름 두께) 온도 프로그램 ° C ~ 180 ° C 10의 속도 ° C에서 초 -1; 40 센서 온도 ° C, 165의 밸브 ° C. 총 분석 시간은 시료 당 일분입니다. </li><li> zNose 입구에 비 coring 팁과 스테인레스 스틸 바늘을 연결하고베이스 라인은 안정 200 계산보다 큰 어떤 봉우리는 (CT) 감지되지되기 전까지는 주위 공기 시스템을 여러 번 뿌리를 뽑아야. </li><li> 스트레이트 체인 alkanes (C6-C14)의 솔루션을 사용하여 악기를 맞춰주세요. 조정 결과가 Kovats 지수 (KI) 단위로 시간 단위에서 eluted 봉우리의 보존 시간을 변환할 악기 소프트웨어에 의해 사용됩니다. 시스템이 조정된 후 그 결과, 보유 시간은 KI 단위로보고됩니다. </li&gt; <li> 분석 전에 시료 30 분 동안 평형 수 있습니다. 샘플 병 중 하나를 분석하기 위해 압력을 완화하기 위해 유리병의 심장에 바늘을 삽입합니다. 그런 다음 유리병의 심장으로 악기 입구에 연결된 바늘을 삽입하고 상부 공간 샘플링을 시작합니다. 기술적 분석 적어도 세는 샘플 당 복제합니다. </li><li> 수동으로 &quot;재생&quot;버튼을 클릭하여 악기를 시작, 펌프 활성화 및 퇴진은 증기가 샘플 위에 제시. 분석이 끝나면, 크로마토 그램이 화면에 나타납니다, 그리고 센서가 자동으로 그것을 청소하기 위해 10 초 동안 150 ° C로 가열한다. 시스템 상태 상자 단추를 다시 녹색으로 바뀌자하면 악기가 다른 샘플을 분석할 준비가되어 있습니다. </li><li> 안정적인 기준과 적절한 시스템 클리닝을 보장하려면 각 샘플 사이에 적어도 한 공기를 비워를 실행합니다. 유리병과 덮개에서 가능한 휘발성 오염 물질에 대한 모니터링하려면 하루의 시작과 끝에 두 개의 유리병-공란 (모자와 빈 유리병)을 분석합니다. &lt;이/ 리&gt; </ol> 3. 데이터 내보내기 및 분석 <ol><li> MicroSense 소프트웨어의 &quot;피크 로깅&quot;기능을 이용하여 인수 후 Microsoft Excel 파일에 데이터를 내보냅니다. 데이터가 수출되면, 변수와 복제를 위해 라벨을 포함하는 열을 추가합니다. </li><li> 스크립트를 우리는 &quot;reform_data.py&quot;(전과 스크립트 &quot;reform_data 사용 후 데이터 형식의 예를 들어 그림 1 참조라는 이름의, 개발, 파이썬을 사용하여 쉽게 조작 (자유롭게 사용할 온라인 버전 2.6)에 대한 데이터 형식을 변환. 평 &quot;). 입력 데이터뿐만 아니라, 출력에 대한 원하는 파일 이름 (XLS 포맷)의 원본 파일 (XLS 포맷) 및 시트 이름의 이름은, 직접 스크립트에서 수정합니다. </li><li> &quot;kim_interface.py&quot;을 (또한 파이썬 2.6로 작성된; 그림 2 참조) 시작하고 이전 단계에서 생성된 파일에서 데이터를 가져옵니다. 특히, 분석은 각 KI의 가치가 발견되었다 번보고와 수를 분석을 기반으로합니다( &quot;KI 히트&quot;). 따라서 프로그램은 각 KI 값에 대한 KI의 히트 막대 그래프를 표시합니다. </li><li> 기술의 각 그룹이 함께 복제 분석 시료의 특정 하위 집합 KI 히트를 평가하십시오. 이렇게하려면 확인 / 해당 확인란의 선택을 취소하여 별도로 모든 치료 또는 변수를 분석합니다. 그래픽 사용자 인터페이스 (GUI) 기능에 대한 자세한 설명을 위해 그림 2 캡션을 참조하십시오. </li><li> GUI를 사용하여 각 KI 창의 너비를 식별 후, 무작위로 Microsense 소프트웨어의 해당 chromatograms의 일부를 선택하고 기술 가운데 봉우리를 중복하는 것은 복제 평가할 수 있습니다. 복제 두 기술의 오버레이 chromatograms의 예를 들어 그림 3을 참조하십시오. </li><li> KI 창이 individuated되면 가장 인구 KI로, 윈도우에 빠지지 KIs 병합하는 GUI에서 사용할 수있는 &#39;병합&#39;기능을 사용합니다. 이 기능을 사용하여 KI 값의 범위와 라벨이 봉우리는 단일 KI 레이블, allowi 아래 통합되어NG는 단일 변수 같은 봉우리를 치료. 이렇게하려면 먼저 기능을 활성화하기 위해 &#39;병합&#39;버튼을 클릭하고 해당 모음을 왼쪽 클릭하여 윈도우의 중심지로 가장 인구 KI를 선택합니다. 표시줄이 선택되면, 그것은 색상을 변경하고 녹색으로 변합니다. 선택된 KI로 창 내에서 떨어지지 KIs 병합하려면 해당 막대에 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고, 해당하는 길이의 파란색 막대가 중앙 KI의 상단에 추가하는 동안 이것은 (그림 4, 바, 빨간색으로 활성화됩니다 ). 일단 모든 선택된 KIs가 해당 중앙 KI로 통합되어, 변경 내용을 적용하려면 다시 &#39;병합&#39;버튼을 클릭하여,이 노란색 설정하는 &#39;병합&#39;버튼을 일으 킵니다. 실수의 경우에는 &#39;Unmerge&#39;버튼도 사용할 수 있습니다. unmerge하려면 unmerge하려는 빨간색 표시줄을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭 후 GUI에서 &#39;Unmerge&#39;버튼을 클릭하십시오. 빨간색에서 막대는 파란색으로 변합니다. 변경 내용을 적용하려면 다시 &#39;Unmerge&#39;버튼을 클릭하십시오. </li><li> 만약 내가 한 시도ncorrectly 단일 KI 값에 하나의 샘플에서 두 봉우리를 병합, 오류 메시지가 인쇄됩니다. 이러한 상황에서 밀접하게 크로마토 그램을 확인하고 해당 지역의 KI 창을 재정. </li><li> 일단 합병 작업이 모두 수행되고 있고, 파일을 저장합니다. </li><li> 통계 분석을 진행하기 전에 공기와 유리병의 여백의 chromatograms은 가능한 contaminations에 대한 모니터링을 분석하고 있습니다. 공백의 봉우리 KI가 확인되고 나면, 샘플의 피크 현재의 지역에서 공기 및 / 또는 유리병 - 빈에서 검색된 피크의 영역을 뺍니다. 그렇다면 통계 분석과 함께 진행합니다. </li></ol> 4. 대표 결과 전자 코는 서로 다른 성숙도 단계 (그림 5)에서 수확한 멜론 과일 중에서 휘발성 프로파일의 차이를 감지할 수있었습니다. 스물 KI 창문은 모든 샘플에 걸쳐 발견되었다. 분산 분석은 14 봉우리가 dete 것으로 나타났다성숙도 단계 사이에 상당히 다양한 전자 코에 의해 cted. 그림 6에서는 이러한 14 구성 요소의 평균 피크 영역의 로그가 빨리 성숙하고 완전히 익은 과일이 성숙 단계 사이에 피크 abundances의 차이를 보여주 꾸몄다있다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3821/3821fig1.jpg" /> 그림 1. 악기 소프트웨어 ()에서와 변환 후, &quot;reform_data.py&quot;스크립트 (B)를 사용하여 수행했습니다. 내보낸 데이터 형식의 예 데이터 조작 및 분석을 용이하게하려면 모든 고유 KIs 모든 샘플을 통해 식별됩니다 다음 데이터는 행과 독특한 KIs에 해당하는 컬럼에서 피크 영역에서 샘플 정보 reordered있다. 정상은 샘플에서 KI 가치에 대한 감지되지 않을 경우 해당 셀은 비어 있습니다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3821/3821fig2.jpg" /> 처방전의 그림 2. 화면 캡처t 파일 &quot;kim_interface.py&quot;. 중앙의 줄거리는 KI 대 KI 당 안타의 개수를 표시합니다. &#39;KI 당 쳐&#39;특정 KI와 피크가 발견되었다있는 샘플 수입니다. 왼쪽에서 선택한 데이터를 제어하는​​ 세 노란 박스가 없습니다. 그들은 데이터 집합 (트리 트먼트, 복제, 질적 변수 등) 나눌 매개 변수를 표시합니다. 이 그림에서, 그들은 (아래로 위로부터) 위치 : 불안 다양한 녹화 날짜와 성숙도 단계. 하단에 : 3 개 바을 클릭하고 왼쪽이나 오른쪽에 파란색 막대를 이동하여, 하나는 최소 및 KI 범위 및 최소 피크 면적 ( &#39;쓰레 쉬 홀드&#39;)의 최대 가치를 선택할 수 있습니다. 오른쪽 : &#39;병합&#39;버튼을 수동으로 줄거리에서 막대를 클릭하여 선택한 KIs 병합 있습니다. &#39;Unmerge&#39;버튼이 하나가 선택된 경우는 과정을 뒤집을 수 있습니다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/3821/3821fig3.jpg" /> 그림 3. 중첩의 chromatograms (에<html> 이 기술의 검정과 빨강)은 체류 시간의 변화를 설명하기 멜론 휘발성 헤드 스페이스에서 복제합니다. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/3821/3821fig4.jpg" /> 그림 4. 절차를 병합 KI의 예. 중심 줄거리에서 녹색 막대 (중앙 KI)는 KI 창의 중심으로 선정되어 가장 인구 KI를 나타냅니다. KI X와 Y는 KI 관심 창에 떨어지는 KIs이며, 그들은 중앙 KI으로 병합해야합니다. KI X의 표시줄에서 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭함으로써, 붉게하고, 동시에 KI X의 막대의 동일한 길이의 파란색 막대가 초록색의 상단에 나타납니다. KI Y, 파란색 막대의 길이 (합병 KIs)에 대해 동일한 절차를 반복하여 해당 길이 증가합니다. 일단 모든 KIs가 그린 &#39;병합&#39;버튼을 병합 프로세스 종료를 클릭하여, 추가되어, 변경 사항이 저장하고, 버튼 색상은 노란색 밝혀졌있다. / files/ftp_upload/3821/3821fig5.jpg &quot;/&gt; 그림 5. 서로 다른 성숙도 단계에서 수확한 멜론 샘플 두 chromatograms 일찍 성숙 (위)와 완벽하게 익은 (아래), 휘발성 abundances의 차이를 감지하는 전자 코의 능력을 설명합니다. <img alt="그림 6" src="/files/ftp_upload/3821/3821fig6.jpg" /> 그림 6. 조기 성숙하고 완전히 익은 두 개의 서로 다른 성숙도 단계, 두 멜론 샘플에있는 14 구성 요소의 피크 영역을 보여주는 레이더 플롯. 피크 영역은 비교를 시각화하기 위해 로그 스케일에보고됩니다. 각 선의 끝에 숫자는 해당 Kovats 지수를 나타냅니다.

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우리는 공개 할게 없다.

전기 코는 과일이나 휘발성이 풍부한 샘플에서 아로마 프로파일의 급속한, 객관적인 평가를위한 유망한 방법을 나타냅니다. 그러나 피크 식별을 위해 도전을 대표하는 두 chromatograms 완벽하게 정렬되지 않은 경우 데이터의 오해로 이어질 수 있습니다 보존 기간에 옮겨 보겠습니다. chromatograms 시각 검사는 샘플 사이에서 유지 시간의 변화가 자주 조금씩 다른 KI 값 (약 ± 10)으로 표시되는 동일한 정상을 일으킨다고 지적했다. 이것은 감지 독특한 KIs의 과장된 숫자로 번역했습니다. () 다른 화합물이 다른 성숙도 단계에서 존재 및 (b) 기술은 복제하는 것은 두 컴퓨터 기반의 스크립트 (데이터를 처리하기위한 루틴을 포함 &quot;kim_merge.py&quot;, 대략 동일하다는 점을 사실을 활용하기 위해서는 세트와 그래픽 사용자 인터페이스 (GUI)를 제공하는 &quot;kim_interface.py&quot;는) 체계적으로 개발되었다크게 대용량 데이터 세트의 크로마토 그램 분석에 필요한 시간을 줄이고, 세미 자동화된 방식으로 샘플을 비교합니다. 적절한 경우 이러한 프로그램은 단일 KI 레이블 아래 KI 값의 범위로 표시된 봉우리, 통합을 허용합니다. 이것은 두 가지 중요한 목적을 수행합니다 : (A) 그것은 하나의 변수 같은 봉우리 치료를 위해 통계 분석을 가능하게, 그리고 (b)는 피크 신분증 및 기타 시스템과 출판 값으로 비교를 용이하게합니다. 여기에 제시된 결과 멜론 샘플은 적절한 KI 식별와 함께 zNose 시스템을 사용하여 성숙함과 아로마 프로파일을 바탕으로 차별받을 수 있음을 나타냅니다. 이것은 품질 관리 프로그램에 사용할 수있는 휘발성 물질의 분석을위한 유망한 새로운 기술을 나타냅니다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> 염화칼슘 </td><td> MP 바이오 메디컬 </td><td> 195,088 </td><td></td></tr><tr><td> 2 - Methylbutyl isovalerate </td><td> SAFC 글로벌 </td><td> W350613 </td><td> ≥ 98%, 자연, FCC </td></tr><tr><td> 메탄올 </td><td> 피셔 과학 </td><td> A411-4 </td><td></td></tr><tr><td> 유리병 </td><td> 시그마 / Supelco </td><td> SU860098 </td><td></td></tr><tr><td> 캡 </td><td> 시그마 / Supelco </td><td> SU860101 </td><td></td></tr><tr><td> 실험실 믹서기 </td><td> 경고의 실험실 과학 </td><td> 7009G </td><td> 2 - 고속 믹서기, 1 - 리터 유리 용기 </td></tr><tr><td> 병 </td><td> 피셔 과학 </td><td> 06-414-1C </td><td> Pyrex, 500 ML, 폴리 프로필렌 플러그 - 밀봉 </td></tr><tr><td> 바늘 </td><td> 전자 센서 기술 </td><td> TLC101046 </td><td> 사이드 구멍 luer </td></tr><tr><td> Alkanes 솔루션 </td><td> 전자 센서 기술 </td><td></td><td> 메탄올의 C6-C14의 alkanes 솔루션 </td></tr><tr><td> zNose </td><td> 전자 센서 기술 </td><td> 모델 4500 </td><td></td></tr><tr><td> DB-5 GC 컬럼 </td><td> 전자 센서 기술 </td><td> SYS4500C5 </td><td></td></tr><tr><td> MicroSense </td><td> 전자 센서 기술 </td><td> 버전 5.44.22 </td><td></td></tr><tr><td> 파이썬 2.6 </td><td></td><td></td><td> 자유롭게 사용할 수 온라인 </td></tr><tr><td> &quot;reform_data.py&quot;과 &quot;kim_interface.py&quot;스크립트</td><td></td><td></td><td> 목성에 대한 보충 자료로 사용할 수 스크립트 </td></tr></tbody></table>

fruit volatile analysis using an electronic nose

수많은 다양한 생리적 변화는 과일 향기를 특징 짓는 특정 휘발성 조화의 개발을 포함한 과일 숙성, 동안 발생합니다. 수확시 성숙은 과일과 야채 1의 맛을 품질에 영향을 미치는 주요 요인 중 하나입니다. 빠르게 과일 성숙을 평가하고 아로마 품질 고급 번식 프로그램, 생산 관행 및 postharvest 취급 향상된 관리를 시키는데 도움이 될 강력한 방법의 검증. 지난 30 년 동안, 많은 연구가 급속도로 냄새와 맛을 2-4 감지할 수 장치입니다 이른바 전자 코를 개발하기 위해 실시되었습니다. 현재 다른 ​​기술을 기반으로 휘발성 분석을 수행할 수있는 여러 가지 상업적으로 이용 가능한 전자 코가 없습니다. (zNose, 동부 표준시, Newbury 공원, CA, 미국) 우리의 작업에 사용되는 전자 코는 (표면 탄성파 센서와 결합 초고속 가스 크로마 토그래피로 구성되어 UFGC-) 볼께요. 망고 6 성숙과 부패 평가;이 기술은 이미 사과 5 저하의 감지 등 다양한 상품의 품질을 모니터하는 기능에 대해 테스트되었습니다 thymus 종의 아로마 파일링 7, 포도 딸기 8의 C 6 휘발성 화합물, 특성화 중 식물성 기름 9, 버진 코코넛 오일 10 adulterants의 검출. 헤드 스페이스 샘플링, 휘발성 화합물의 분리 및 검출 :이 시스템은 아로마 분석의 세 가지 주요 단계를 수행할 수 있습니다. 약 분에 출력, 크로마토 그램은 정화 사이클 후, 악기 추가 분석을위한 준비, 생산하고 있습니다. zNose으로 얻은 결과는 Kovats 지수 (KI)의 계산에 의해 다른 가스 색층 시스템의 사람들에게 비교할 수 있습니다. 악기는 alkane 표준 용액으로 조정 후에는 고정 시간은 자동으로 변환됩니다KIs. 그러나, 온도 및 유량에 약간의 변경 사항이 유지 시간이 표류하는 원인, 시간이 지남에 발생할 것으로 예상된다. 또한, 컬럼 고정 단계의 극성에 따라 KI 계산의 재현성은 여러 인덱스 유닛 11 시까지는 다를 수 있습니다. 프로그램과 그래픽 인터페이스의 일련 따라서 세미 자동화된 방식으로 샘플 간의 계산 KIs을 비교하기 위해 개발되었다. 이러한 프로그램은 대용량 데이터 세트의 크로마토 그램 분석에 필요한 시간을 줄이고 ch​​romatograms 완벽하게 정렬되지 않은 데이터의 오해의 가능성을 최소화. 우리는 과일의 급속한 휘발성 화합물 분석을위한 방법을 제시한다. 샘플 준비, 데이터 수집 및 처리 절차도 논의하고 있습니다.

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Fruit Volatile Analysis Using an Electronic Nose

열매의 휘발성 화합물 분석을위한 신속한 방법을 설명합니다. 샘플의 homogenate의 헤드 스페이스에 존재하는 휘발성 화합물은 급속하게 분리되어 표면 탄성파 (SAW) 센서와 결합 초고속 가스 크로마 토그래피 (GC)로 검색됩니다. 데이터 처리 및 분석을위한 절차도 논의하고 있습니다.

전자 코를 사용하여 과일 휘발성 분석

Numerous and diverse physiological changes occur during fruit ripening, including the development of a specific volatile blend that characterizes fruit ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Studying Aggression in Drosophila (fruit flies)

Aggression is an innate behavior that evolved in the framework of defending or obtaining resources. This complex social behavior is influenced by genetic, hormonal and environmental factors. In many organisms, aggression is critical to survival but controlling and suppressing aggression in distinct contexts also has become increasingly important. In recent years, invertebrates have become increasingly useful as model systems for investigating the genetic and systems biological basis of complex social behavior. This is in part due to the diverse repertoire of behaviors exhibited by these organisms. In the accompanying video, we outline a method for analyzing aggression in Drosophila whose design encompasses important eco-ethological constraints. Details include steps for: making a fighting chamber; isolating and painting flies; adding flies to the fight chamber; and video taping fights. This approach is currently being used to identify candidate genes important in aggression and in elaborating the neuronal circuitry that underlies the output of aggression and other social behaviors.

Studying Aggression in Drosophila fruit flies

(과일 파리) Drosophila의 침략을 유학

Aggression is an innate behavior that evolved in the framework of defending or obtaining resources.  This complex social behavior is influenced by ...

연구

생물학

Homemade Site Directed Mutagenesis of Whole Plasmids

Site directed mutagenesis of whole plasmids is a simple way to create slightly different variations of an original plasmid. With this method the cloned target gene can be altered by substitution, deletion or insertion of a few bases directly into a plasmid. It works by simply amplifying the whole plasmid, in a non PCR-based thermocycling reaction. During the reaction mutagenic primers, carrying the desired mutation, are integrated into the newly synthesized plasmid. In this video tutorial we demonstrate an easy and cost effective way to introduce base substitutions into a plasmid. The protocol works with standard reagents and is independent from commercial kits, which often are very expensive. Applying this protocol can reduce the total cost of a reaction to an eighth of what it costs using some of the commercial kits. In this video we also comment on critical steps during the process and give detailed instructions on how to design the mutagenic primers.

Site directed mutagenesis of whole plasmids is a simple way to create slightly different variations of an original plasmid. Here we demonstrate an easy and cost effective way to introduce base substitutions into a plasmid using standard reagents.

전체 Plasmids의 수제 사이트 감독 돌연변이 유발

Site directed mutagenesis of whole plasmids is a simple way to create slightly different variations of an original plasmid. With this method the cloned ...

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing measurement of multiple cellular phenotypes within a single assay. In this study, we utilized HCA to develop a novel assay for neurotoxicity. Neurotoxicity assessment represents an important part of drug safety evaluation, as well as being a significant focus of environmental protection efforts. Additionally, neurotoxicity is also a well-accepted in vitro marker of the development of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's and Parkinson's diseases. Recently, the application of HCA to neuronal screening has been reported. By labeling neuronal cells with &beta;III-tubulin, HCA assays can provide high-throughput, non-subjective, quantitative measurements of parameters such as neuronal number, neurite count and neurite length, all of which can indicate neurotoxic effects. However, the role of astrocytes remains unexplored in these models. Astrocytes have an integral role in the maintenance of central nervous system (CNS) homeostasis, and are associated with both neuroprotection and neurodegradation when they are activated in response to toxic substances or disease states. GFAP is an intermediate filament protein expressed predominantly in the astrocytes of the CNS. Astrocytic activation (gliosis) leads to the upregulation of GFAP, commonly accompanied by astrocyte proliferation and hypertrophy. This process of reactive gliosis has been proposed as an early marker of damage to the nervous system. The traditional method for GFAP quantitation is by immunoassay. This approach is limited by an inability to provide information on cellular localization, morphology and cell number. We determined that HCA could be used to overcome these limitations and to simultaneously measure multiple features associated with gliosis - changes in GFAP expression, astrocyte hypertrophy, and astrocyte proliferation - within a single assay. In co-culture studies, astrocytes have been shown to protect neurons against several types of toxic insult and to critically influence neuronal survival. Recent studies have suggested that the use of astrocytes in an in vitro neurotoxicity test system may prove more relevant to human CNS structure and function than neuronal cells alone. Accordingly, we have developed an HCA assay for co-culture of neurons and astrocytes, comprised of protocols and validated, target-specific detection reagents for profiling &beta;III-tubulin and glial fibrillary acidic protein (GFAP). This assay enables simultaneous analysis of neurotoxicity, neurite outgrowth, gliosis, neuronal and astrocytic morphology and neuronal and astrocytic development in a wide variety of cellular models, representing a novel, non-subjective, high-throughput assay for neurotoxicity assessment. The assay holds great potential for enhanced detection of neurotoxicity and improved productivity in neuroscience research and drug discovery.

This article describes a novel protocol and reagent set designed for sensitive measurement of neurotoxic effects of compounds and treatments on co-cultures of neurons and astrocytes using high content analysis. Results demonstrate that high content analysis represents an exciting novel technology for neurotoxicity assessment.

Neurotoxicity 높은 컨텐츠 분석의 연결 및 Astrocyte 공동 문화 분석

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

An Optimized Protocol for Rearing Fopius arisanus, a Parasitoid of Tephritid Fruit Flies

Fopius arisanus (Sonan) is an important parasitoid of Tephritid fruit flies for at least two reasons. First, it is the one of only three opiine parasitoids known to infect the host during the egg stage1. Second, it has a wide range of potential fruit fly hosts. Perhaps due to its life history, F. arisanus has been a successfully used for biological control of fruit flies in multiple tropical regions2-4. One impediment to the wide use of F. arisanus for fruit fly control is that it is difficult to establish a stable laboratory colony5-9. Despite this difficulty, in the 1990s USDA researchers developed a reliable method to maintain laboratory populations of F. arisanus10-12. There is significant interest in F. arisanus biology13,14, especially regarding its ability to colonize a wide variety of Tephritid hosts14-17; interest is especially driven by the alarming spread of Bactrocera fruit fly pests to new continents in the last decade18. Further research on F. arisanus and additional deployments of this species as a biological control agent will benefit from optimizations and improvements of rearing methods. In this protocol and associated video article we describe an optimized method for rearing F. arisanus based on a previously described approach12. The method we describe here allows rearing of F. arisanus in a small scale without the use of fruit, using materials available in tropical regions around the world and with relatively low manual labor requirements.

An Optimized Protocol for Rearing Fopius arisanus, a Parasitoid of Tephritid Fruit Flies

Fopius arisanus is an egg-larval parasitoid of Tephritid fruit flies that is successfully used in biological control of these important tropical pests. We describe here an optimized protocol for rearing F. arisanus on a small scale using readily available materials.

리어링을위한 최적화된 프로토콜 Fopius arisanus Tephritid 과일 Parasitoid 난다

Fopius arisanus (Sonan) is an important parasitoid of Tephritid fruit flies for at least two reasons. First, it is the one of only three opiine ...

Isolation and Biophysical Study of Fruit Cuticles

The cuticle, a hydrophobic protective layer on the aerial parts of terrestrial plants, functions as a versatile defensive barrier to various biotic and abiotic stresses and also regulates water flow from the external environment.1 A biopolyester (cutin) and long-chain fatty acids (waxes) form the principal structural framework of the cuticle; the functional integrity of the cuticular layer depends on the outer 'epicuticular' layer as well as the blend consisting of the cutin biopolymer and 'intracuticular' waxes.2 Herein, we describe a comprehensive protocol to extract waxes exhaustively from commercial tomato (Solanum lycopersicum) fruit cuticles or to remove epicuticular and intracuticular waxes sequentially and selectively from the cuticle composite. The method of Jetter and Sch&auml;ffer (2001) was adapted for the stepwise extraction of epicuticular and intracuticular waxes from the fruit cuticle.3,4 To monitor the process of sequential wax removal, solid-state cross-polarization magic-angle-spinning (CPMAS) 13C NMR spectroscopy was used in parallel with atomic force microscopy (AFM), providing molecular-level structural profiles of the bulk materials complemented by information on the microscale topography and roughness of the cuticular surfaces. To evaluate the cross-linking capabilities of dewaxed cuticles from cultivated wild-type and single-gene mutant tomato fruits, MAS 13C NMR was used to compare the relative proportions of oxygenated aliphatic (CHO and CH2O) chemical moieties.
Exhaustive dewaxing by stepwise Soxhlet extraction with a panel of solvents of varying polarity provides an effective means to isolate wax moieties based on the hydrophobic characteristics of their aliphatic and aromatic constituents, while preserving the chemical structure of the cutin biopolyester. The mechanical extraction of epicuticular waxes and selective removal of intracuticular waxes, when monitored by complementary physical methodologies, provides an unprecedented means to investigate the cuticle assembly: this approach reveals the supramolecular organization and structural integration of various types of waxes, the architecture of the cutin-wax matrix, and the chemical composition of each constituent. In addition, solid-state 13C NMR reveals differences in the relative numbers of CHO and CH2O chemical moieties for wild-type and mutant red ripe tomato fruits. The NMR techniques offer exceptional tools to fingerprint the molecular structure of cuticular materials that are insoluble, amorphous, and chemically heterogeneous. As a noninvasive surface-selective imaging technique, AFM furnishes an effective and direct means to probe the structural organization of the cuticular assembly on the nm-&mu;m length scale.

Aerial plant organs are protected by the cuticle, a supramolecular biopolyester-wax assembly. We present protocols to monitor selective removal of epi- and intracuticular waxes from tomato fruit cuticles on molecular and micro scales by solid-state NMR and atomic force microscopy, respectively, and to assess the cross-linking capacity of engineered cuticular biopolyesters.

분리 및 과일 손톱의 Biophysical 연구

The cuticle, a hydrophobic protective layer on the aerial parts of terrestrial plants, functions as a versatile defensive barrier to various biotic and ...

Analysis of SNARE-mediated Membrane Fusion Using an Enzymatic Cell Fusion Assay

The interactions of SNARE (soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor) proteins on vesicles (v-SNAREs) and on target membranes (t-SNAREs) catalyze intracellular vesicle fusion1-4. Reconstitution assays are essential for dissecting the mechanism and regulation of SNARE-mediated membrane fusion5. In a cell fusion assay6,7, SNARE proteins are expressed ectopically at the cell surface. These "flipped" SNARE proteins drive cell-cell fusion, demonstrating that SNAREs are sufficient to fuse cellular membranes. Because the cell fusion assay is based on microscopic analysis, it is less efficient when used to analyze multiple v- and t-SNARE interactions quantitatively.
Here we describe a new assay8 that quantifies SNARE-mediated cell fusion events by activated expression of &beta;-galactosidase. Two components of the Tet-Off gene expression system9 are used as a readout system: the tetracycline-controlled transactivator (tTA) and a reporter plasmid that encodes the LacZ gene under control of the tetracycline-response element (TRE-LacZ). We transfect tTA into COS-7 cells that express flipped v-SNARE proteins at the cell surface (v-cells) and transfect TRE-LacZ into COS-7 cells that express flipped t-SNARE proteins at the cell surface (t-cells). SNARE-dependent fusion of the v- and t-cells results in the binding of tTA to TRE, the transcriptional activation of LacZ and expression of &beta;-galactosidase. The activity of &beta;-galactosidase is quantified using a colorimetric method by absorbance at 420 nm.
The vesicle-associated membrane proteins (VAMPs) are v-SNAREs that reside in various post-Golgi vesicular compartments10-15. By expressing VAMPs 1, 3, 4, 5, 7 and 8 at the same level, we compare their membrane fusion activities using the enzymatic cell fusion assay. Based on spectrometric measurement, this assay offers a quantitative approach for analyzing SNARE-mediated membrane fusion and for high-throughput studies.

We have developed a cell fusion assay that quantifies SNARE-mediated membrane fusion events by activated expression of &beta;-galactosidase.

효소 세포 융합 분석을 사용하여 올가미로 인한 막 퓨전 분석

The interactions of SNARE (soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor)  proteins on vesicles (v-SNAREs) and on target membranes ...

Laboratory Protocol for Genetic Gut Content Analyses of Aquatic Macroinvertebrates Using Group-specific rDNA Primers

Analyzing food webs is essential for a better understanding of ecosystems. For example, food web interactions can undergo severe changes caused by the invasion of non-indigenous species. However, an exact identification of field predator-prey interactions is difficult in many cases. These analyses are often based on a visual evaluation of gut content or the analysis of stable isotope ratios (&#948;15N and &#948;13C). Such methods require comprehensive knowledge about, respectively, morphologic diversity or isotopic signature from individual prey organisms, leading to obstacles in the exact identification of prey organisms. Visual gut content analyses especially underestimate soft bodied prey organisms, because maceration, ingestion and digestion of prey organisms make identification of specific species difficult. Hence, polymerase chain reaction (PCR) based strategies, for example the use of group-specific primer sets, provide a powerful tool for the investigation of food web interactions. Here, we describe detailed protocols to investigate the gut contents of macroinvertebrate consumers from the field using group-specific primer sets for nuclear ribosomal deoxyribonucleic acid (rDNA). DNA can be extracted either from whole specimens (in the case of small taxa) or out of gut contents of specimens collected in the field. Presence and functional efficiency of the DNA templates need to be confirmed directly from the tested individual using universal primer sets targeting the respective subunit of DNA. We also demonstrate that consumed prey can be determined further down to species level via PCR with unmodified group-specific primers combined with subsequent single strand conformation polymorphism (SSCP) analyses using polyacrylamide gels. Furthermore, we show that the use of different fluorescent dyes as labels enables parallel screening for DNA fragments of different prey groups from multiple gut content samples via automated fragment analysis.

Most common gut content analyses of macroinvertebrates are visual. Requiring intense knowledge about morphological diversity of prey organisms, they miss soft bodied prey and, due to strong comminution of prey, are nearly impossible for some organisms, including amphipods. We provide detailed, novel genetic approaches for macroinvertebrate prey identification in the diet of amphipods.

Macroinvertebrates 사용 하 여 그룹별 수생 rDNA 뇌관의 유전 직감 콘텐츠 분석을 위한 실험실 프로토콜

Analyzing food webs is essential for a better understanding of ecosystems. For example, food web interactions can undergo severe changes caused by the ...

Simple Homemade Tools to Handle Fruit Flies&#8212;Drosophila melanogaster

The fruit fly, Drosophila melanogaster, is widely used both in biological research and biology education. Handling adult flies is common but difficult in practice, as adult flies fly. Demonstrated here is how to make some simple and cost-effective tools to address difficult issues in the handling of Drosophila. Holes in foam stoppers are made and pipette tips or funnels are inserted into the holes. Flies then move only in one direction into the pipette tip/funnel assemblage, allowing efficient control of the transfer of adult Drosophila into or out of a vial. Existing protocols have been modified for cool-anesthetizing flies by chilling in crushed ice and transferring them onto a cold, hard icepack surface. The icepack is covered with a piece of medical gauze that keeps immobilized flies from the condensed water when examined under a stereomicroscope. The flies are finally euthanized for counting and sorting or discarded by microwaving. A bottle-shaped cage has also been developed for collecting eggs, as well as a labor-saving device and accompanying protocol for cleaning glass culture vials.

Simple Homemade Tools to Handle Fruit Flies&amp;#8212;&lt;em&gt;Drosophila melanogaster&lt;/em&gt;

Described here is the use of several homemade tools to transfer, chill, and kill adult Drosophila, as well as to clean glass culture vials and collect eggs. These tools are easy to make and are rather efficient in handling Drosophila.

과일 파리를 처리하는 간단한 수제 도구 -초파리 멜라노가스터

The fruit fly, Drosophila melanogaster, is widely used both in biological research and biology education. Handling adult flies is common but difficult in ...

Topical Application Bioassay to Quantify Insecticide Toxicity for Mosquitoes and Fruit Flies

The continued use of insecticides for public health and agriculture has led to widespread insecticide resistance and hampering of control methods. Insecticide resistance surveillance of mosquito populations is typically done through Centers for Disease Control and Prevention (CDC) bottle bioassays or World Health Organization (WHO) tube tests. However, these methods can result in a high degree of variability in mortality data due to variable insecticide contact with&#160;the insect, the relatively small numbers of organisms tested, extensive variation in mass between populations, and constantly changing environmental conditions, leading to variable outcomes. This paper presents the topical application bioassay, adapted as a high-throughput phenotypic bioassay for both mosquitoes and fruit flies, to test large numbers of insects along&#160;a range of insecticide concentrations.
This assay 1) ensures consistent treatment and insecticide contact with every organism, 2) produces highly specific dose-response curves that account for differences in average mass between strains and sexes (which is particularly important for field-collected organisms), and 3) allows for the calculation of statistically rigorous median lethal doses (LD50), which are necessary for resistance ratio comparisons-an alternative surveillance approach from diagnostic dose mortality, which is also used for larvicide resistance surveillance. This assay will be a complementary tool for accurately phenotyping mosquito populations and, as illustrated using fruit flies, is easily adaptable for use with other insects. We argue that this assay will help fill the gap between genotypic and phenotypic insecticide resistance in multiple insect species.

We describe the methodology and importance of the topical application bioassay to measure insecticide susceptibility in mosquitoes and fruit flies. The presented assay is high-throughput, utilizes insect mass-thus allowing for calculating a mass-relativized lethal dose instead of concentration-and likely has lower variability than other similar methods.

모기 및 초파리에 대한 살충제 독성을 정량화하기위한 국소 응용 생물 검정

The continued use of insecticides for public health and agriculture has led to widespread insecticide resistance and hampering of control methods. ...

Protocols for CRISPR/Cas9 Mutagenesis of the Oriental Fruit Fly Bactrocera dorsalis

The Oriental fruit fly, Bactrocera dorsalis, is a highly invasive and adaptive pest species that causes damage to citrus and over 150 other fruit crops worldwide. Since adult fruit flies have great flight capacity and females lay their eggs under the skins of fruit, insecticides requiring direct contact with the pest usually perform poorly in the field. With the development of molecular biological tools and high-throughput sequencing technology, many scientists are attempting to develop environmentally friendly pest management strategies. These include RNAi or gene editing-based pesticides that downregulate or silence genes (molecular targets), such as olfactory genes involved in searching behavior, in various insect pests. To adapt these strategies for Oriental fruit fly control, effective methods for functional gene research are needed. Genes with critical functions in the survival and reproduction of B. dorsalis serve as good molecular targets for gene knockdown and/or silencing. The CRISPR/Cas9 system is a reliable technique used for gene editing, especially in insects. This paper presents a systematic method for CRISPR/Cas9 mutagenesis of B. dorsalis, including the design and synthesis of guide RNAs, collecting embryos, embryo injection, insect rearing, and mutant screening. These protocols will serve as a useful guide for generating mutant flies for researchers interested in functional gene studies in B. dorsalis.

Protocols for CRISPR/Cas9 Mutagenesis of the Oriental Fruit Fly Bactrocera dorsalis

This paper presents the step-by-step protocols for CRISPR/Cas9 mutagenesis of the Oriental fruit fly Bactrocera dorsalis. Detailed steps provided by this standardized protocol will serve as a useful guide for generating mutant flies for functional gene studies in B. dorsalis.

동양 초파리 박트로세라 등쪽의 CRISPR/Cas9 돌연변이 유발에 대한 프로토콜

The Oriental fruit fly, Bactrocera dorsalis, is a highly invasive and adaptive pest species that causes damage to citrus and over 150 other fruit crops ...