Name: fruit volatile analysis using an electronic nose
Uploaded: 2012-03-30T13:00:00
Duration: 11 min 2 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fruit Volatile Analysis Using an Electronic Nose at JoVE.com

Forfatterne takker Bill klarer (Harris Moran Seed Company, Davis) for å gi melon frukt for denne analysen. Dette prosjektet er støttet av Spesialist Avlinger Research Initiative Competitive Grants-programmet gir nei. 2009-51181-05783 fra USDA National Institute of Food and Agriculture.

1. Prøvepreparering <ol><li> Harvests frukter på ønsket utviklingsstadium. Skyll med vann fra springen for å fjerne skitt og støv. </li><li> Velg frukt for analyse basert på fravær av eksterne og interne feil, og størrelsen homogenitet. </li><li> Skjær frukt i lengderetningen i båter som skal benyttes for volatile prøvetaking. Hvis det er aktuelt, fjerner hud, frø, frø hulrom vev, eller grop. Frukt vev utvalget må være konsekvent gjennom hele eksperimentet og ta hensyn til variasjonen innenfor en enkelt frukt (dvs. få prøve like fra ekvator, blomstre og stem end deler). </li><li> Kombiner den valgte frukt vev, bland det i orden å randomisere den, og deretter veie ut 200 g i en blender. </li><li> Tilsett 200 ml av mettet CaCl 2 oppløsning (372.5 g ved 20 ° C, i 500 ml avionisert vann) og 50 mL av en 100 mm løsning av 2-methylbutyl isovalerate i metanol. Den CaCl 2 er ment å fungere som en hemmer av enzymatisk activitet, som kan forekomme etter klipping og homogenisere frukten kjøtt. 2-Methylbutyl isovalerate legges til som en intern standard for å overvåke eventuelle tap av flyktige forbindelser i løpet av homogenisering prosessen. </li><li> Homogenisere blandingen i et laboratorium blender (Waring, USA), i 30 sekunder på 18.000 rpm, deretter umiddelbart helles i glass flaske og forsegling med Teflon lokk. Hold homogenat i flasken ved romtemperatur før alle prøvene er forberedt. </li><li> Etter å helle homogenat i flasken, vente i 10 minutter for å tillate utskilling av skum fra væsken, og pipetter 5 ml alikvoter av væske, uten skum, i 20 ml glass rav ampuller og forsegle hetteglassene med stål skrukorker utstyrt med Teflon / silikon septa. Denne prosedyren er egnet for melon og pære homogenat forberedelse. Hvis andre frukter brukes til analysen, kan en sentrifugering skritt være nødvendig. Derfor, fjern skummet og deretter sentrifuger væsken til pelletskaminer partikler som kanhindrer pipette. Forbered minst tre ampuller per prøve å tjene som teknisk replikater. </li><li> På dette punktet kan prøvene analyseres umiddelbart eller flash-frosset i flytende nitrogen og lagret ved ultra-lav temperatur (-80 ° C) for senere analyse. </li><li> For frosne prøver, på analyse dagen fjerne prøvene fra fryseren og la dem tine en time ved romtemperatur. Etter tining og før analyse, erstatte korken med en ny en som har en ren, tørr septum. Hvis septum ikke blir erstattet, kan vann kondensere på septum under tining bli trukket inn i instrumentet og skade den. </li></ol> 2. Gasskromatografi-Surface Acoustic Wave (GC-SAW) Set-up og Data Acquisition <ol><li> Legg i riktig analysemetode på zNose. For analyse av ester-rik volatile profilen melon, våre parametre i MicroSense versjon 5.44.22 programvare (Newbury Park, CA, USA) er som følger: headspace sug inninnløp i 20 sekunder ved 30 ml min -1 via pumpe; innløpstemperatur ved 200 ° C; Tenax felle temperatur på 225 ° C; bæregass (helium renhet 99.999%) flow rate på 2,9 ml min-1, kolonne (DB-5 kolonne, 1 m × 0,25 mm ID × 0,25 mikrometer tykkelse) temperatur program fra 45 ° C til 180 ° C med en hastighet på 10 ° C sek -1; sensor temperatur på 40 ° C; ventil på 165 ° C. Den totale analysen er 1 minutt per prøve. </li><li> Koble til en rustfritt stål nål med ikke-sentrere kjernen tips til zNose innløp og rense systemet flere ganger med uteluft til grunnlinjen er stabil og ingen topper større enn 200 Counts (Ct) blir oppdaget. </li><li> Still inn instrumentet med en løsning av rette kjetting alkaner (C6-C14). Låten Resultatet brukes av instrumentet programvare for å konvertere retensjonstiden av eluted toppene fra tidsenheter inn Kovats Index (KI) enheter. Følgelig, etter at systemet er innstilt, er oppholdstidene rapportert i KI enheter. </li&gt; <li> Før analysen, la utvalget til stabilisering i 30 minutter. For å analysere en av prøven hetteglass, stikker en nål inn i hetteglasset septum å avlaste trykket. Deretter setter nålen koblet til instrumentet innløp i hetteglasset septum og initiere headspace prøvetaking. Analyser minst tre teknisk replikater per prøve. </li><li> Manuell start instrumentet ved å klikke på &quot;Play&quot;-knappen, pumpen aktiveres og trekker damp presentere ovenfor prøven. På slutten av analysen, vises et kromatogram på skjermen, og sensoren automatisk varmes opp til 150 ° C i 10 sekunder for å rengjøre den. Når systemet status boksen knappen blir grønn igjen, er instrumentet klar til å analysere en ny prøve. </li><li> For å sikre en stabil baseline og riktig system rengjøring, kjøre minst en flybillett blank mellom hver prøve. For å overvåke for mulig flyktig forurensning fra hetteglasset og cap, analysere to hetteglass-blanks (tomme hetteglass med cap), i begynnelsen og slutten av dagen. &lt;/ Li&gt; </ol> 3. Dataeksport og analyse <ol><li> Eksportere data til en Microsoft Excel-fil etter oppkjøpet ved hjelp av &quot;Peak logging&quot;-funksjonen i MicroSense programvare. Når dataene er eksportert, legge til kolonner som inneholder etiketter for variabler og replikerer. </li><li> Forvandle dataformatet for enklere manipulering med Python (versjon 2.6, fritt tilgjengelig på nettet) script vi utviklet, kalt &quot;reform_data.py&quot; (se figur 1 for et eksempel på dataformatet før og etter bruk av skriptet &quot;reform_data. py &quot;). Navnet på kildefilen (xls-format) og ark navn for inndata, samt ønsket filnavn for utdata (xls-format), redigeres direkte i skriptet. </li><li> Start &quot;kim_interface.py&quot; (også skrevet i Python 2.6, se figur 2), og importere data fra filen genereres i forrige trinn. Spesielt er analysen basert på visning og analysere antall ganger hver KI verdi ble påvist(&quot;Ki hits&quot;). Dermed programmet viser et søylediagram av ki treff for hver KI verdi. </li><li> Evaluere KI treff i spesifikke undergrupper av prøver, analysere hver gruppe av teknisk replikat sammen. For å gjøre dette, analysere hver behandling eller variabel separat ved å sjekke / fjerne merkingen de tilsvarende boksene. Se figur 2 bildetekst for detaljert beskrivelse av det grafiske brukergrensesnittet (GUI) funksjoner. </li><li> Etter å identifisere bredden på hver KI vinduet med GUI, tilfeldig velge noen av de tilsvarende kromatogrammer i Microsense software og vurdere overlappende topper blant de teknisk replikatene. Se Figur 3 for et eksempel på overtrukket kromatogrammer av to tekniske replikater. </li><li> Når KI vinduet er individuated, bruk &#39;Merge &quot;-funksjonen tilgjengelig i GUI å flette KIS som faller i vinduet, inn i den mest befolkede KI. Ved å bruke denne funksjonen, er topper merket med en rekke KI verdier samlet på én KI etikett, allowing behandle slike topper som en enkelt variabel. For å gjøre dette, klikker du først på &quot;Flett&quot;-knappen for å aktivere funksjonen, og velg den mest befolkede KI som sentrum av vinduet ved å venstreklikke tilsvarende bar. Når baren er valgt, endrer den farge og blir grønt. For å flette KIS som faller innenfor vinduet i det valgte KI, høyreklikk på de tilsvarende linjene, dette fører til at barene å bli rød, mens en blå bar av tilsvarende lengde legges på toppen av den sentrale KI (Se figur 4 ). Når alle de valgte KIS har blitt fusjonert inn i riktig sentrale KI, klikk på &quot;Merge&quot;-knappen igjen for å godta endringene, dette fører til at &quot;Flett&quot;-knappen for å gulne. I tilfelle av feil, er &quot;Unmerge&quot;-knappen også tilgjengelig. Til unmerge, klikker du Unmerge &quot;-knappen i GUI, og deretter høyreklikker du på den røde linjen du ønsker å unmerge. Fra rødt, blir stolpen blå. Klikk på &#39;Unmerge &quot;knappen igjen for å godta endringene. </li><li> Hvis man forsøker å incorrectly fusjonere to topper i en enkelt prøve i ett KI verdi, er en feilmelding skrives ut. I slike tilfeller nøye sjekk kromatogrammet og redefinere KI vinduet i denne regionen. </li><li> Når alle de fusjonerende operasjoner har blitt utført, lagrer du filen. </li><li> Før du fortsetter med statistisk analyse, er kromatogrammer i luften og hetteglasset blanks analyseres for å overvåke for mulige forurensinger. Når KI av toppene i de tomme feltene har blitt identifisert, trekker området til toppen oppdaget i luft-og / eller hetteglass-blank fra det området av topp stede i prøven. Deretter fortsetter med statistisk analyse. </li></ol> 4. Representative Resultater Den elektroniske nesen var i stand til å oppdage forskjeller i flyktige profiler blant melon frukt høstet på ulike forfall stadier (figur 5). Tjue KI vinduene ble identifisert på tvers av alle prøvene. En variansanalyse viste at 14 topper Detected av elektronisk nese varierte betydelig mellom modenhet etapper. I figur 6, er loggen over de gjennomsnittlige peak områdene disse 14 komponentene planla å vise forskjeller i peak hopetall mellom to forfall etapper, tidlig modne og fullt moden frukt. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/3821/3821fig1.jpg" /> Figur 1. Eksempler på data format eksportert fra instrument programvare (A) og etter transformasjon, utført ved hjelp av &quot;reform_data.py&quot; script (B). For å lette datamanipulasjon og analyse, er alle de unike KIS identifisert på tvers av alle prøvene, så dataene er omorganisert med prøven informasjon i rader og topp området i kolonner, tilsvarende unike KIS. Hvis en topp ikke blir oppdaget i en KI verdi i en prøve, forblir den tilsvarende cellen tom. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/3821/3821fig2.jpg" /> Figur 2. Skjermbilde fra Skriftenet file &quot;kim_interface.py&quot;. Plottet i sentrum viser antall treff pr KI versus KI. «Hit per KI &#39;er antall prøver der en topp med den spesifikke KI ble oppdaget. På venstre side er det tre gule bokser som kontrollerer de valgte dataene. De viser parametere for å dele datasettet (behandlinger, gjentak, kvalitative variabler, etc.). I denne figuren, er de (fra øverst til nederst): Variety, Planting dato og utviklingsstadium ved høsting. På bunn: ved å klikke på de 3 barer og flytte den blå linjen til venstre eller til høyre, kan man velge minimum og maksimum verdi av KI rekkevidde, og minimum peak området (&#39;Threshold &quot;). På høyre: den &quot;Merge&quot;-knappen lar sammenslåing utvalgte KIS ved manuelt å klikke på barer i plottet. The &#39;Unmerge-knappen gjør det mulig å reversere prosessen for utvalgte saker. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/3821/3821fig3.jpg" /> Figur 3. Overtrukket kromatogrammer (i<html> svart og rød) av to teknisk replikat fra melon volatile headspace å illustrere et skifte i oppholdstid. <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/3821/3821fig4.jpg" /> Figur 4. Eksempel på KI sammenslåing prosedyren. I den sentrale tomten, representerer den grønne linjen (Central KI) den mest befolkede KI, som har blitt valgt som sentrum i KI vinduet. KI X og KI Y er KIS faller i vinduet av interesse og de trenger å bli fusjonert inn i sentrale KI. Ved å høyreklikke på KI X-bar, blir det rødt, og på samme tid, vises det en blå bar med samme lengde på KI X-bar, på toppen av den grønne. Ved å gjenta samme prosedyre for KI Y, lengden på den blå linjen (Innfusjonerte KIS) vil øke av tilsvarende lengde. Når alle KIS har blitt lagt til, ved å klikke på den grønne &quot;Merge&quot;-knappen, de fusjonerende prosessen avsluttes, lagres endringene, og knappen fargen blir gul. / Files/ftp_upload/3821/3821fig5.jpg &quot;/&gt; Figur 5. To kromatogrammer av melon prøver høstet på forskjellig modenhet stadier, tidlig moden (øverst) og fullmoden (nederst), for å illustrere muligheten for elektronisk nese til å oppdage forskjeller i flyktige hopetall. <img alt="Figur 6" src="/files/ftp_upload/3821/3821fig6.jpg" /> Figur 6. Radar plott som viser toppen område av 14 komponenter som finnes i to melon prøver på to forskjellige forfall stadier, tidlig modne og fullt moden. The Peak områdene er rapportert i logskalaen å hjelpe visualisere sammenligning. Tallene ved utgangen av hvert ray representerer de tilsvarende Kovats indeksene.

<ol>
	<li>Kader, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flavor+quality+of+fruits+and+vegetables.">Flavor quality of fruits and vegetables.</a> Journal of the Science of Food and Agriculture. 88, 1863-1868 (2008).</li><li>Persaud, K., Dodd, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+discriminant+mechanisms+in+the+mammalian+olfactory+system+using+a+model+nose.">Analysis of discriminant mechanisms in the mammalian olfactory system using a model nose.</a> Nature. 299, 352-355 (1982).</li><li>Gardner, J. W., Bartlett, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+brief-history+of+electronic+noses.">A brief-history of electronic noses.</a> Sensors and Actuators. 18, 211-220 (1994).</li><li>Rock, F., Barsan, N., Weimar, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electronic+nose:+Current+status+and+future+trends.">Electronic nose: Current status and future trends.</a> Chem. Rev. 108, 705-725 (2008).</li><li>Li, C., Heinemann, P. H., Irudayaraj, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+apple+deterioration+using+an+electronic+nose+and+zNose.">Detection of apple deterioration using an electronic nose and zNose.</a> Transactions of the Asabe. 50, 1417-1425 (2007).</li><li>Li, Z. F., Wang, N., Raghavan, G. S. V., Vigneault, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ripeness+and+rot+evaluation+of+'Tommy+Atkins'+mango+fruit+through+volatiles+detection.">Ripeness and rot evaluation of 'Tommy Atkins' mango fruit through volatiles detection.</a> J. Food Eng. 91, 319-324 (2009).</li><li>Oh, S. Y., Ko, J. W., Jeong, S. Y., Hong, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+and+exploration+of+fast+gas+chromatography-surface+acoustic+wave+sensor+to+the+analysis+of+thymus+species.">Application and exploration of fast gas chromatography-surface acoustic wave sensor to the analysis of thymus species.</a> J. Chromatogr. A. 1205, 117-127 (2008).</li><li>Watkins, P., Wijesundera, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+zNose+for+the+analysis+of+selected+grape+aroma+compounds.">Application of zNose for the analysis of selected grape aroma compounds.</a> Talanta. 70, 595-601 (2006).</li><li>Gan, H. L., Man, Y. B. C., Tan, C. P., NorAini, I., Nazimah, S. A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+vegetable+oils+by+surface+acoustic+wave+sensing+electronic+nose.">Characterisation of vegetable oils by surface acoustic wave sensing electronic nose.</a> Food Chem. 89, 507-518 (2005).</li><li>Marina, A. M., Man, Y. B. C., Amin, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+the+SAW+Sensor+Electronic+Nose+for+Detecting+the+Adulteration+of+Virgin+Coconut+Oil+with+RBD+Palm+Kernel+Olein.">Use of the SAW Sensor Electronic Nose for Detecting the Adulteration of Virgin Coconut Oil with RBD Palm Kernel Olein.</a> Journal of the American Oil Chemists Society. 87, 263-270 (2010).</li><li>Evans, M. B., Haken, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+developments+in+the+gas-chromatographic+index+scheme.">Recent developments in the gas-chromatographic index scheme.</a> Journal of Chromatography. 472, 93-127 (1989).</li></ol>

Vi har ingenting å avsløre.

Elektroniske neser representerer en lovende metode for rask, objektiv vurdering av aroma profiler fra frukt eller flyktige-rike prøver. Men skifter i oppholdstid representere en utfordring for topp identifisering og kan føre til feiltolking av data når to kromatogrammer ikke er perfekt justert. Visuell inspeksjon av kromatogrammer indikerte at variasjonen av oppholdstid mellom prøvene ofte forårsaket den samme toppen som skal merkes med litt andre KI verdier (ca ± 10). Dette oversettes til en overdrevet antall unike KIS oppdaget. For å dra nytte av de fakta som (a) ulike forbindelser er tilstede på ulike forfall stadier og (b) teknisk gjentak er omtrent identiske, to PC-baserte skript (&quot;kim_merge.py&quot;, som inneholder rutiner for håndtering av data set, og &quot;kim_interface.py&quot;, som gir et grafisk brukergrensesnitt (GUI)) ble utviklet for å systematisksammenligne prøvene på en semi-automatisert måte, noe som reduserer tiden som trengs for kromatogram analyse av store datasett. Disse programmene la konsolidering, eventuelt av topper merket med en rekke KI verdier under ett KI etikett. Dette tjener to viktige formål: (a) det muliggjør en statistisk analyse for å behandle slike topper som en enkelt variabel, og (b) det letter topp identifisering og sammenligning med andre systemer og publiserte verdier. Resultatene som presenteres her indikerer at melon prøvene kunne diskrimineres basert på modenhet og aroma profilering bruke zNose system i kombinasjon med tilstrekkelig KI identifikasjon. Dette representerer en lovende ny teknologi for analyse av flyktige som kan benyttes for kvalitetskontrollprogrammer.

<table border="1"><tbody><tr><td> Navn på reagensen </td><td> Firma </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentarer </td></tr><tr><td> Kalsiumklorid </td><td> MP Biomedisinsk </td><td> 195088 </td><td></td></tr><tr><td> 2-Methylbutyl isovalerate </td><td> SAFC Global </td><td> W350613 </td><td> ≥ 98%, naturlig, FCC </td></tr><tr><td> Metanol </td><td> Fisher Scientific </td><td> A411-4 </td><td></td></tr><tr><td> Hetteglass </td><td> Sigma / Supelco </td><td> SU860098 </td><td></td></tr><tr><td> Lue </td><td> Sigma / Supelco </td><td> SU860101 </td><td></td></tr><tr><td> Laboratory blender </td><td> Waring Laboratory Science </td><td> 7009G </td><td> 2-trinns blender; 1 - liter glassbeholder </td></tr><tr><td> Flaske </td><td> Fisher Scientific </td><td> 06-414-1C </td><td> Pyrex, 500 ml, polypropylen plug-forsegling </td></tr><tr><td> Needle </td><td> Elektronisk Sensor Technology </td><td> TLC101046 </td><td> Side hull luer </td></tr><tr><td> Alkaner løsning </td><td> Elektronisk Sensor Technology </td><td></td><td> C6-C14 alkaner løsning i metanol </td></tr><tr><td> zNose </td><td> Elektronisk Sensor Technology </td><td> Model 4500 </td><td></td></tr><tr><td> DB-5 GC kolonne </td><td> Elektronisk Sensor Technology </td><td> SYS4500C5 </td><td></td></tr><tr><td> MicroSense </td><td> Elektronisk Sensor Technology </td><td> Versjon 5.44.22 </td><td></td></tr><tr><td> Python 2.6 </td><td></td><td></td><td> Fritt tilgjengelig på nettet </td></tr><tr><td> &quot;Reform_data.py&quot; og &quot;kim_interface.py&quot; scripts</td><td></td><td></td><td> Skript tilgjengelig som supplerende materiale på Jove </td></tr></tbody></table>

fruit volatile analysis using an electronic nose

Tallrike og diverse fysiologiske endringer forekomme under frukt modning, herunder utvikling av en bestemt flyktig blanding som karakteriserer frukt aroma. Forfall ved høsting er en av de viktigste faktorene som påvirker smaken kvaliteten på frukt og grønnsaker 1. Validering av robuste metoder som raskt vurderer frukt modenhet og aroma kvalitet ville tillate bedre forvaltning av avanserte avlsprogram, produksjon praksis og Kombinasjonen av håndtering. Over de siste tre tiårene har mye forskning vært gjennomført for å utvikle såkalte elektroniske neser, som er enheter i stand til å raskt oppdage lukt og smaker 2-4. Foreløpig er det flere kommersielt tilgjengelige elektroniske neser i stand til å utføre volatile analyse, basert på ulike teknologier. Den elektroniske nesen brukes i vårt arbeid (zNose, EST, Newbury Park, CA, USA), består av ultra-rask gasskromatografi kombinert med en overflate akustisk bølge sensor (UFGC-SAW). Denne teknologien har allerede blitt testet for sin evne til å overvåke kvaliteten på ulike råvarer, deriblant deteksjon av forverring i eple 5, modenhet og råte evaluering i mango 6, aroma profilering av thymus arter 7; C 6 flyktige forbindelser i drue bær 8; karakterisering av vegetabilsk olje 9 og påvisning av adulterants i virgin kokosolje 10. Dette systemet kan utføre de tre store skritt av aroma analyse: headspace prøvetaking, separasjon av flyktige forbindelser, og gjenkjenning. I omtrent ett minutt, vil effekten, et kromatogram, produsert og etter en sletting syklus, er instrumentet klar for videre analyse. Resultatene er oppnådd med zNose kan sammenlignes med de andre gass-kromatografisk systemer ved beregning av Kovats Indekser (KI). Når apparatet er innstilt med en alkane standard løsning, er oppholdstidene automatisk konvertert tilKIS. Det er imidlertid små endringer i temperatur og strømningshastighet forventes å skje over tid, forårsaker retensjonstider å drive. Også avhengig av polariteten på kolonnen stasjonære fasen, kan reproduserbarheten av KI beregninger variere med flere indeks enheter 11. En rekke programmer og grafiske grensesnitt ble derfor utviklet for å sammenligne beregnede KIS blant prøvene i en semi-automatisert måte. Disse programmene redusere tiden som kreves for kromatogram analyse av store datasett og færrest mulig feiltolking av data når kromatogrammer ikke er perfekt justert. Vi presenterer en metode for rask volatile sammensatte analyse i frukt. Prøveopparbeidelse, datainnsamling og håndtering prosedyrer blir også diskutert.

Watch this Scientific Journal Video about Fruit Volatile Analysis Using an Electronic Nose at JoVE.com

Fruit Volatile Analysis Using an Electronic Nose

En rask metode for volatile sammensatte analyse i frukt er beskrevet. De flyktige forbindelser til stede i frivolum en homogenat av utvalget raskt skilles ut og oppdaget med ultrarask gasskromatografi (GC) kombinert med en Surface Acoustic Wave (SAW) sensor. En prosedyre for datahåndtering og analyse er også diskutert.

Frukt Volatile Analysis Bruke en elektronisk nese

Numerous and diverse physiological changes occur during fruit ripening, including the development of a specific volatile blend that characterizes fruit ...

fruit-volatile-analysis-using-an-electronic-nose

Research

JoVE Journal

Biology

Studying Aggression in Drosophila (fruit flies)

Aggression is an innate behavior that evolved in the framework of defending or obtaining resources. This complex social behavior is influenced by genetic, hormonal and environmental factors. In many organisms, aggression is critical to survival but controlling and suppressing aggression in distinct contexts also has become increasingly important. In recent years, invertebrates have become increasingly useful as model systems for investigating the genetic and systems biological basis of complex social behavior. This is in part due to the diverse repertoire of behaviors exhibited by these organisms. In the accompanying video, we outline a method for analyzing aggression in Drosophila whose design encompasses important eco-ethological constraints. Details include steps for: making a fighting chamber; isolating and painting flies; adding flies to the fight chamber; and video taping fights. This approach is currently being used to identify candidate genes important in aggression and in elaborating the neuronal circuitry that underlies the output of aggression and other social behaviors.

Studying Aggression in Drosophila fruit flies

Aggression is an innate behavior that evolved in the framework of defending or obtaining resources.  This complex social behavior is influenced by ...

Homemade Site Directed Mutagenesis of Whole Plasmids

Site directed mutagenesis of whole plasmids is a simple way to create slightly different variations of an original plasmid. With this method the cloned target gene can be altered by substitution, deletion or insertion of a few bases directly into a plasmid. It works by simply amplifying the whole plasmid, in a non PCR-based thermocycling reaction. During the reaction mutagenic primers, carrying the desired mutation, are integrated into the newly synthesized plasmid. In this video tutorial we demonstrate an easy and cost effective way to introduce base substitutions into a plasmid. The protocol works with standard reagents and is independent from commercial kits, which often are very expensive. Applying this protocol can reduce the total cost of a reaction to an eighth of what it costs using some of the commercial kits. In this video we also comment on critical steps during the process and give detailed instructions on how to design the mutagenic primers.

Site directed mutagenesis of whole plasmids is a simple way to create slightly different variations of an original plasmid. Here we demonstrate an easy and cost effective way to introduce base substitutions into a plasmid using standard reagents.

Site directed mutagenesis of whole plasmids is a simple way to create slightly different variations of an original plasmid. With this method the cloned ...

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing measurement of multiple cellular phenotypes within a single assay. In this study, we utilized HCA to develop a novel assay for neurotoxicity. Neurotoxicity assessment represents an important part of drug safety evaluation, as well as being a significant focus of environmental protection efforts. Additionally, neurotoxicity is also a well-accepted in vitro marker of the development of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's and Parkinson's diseases. Recently, the application of HCA to neuronal screening has been reported. By labeling neuronal cells with &beta;III-tubulin, HCA assays can provide high-throughput, non-subjective, quantitative measurements of parameters such as neuronal number, neurite count and neurite length, all of which can indicate neurotoxic effects. However, the role of astrocytes remains unexplored in these models. Astrocytes have an integral role in the maintenance of central nervous system (CNS) homeostasis, and are associated with both neuroprotection and neurodegradation when they are activated in response to toxic substances or disease states. GFAP is an intermediate filament protein expressed predominantly in the astrocytes of the CNS. Astrocytic activation (gliosis) leads to the upregulation of GFAP, commonly accompanied by astrocyte proliferation and hypertrophy. This process of reactive gliosis has been proposed as an early marker of damage to the nervous system. The traditional method for GFAP quantitation is by immunoassay. This approach is limited by an inability to provide information on cellular localization, morphology and cell number. We determined that HCA could be used to overcome these limitations and to simultaneously measure multiple features associated with gliosis - changes in GFAP expression, astrocyte hypertrophy, and astrocyte proliferation - within a single assay. In co-culture studies, astrocytes have been shown to protect neurons against several types of toxic insult and to critically influence neuronal survival. Recent studies have suggested that the use of astrocytes in an in vitro neurotoxicity test system may prove more relevant to human CNS structure and function than neuronal cells alone. Accordingly, we have developed an HCA assay for co-culture of neurons and astrocytes, comprised of protocols and validated, target-specific detection reagents for profiling &beta;III-tubulin and glial fibrillary acidic protein (GFAP). This assay enables simultaneous analysis of neurotoxicity, neurite outgrowth, gliosis, neuronal and astrocytic morphology and neuronal and astrocytic development in a wide variety of cellular models, representing a novel, non-subjective, high-throughput assay for neurotoxicity assessment. The assay holds great potential for enhanced detection of neurotoxicity and improved productivity in neuroscience research and drug discovery.

This article describes a novel protocol and reagent set designed for sensitive measurement of neurotoxic effects of compounds and treatments on co-cultures of neurons and astrocytes using high content analysis. Results demonstrate that high content analysis represents an exciting novel technology for neurotoxicity assessment.

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

An Optimized Protocol for Rearing Fopius arisanus, a Parasitoid of Tephritid Fruit Flies

Fopius arisanus (Sonan) is an important parasitoid of Tephritid fruit flies for at least two reasons. First, it is the one of only three opiine parasitoids known to infect the host during the egg stage1. Second, it has a wide range of potential fruit fly hosts. Perhaps due to its life history, F. arisanus has been a successfully used for biological control of fruit flies in multiple tropical regions2-4. One impediment to the wide use of F. arisanus for fruit fly control is that it is difficult to establish a stable laboratory colony5-9. Despite this difficulty, in the 1990s USDA researchers developed a reliable method to maintain laboratory populations of F. arisanus10-12. There is significant interest in F. arisanus biology13,14, especially regarding its ability to colonize a wide variety of Tephritid hosts14-17; interest is especially driven by the alarming spread of Bactrocera fruit fly pests to new continents in the last decade18. Further research on F. arisanus and additional deployments of this species as a biological control agent will benefit from optimizations and improvements of rearing methods. In this protocol and associated video article we describe an optimized method for rearing F. arisanus based on a previously described approach12. The method we describe here allows rearing of F. arisanus in a small scale without the use of fruit, using materials available in tropical regions around the world and with relatively low manual labor requirements.

An Optimized Protocol for Rearing Fopius arisanus, a Parasitoid of Tephritid Fruit Flies

Fopius arisanus is an egg-larval parasitoid of Tephritid fruit flies that is successfully used in biological control of these important tropical pests. We describe here an optimized protocol for rearing F. arisanus on a small scale using readily available materials.

Fopius arisanus (Sonan) is an important parasitoid of Tephritid fruit flies for at least two reasons. First, it is the one of only three opiine ...

Isolation and Biophysical Study of Fruit Cuticles

The cuticle, a hydrophobic protective layer on the aerial parts of terrestrial plants, functions as a versatile defensive barrier to various biotic and abiotic stresses and also regulates water flow from the external environment.1 A biopolyester (cutin) and long-chain fatty acids (waxes) form the principal structural framework of the cuticle; the functional integrity of the cuticular layer depends on the outer 'epicuticular' layer as well as the blend consisting of the cutin biopolymer and 'intracuticular' waxes.2 Herein, we describe a comprehensive protocol to extract waxes exhaustively from commercial tomato (Solanum lycopersicum) fruit cuticles or to remove epicuticular and intracuticular waxes sequentially and selectively from the cuticle composite. The method of Jetter and Sch&auml;ffer (2001) was adapted for the stepwise extraction of epicuticular and intracuticular waxes from the fruit cuticle.3,4 To monitor the process of sequential wax removal, solid-state cross-polarization magic-angle-spinning (CPMAS) 13C NMR spectroscopy was used in parallel with atomic force microscopy (AFM), providing molecular-level structural profiles of the bulk materials complemented by information on the microscale topography and roughness of the cuticular surfaces. To evaluate the cross-linking capabilities of dewaxed cuticles from cultivated wild-type and single-gene mutant tomato fruits, MAS 13C NMR was used to compare the relative proportions of oxygenated aliphatic (CHO and CH2O) chemical moieties.
Exhaustive dewaxing by stepwise Soxhlet extraction with a panel of solvents of varying polarity provides an effective means to isolate wax moieties based on the hydrophobic characteristics of their aliphatic and aromatic constituents, while preserving the chemical structure of the cutin biopolyester. The mechanical extraction of epicuticular waxes and selective removal of intracuticular waxes, when monitored by complementary physical methodologies, provides an unprecedented means to investigate the cuticle assembly: this approach reveals the supramolecular organization and structural integration of various types of waxes, the architecture of the cutin-wax matrix, and the chemical composition of each constituent. In addition, solid-state 13C NMR reveals differences in the relative numbers of CHO and CH2O chemical moieties for wild-type and mutant red ripe tomato fruits. The NMR techniques offer exceptional tools to fingerprint the molecular structure of cuticular materials that are insoluble, amorphous, and chemically heterogeneous. As a noninvasive surface-selective imaging technique, AFM furnishes an effective and direct means to probe the structural organization of the cuticular assembly on the nm-&mu;m length scale.

Aerial plant organs are protected by the cuticle, a supramolecular biopolyester-wax assembly. We present protocols to monitor selective removal of epi- and intracuticular waxes from tomato fruit cuticles on molecular and micro scales by solid-state NMR and atomic force microscopy, respectively, and to assess the cross-linking capacity of engineered cuticular biopolyesters.

Isolering og Biofysikalsk Study of Fruit neglebåndene

The cuticle, a hydrophobic protective layer on the aerial parts of terrestrial plants, functions as a versatile defensive barrier to various biotic and ...

Analysis of SNARE-mediated Membrane Fusion Using an Enzymatic Cell Fusion Assay

The interactions of SNARE (soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor) proteins on vesicles (v-SNAREs) and on target membranes (t-SNAREs) catalyze intracellular vesicle fusion1-4. Reconstitution assays are essential for dissecting the mechanism and regulation of SNARE-mediated membrane fusion5. In a cell fusion assay6,7, SNARE proteins are expressed ectopically at the cell surface. These "flipped" SNARE proteins drive cell-cell fusion, demonstrating that SNAREs are sufficient to fuse cellular membranes. Because the cell fusion assay is based on microscopic analysis, it is less efficient when used to analyze multiple v- and t-SNARE interactions quantitatively.
Here we describe a new assay8 that quantifies SNARE-mediated cell fusion events by activated expression of &beta;-galactosidase. Two components of the Tet-Off gene expression system9 are used as a readout system: the tetracycline-controlled transactivator (tTA) and a reporter plasmid that encodes the LacZ gene under control of the tetracycline-response element (TRE-LacZ). We transfect tTA into COS-7 cells that express flipped v-SNARE proteins at the cell surface (v-cells) and transfect TRE-LacZ into COS-7 cells that express flipped t-SNARE proteins at the cell surface (t-cells). SNARE-dependent fusion of the v- and t-cells results in the binding of tTA to TRE, the transcriptional activation of LacZ and expression of &beta;-galactosidase. The activity of &beta;-galactosidase is quantified using a colorimetric method by absorbance at 420 nm.
The vesicle-associated membrane proteins (VAMPs) are v-SNAREs that reside in various post-Golgi vesicular compartments10-15. By expressing VAMPs 1, 3, 4, 5, 7 and 8 at the same level, we compare their membrane fusion activities using the enzymatic cell fusion assay. Based on spectrometric measurement, this assay offers a quantitative approach for analyzing SNARE-mediated membrane fusion and for high-throughput studies.

We have developed a cell fusion assay that quantifies SNARE-mediated membrane fusion events by activated expression of &beta;-galactosidase.

Analyse av snare-mediert membran fusion Bruke en Enzymatisk Cell Fusion Assay

The interactions of SNARE (soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor)  proteins on vesicles (v-SNAREs) and on target membranes ...

Laboratory Protocol for Genetic Gut Content Analyses of Aquatic Macroinvertebrates Using Group-specific rDNA Primers

Analyzing food webs is essential for a better understanding of ecosystems. For example, food web interactions can undergo severe changes caused by the invasion of non-indigenous species. However, an exact identification of field predator-prey interactions is difficult in many cases. These analyses are often based on a visual evaluation of gut content or the analysis of stable isotope ratios (&#948;15N and &#948;13C). Such methods require comprehensive knowledge about, respectively, morphologic diversity or isotopic signature from individual prey organisms, leading to obstacles in the exact identification of prey organisms. Visual gut content analyses especially underestimate soft bodied prey organisms, because maceration, ingestion and digestion of prey organisms make identification of specific species difficult. Hence, polymerase chain reaction (PCR) based strategies, for example the use of group-specific primer sets, provide a powerful tool for the investigation of food web interactions. Here, we describe detailed protocols to investigate the gut contents of macroinvertebrate consumers from the field using group-specific primer sets for nuclear ribosomal deoxyribonucleic acid (rDNA). DNA can be extracted either from whole specimens (in the case of small taxa) or out of gut contents of specimens collected in the field. Presence and functional efficiency of the DNA templates need to be confirmed directly from the tested individual using universal primer sets targeting the respective subunit of DNA. We also demonstrate that consumed prey can be determined further down to species level via PCR with unmodified group-specific primers combined with subsequent single strand conformation polymorphism (SSCP) analyses using polyacrylamide gels. Furthermore, we show that the use of different fluorescent dyes as labels enables parallel screening for DNA fragments of different prey groups from multiple gut content samples via automated fragment analysis.

Most common gut content analyses of macroinvertebrates are visual. Requiring intense knowledge about morphological diversity of prey organisms, they miss soft bodied prey and, due to strong comminution of prey, are nearly impossible for some organisms, including amphipods. We provide detailed, novel genetic approaches for macroinvertebrate prey identification in the diet of amphipods.

Laboratoriet protokoll for genetisk Gut innhold analyser av akvatiske Macroinvertebrates bruke gruppe-spesifikke rDNA primere

Analyzing food webs is essential for a better understanding of ecosystems. For example, food web interactions can undergo severe changes caused by the ...

Simple Homemade Tools to Handle Fruit Flies&#8212;Drosophila melanogaster

The fruit fly, Drosophila melanogaster, is widely used both in biological research and biology education. Handling adult flies is common but difficult in practice, as adult flies fly. Demonstrated here is how to make some simple and cost-effective tools to address difficult issues in the handling of Drosophila. Holes in foam stoppers are made and pipette tips or funnels are inserted into the holes. Flies then move only in one direction into the pipette tip/funnel assemblage, allowing efficient control of the transfer of adult Drosophila into or out of a vial. Existing protocols have been modified for cool-anesthetizing flies by chilling in crushed ice and transferring them onto a cold, hard icepack surface. The icepack is covered with a piece of medical gauze that keeps immobilized flies from the condensed water when examined under a stereomicroscope. The flies are finally euthanized for counting and sorting or discarded by microwaving. A bottle-shaped cage has also been developed for collecting eggs, as well as a labor-saving device and accompanying protocol for cleaning glass culture vials.

Simple Homemade Tools to Handle Fruit Flies&amp;#8212;&lt;em&gt;Drosophila melanogaster&lt;/em&gt;

Described here is the use of several homemade tools to transfer, chill, and kill adult Drosophila, as well as to clean glass culture vials and collect eggs. These tools are easy to make and are rather efficient in handling Drosophila.

Enkle hjemmelagde verktøy for å håndtere Fruit fluer-Drosophila melanogaster

The fruit fly, Drosophila melanogaster, is widely used both in biological research and biology education. Handling adult flies is common but difficult in ...

Topical Application Bioassay to Quantify Insecticide Toxicity for Mosquitoes and Fruit Flies

The continued use of insecticides for public health and agriculture has led to widespread insecticide resistance and hampering of control methods. Insecticide resistance surveillance of mosquito populations is typically done through Centers for Disease Control and Prevention (CDC) bottle bioassays or World Health Organization (WHO) tube tests. However, these methods can result in a high degree of variability in mortality data due to variable insecticide contact with&#160;the insect, the relatively small numbers of organisms tested, extensive variation in mass between populations, and constantly changing environmental conditions, leading to variable outcomes. This paper presents the topical application bioassay, adapted as a high-throughput phenotypic bioassay for both mosquitoes and fruit flies, to test large numbers of insects along&#160;a range of insecticide concentrations.
This assay 1) ensures consistent treatment and insecticide contact with every organism, 2) produces highly specific dose-response curves that account for differences in average mass between strains and sexes (which is particularly important for field-collected organisms), and 3) allows for the calculation of statistically rigorous median lethal doses (LD50), which are necessary for resistance ratio comparisons-an alternative surveillance approach from diagnostic dose mortality, which is also used for larvicide resistance surveillance. This assay will be a complementary tool for accurately phenotyping mosquito populations and, as illustrated using fruit flies, is easily adaptable for use with other insects. We argue that this assay will help fill the gap between genotypic and phenotypic insecticide resistance in multiple insect species.

We describe the methodology and importance of the topical application bioassay to measure insecticide susceptibility in mosquitoes and fruit flies. The presented assay is high-throughput, utilizes insect mass-thus allowing for calculating a mass-relativized lethal dose instead of concentration-and likely has lower variability than other similar methods.

Aktuell anvendelse Bioassay å kvantifisere insektmiddel toksisitet for mygg og frukt fluer

The continued use of insecticides for public health and agriculture has led to widespread insecticide resistance and hampering of control methods. ...

Protocols for CRISPR/Cas9 Mutagenesis of the Oriental Fruit Fly Bactrocera dorsalis

The Oriental fruit fly, Bactrocera dorsalis, is a highly invasive and adaptive pest species that causes damage to citrus and over 150 other fruit crops worldwide. Since adult fruit flies have great flight capacity and females lay their eggs under the skins of fruit, insecticides requiring direct contact with the pest usually perform poorly in the field. With the development of molecular biological tools and high-throughput sequencing technology, many scientists are attempting to develop environmentally friendly pest management strategies. These include RNAi or gene editing-based pesticides that downregulate or silence genes (molecular targets), such as olfactory genes involved in searching behavior, in various insect pests. To adapt these strategies for Oriental fruit fly control, effective methods for functional gene research are needed. Genes with critical functions in the survival and reproduction of B. dorsalis serve as good molecular targets for gene knockdown and/or silencing. The CRISPR/Cas9 system is a reliable technique used for gene editing, especially in insects. This paper presents a systematic method for CRISPR/Cas9 mutagenesis of B. dorsalis, including the design and synthesis of guide RNAs, collecting embryos, embryo injection, insect rearing, and mutant screening. These protocols will serve as a useful guide for generating mutant flies for researchers interested in functional gene studies in B. dorsalis.

Protocols for CRISPR/Cas9 Mutagenesis of the Oriental Fruit Fly Bactrocera dorsalis

This paper presents the step-by-step protocols for CRISPR/Cas9 mutagenesis of the Oriental fruit fly Bactrocera dorsalis. Detailed steps provided by this standardized protocol will serve as a useful guide for generating mutant flies for functional gene studies in B. dorsalis.

Protokoller for CRISPR/Cas9 Mutagenese av orientalsk fruktflue Bactrocera dorsalis

The Oriental fruit fly, Bactrocera dorsalis, is a highly invasive and adaptive pest species that causes damage to citrus and over 150 other fruit crops ...