Name: fruit volatile analysis using an electronic nose
Uploaded: 2012-03-30T13:00:00
Duration: 11 min 2 s
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Os autores agradecem Bill Copes (Harris Seed Company Moran, Davis) para fornecimento de frutos de melão para esta análise. Este projecto é apoiado pelo Programa de Investigação de Culturas Especialidade Initiative Grants Competitiva conceder nenhum. 2009-51181-05783 do USDA National Institute of Food and Agriculture.

1. Preparação da Amostra <ol><li> Frutos da colheita na fase de maturidade desejado. Lavar com água da torneira, a fim de remover a sujidade e poeira. </li><li> Selecione frutos para análise com base na ausência de defeitos internos e externos, e homogeneidade de tamanho. </li><li> Cortar frutas longitudinalmente em fatias para ser usados ​​para a amostragem volátil. Se for o caso, retire a pele, sementes, tecidos da cavidade de sementes, ou cova. Seleção tecido de frutos deve ser consistente durante todo o experimento e ter em conta a variabilidade dentro de uma única fruta (isto é, obter amostra igualmente da flor, equatorial e peças finais tronco). </li><li> Combine o tecido de frutos selecionado, misturá-lo, a fim de embaralhar e pesar 200 g em um liquidificador. </li><li> Adicionar 200 mL de solução saturada de CaCl2 solução (372,5 g, a 20 ° C, em 500 mL de água desionizada) e 50 uL de uma solução 100 mM de 2-metilbutilo isovalerato em metanol. O 2 CaCl destina-se a actuar como um inibidor de ac enzimáticaca, que pode ocorrer após o corte e homogeneização da carne de fruta. 2-metilbutilo isovalerato é adicionado como um padrão interno para a monitorização de eventuais perdas de compostos voláteis durante o processo de homogeneização. </li><li> Homogeneizar mistura em um misturador de laboratório (Waring, EUA), durante 30 segundos a 18.000 rpm, em seguida, imediatamente verter em frasco de vidro e de vedação com a tampa de teflon. Manter o homogeneizado no frasco à temperatura ambiente, até que todas as amostras são preparadas. </li><li> Após o vazamento do homogenato dentro da garrafa, esperar 10 minutos para permitir a separação da espuma a partir do líquido, em seguida, de pipeta alíquotas de 5 ml de líquido, sem espuma, em 20 ml frascos de vidro âmbar e selar os frascos com tampas de rosca de aço equipado com Teflon / silicone septos. Este procedimento é adequado para a preparação melão e homogenato de pêra. Se outros frutos são usados ​​para a análise, um passo de centrifugação pode ser necessária. Portanto, remover a espuma e, em seguida, centrifugar o líquido para partículas de aglomerados que possamobstruir a pipeta. Preparar pelo menos três frascos por amostra para servir como técnica repetições. </li><li> Neste ponto, as amostras podem ser analisadas imediatamente ou flash-congelados em azoto líquido e armazenado a ultra-baixa temperatura (-80 ° C) para posterior análise. </li><li> Para amostras congeladas, no dia análise remover as amostras a partir do congelador e permitir-lhes a descongelar durante uma hora à temperatura ambiente. Após descongelação, e antes da análise, substituir a tampa do frasco com um novo que tem um septo, limpo e seco. Se o septo não é substituído, a água condensada sobre o septo durante o descongelamento pode ser arrastado para o instrumento e danificá-la. </li></ol> 2. Gas Chromatography onda acústica de superfície (SAW-GC) Set-up e Aquisição de Dados <ol><li> Carregar o método de análise apropriado na zNose. Para a análise do perfil de éster-rico volátil do melão, os nossos parâmetros na versão Microsense 5.44.22 software (Newbury Park, CA, EUA) são como segue: headspace de aspiração node entrada durante 20 segundos a 30 mL min -1 através da bomba; temperatura de entrada de 200 ° C; Tenax temperatura armadilha a 225 ° C, caudal de gás portador (pureza de hélio 99,999%) de 2,9 mL min-1; coluna (DB-5 coluna, 1 m × 0,25 milímetros ID programa de temperatura × 0,25 espessura da película mm) a partir de 45 ° C a 180 ° C a uma taxa de 10 ° C seg -1; válvula a 165 ° C; sensor de temperatura a 40 ° C O tempo de análise total é de 1 minuto por amostra. </li><li> Conectar uma agulha de aço inoxidável com não-coring ponta para a entrada zNose e purgar o sistema várias vezes com o ar ambiente até que a linha de base é estável e sem picos maiores do que 200 contagens (Ct) são detectados. </li><li> Ajustar o instrumento, utilizando uma solução de alcanos de cadeia linear (C6-C14). O resultado composição é utilizada pelo software do aparelho para converter o tempo de retenção dos picos eluídos a partir de unidades de tempo em Kovats Index (Kl) unidades. Por conseguinte, depois de o sistema é sintonizado, os tempos de retenção foram apresentados em unidades de KI. </li&gt; <li> Antes da análise, permitir que a amostra a equilibrar durante 30 minutos. Para analisar um dos frascos de amostra, inserir uma agulha no septo do frasco para aliviar a pressão. Em seguida, inserir a agulha ligada à entrada do instrumento para o septo do frasco e iniciar a amostragem headspace. Analise pelo menos três técnica repetições por amostra. </li><li> Iniciar manualmente o instrumento, clicando no botão &quot;Play&quot;, a ativação da bomba e retira os vapores apresentam acima da amostra. No final da análise, um cromatograma aparece no ecrã, e do sensor é automaticamente aquecida a 150 ° C durante 10 segundos para o limpar. Quando o sistema de botão de caixa de status fica verde novamente, o aparelho está pronto para analisar outra amostra. </li><li> Para garantir uma base estável e limpeza adequada do sistema, executar pelo menos um em branco ar entre cada amostra. Para monitorizar a contaminação possível volátil a partir do frasco ea tampa, analisar duas frasco de espaços em branco (frasco vazio com tampa), no início e no fim do dia. &lt;/ Li&gt; </ol> 3. Exportação de Dados e Análise <ol><li> Exportar os dados em um arquivo do Microsoft Excel após a aquisição utilizando o &quot;Peak registro&quot; em função Microsense software. Uma vez que os dados são exportados, adicionar colunas contendo rótulos para variáveis ​​e repetições. </li><li> Transformar o formato de dados para facilitar a manipulação usando o Python (versão 2.6; disponível gratuitamente on-line) script que desenvolvemos, com o nome &quot;reform_data.py&quot; (ver Figura 1 para um exemplo do formato de dados antes e depois de usar o script &quot;reform_data. py &quot;). O nome do arquivo de origem (formato xls) e nome da folha para os dados de entrada, bem como o nome do arquivo desejado para a saída (formato xls), são editados diretamente no script. </li><li> Iniciar &quot;kim_interface.py&quot; (também escrito em Python 2.6, ver Figura 2), e importar os dados do arquivo gerado no passo anterior. Especificamente, a análise baseia-se na visualização e analisando o número de vezes que cada valor de Ki foi detectado(&quot;Hits KI&quot;). Assim, o programa exibe um gráfico de barras de hits Ki para cada valor de KI. </li><li> Avaliar os hits KI de subconjuntos específicos de amostras, analisando cada grupo de técnicos replicado em conjunto. Para isso, analisar cada tratamento ou variável separadamente, marcando / desmarcando as caixas correspondentes. Ver legenda Figura 2 para uma descrição detalhada da interface gráfica do usuário (GUI) características. </li><li> Depois de identificar a largura de cada janela KI usando o GUI, escolher aleatoriamente alguns dos cromatogramas correspondentes em software Microsense e avaliar a sobreposição entre os picos do técnico repetições. Ver Figura 3 para um exemplo de cromatogramas sobrepostas de duas repetições técnica. </li><li> Quando a janela do KI é individuado, utilize o recurso &quot;mala direta&quot; disponível na GUI para mesclar as KIs que caem na janela, para o KI mais populosa. Ao usar esse recurso, os picos marcados com um intervalo de valores Ki são consolidadas em um único rótulo KI, allowing tratar esses picos como uma única variável. Para isso, primeiro clique no botão &#39;merge&#39; para ativar o recurso e selecione o KI mais populoso como o centro da janela ao clicar na barra correspondente. Uma vez que o bar tenha sido selecionado, ele muda de cor e ficar verde. Para mesclar os KIs que caem dentro da janela para o KI selecionado, botão direito do mouse sobre as barras correspondentes, o que faz com que as barras de vermelho, enquanto uma barra azul do comprimento correspondente é adicionado no topo do KI central (veja a Figura 4 ). Depois que todos os KIs selecionados foram incorporadas ao KI central adequado, clique no botão &#39;Mesclar&#39; novamente para aceitar as alterações, o que provoca o botão &quot;Mesclar&quot; a virar amarelo. Em caso de erros, o botão &#39;Separar &quot;também está disponível. Para desinstalar, clique no botão &quot;Separar&quot; no GUI, então botão direito do mouse sobre a barra vermelha que você deseja desinstalar. De vermelho, a barra fica azul. Clique no botão &quot;Separar&quot; botão novamente para aceitar as alterações. </li><li> Se alguém tenta incorrectly mesclar dois picos em uma única amostra em um valor único KI, uma mensagem de erro será impressa. Em tais circunstâncias, verificar rigorosamente o cromatograma e redefinir a janela de KI na região. </li><li> Depois de todas as operações de fusão foram realizados, salve o arquivo. </li><li> Antes de prosseguir com a análise estatística, os cromatogramas do ar e espaços em branco dos frascos são analisados ​​para monitorar possíveis contaminações. Uma vez que o KI dos picos nos espaços em branco foram identificados, subtrair a área do pico detectado no ar e / ou frasco em branco a partir da área do pico presente na amostra. Em seguida, proceder com a análise estatística. </li></ol> 4. Os resultados representativos O nariz eletrônico foi capaz de detectar diferenças nos perfis de voláteis entre melão, colhidos em diferentes estádios de maturação (Figura 5). Vinte KI janelas foram identificados em todas as amostras. Uma análise de variância mostrou que 14 picos DeteCTED pelo nariz eletrônico variou significativamente entre os estádios de maturação. Na Figura 6, o registro das áreas médias máximas de 14 componentes estes são plotados para mostrar diferenças na abundância de pico entre dois estágios de maturidade, cedo maduros e frutas maduras. <img alt="A Figura 1" src="/files/ftp_upload/3821/3821fig1.jpg" /> Figura 1. Exemplos de formato de dados exportados a partir de software do aparelho (A) e após a transformação, realizada utilizando script &quot;reform_data.py&quot; (B). Para facilitar a manipulação de dados e análise, todas as KIs únicas são identificados através de todas as amostras, então os dados são reordenadas com informação da amostra em linhas e da área do pico em colunas, correspondentes a KIs únicas. Se um pico não for detectada por um valor de Ki numa amostra, a célula correspondente permanece vazio. <img alt="A Figura 2" src="/files/ftp_upload/3821/3821fig2.jpg" /> Figura captura de tela 2. Do script arquivo &quot;kim_interface.py&quot;. O enredo no centro exibe o número de visitas por KI KI contra. &#39;Hit por Kl&#39; é o número de amostras em que um pico com que KI específica foi detectada. No lado esquerdo, existem três caixas amarelas que controlam os dados seleccionados. Eles exibem parâmetros para dividir o conjunto de dados (tratamentos, repetições, variáveis ​​qualitativas, etc.) Nessa figura, eles são (de cima para baixo): variedade, data de plantio e estádio de maturação na colheita. Na parte inferior: clicando nas barras 3 e movendo-se a barra de azul para a esquerda ou para a direita, um pode seleccionar o mínimo eo valor máximo da gama de KI, ea área de pico mínima (&#39;Limiar&#39;). À direita: o botão &quot;Mesclar&quot; permite fusão KIs selecionados manualmente clicando nas barras da parcela. O botão &quot;Separar&quot; permite inverter o processo para casos selecionados. <img alt="A Figura 3" src="/files/ftp_upload/3821/3821fig3.jpg" /> Cromatogramas Figura 3. Sobrepostas (em<html> vermelho e preto), de duas repetições técnica de headspace melão volátil para ilustrar uma mudança no tempo de retenção. <img alt="A Figura 4" src="/files/ftp_upload/3821/3821fig4.jpg" /> Figura 4. Exemplo de KI fusão procedimento. Na trama central, a barra verde (Central KI) representa o KI mais populosa, que foi escolhido como centro da janela KI. KI KI X e Y são KIs queda na janela de juros e elas precisam ser incorporadas ao KI central. Clicando na barra de KI X, ela torna-se vermelho e, ao mesmo tempo, uma barra azul do mesmo comprimento da barra de KI X, aparece na parte superior do um verde. Ao repetir o mesmo procedimento para KI Y, o comprimento da barra de azul (KIs Mesclados) aumentará o comprimento correspondente. Depois que todos os KIs foram adicionados, clicando no botão verde &quot;direta&quot;, termina o processo de fusão, as alterações são salvas, e a cor do botão fica amarelo. / Files/ftp_upload/3821/3821fig5.jpg &quot;/&gt; Figura 5. Dois cromatogramas das amostras de melão, colhidas em diferentes estádios de maturação precoce, madura (superior) e completamente maduras (inferior), para ilustrar a capacidade do nariz electrónico para detectar diferenças na abundância voláteis. <img alt="A Figura 6" src="/files/ftp_upload/3821/3821fig6.jpg" /> Figura 6. Enredo Radar mostrando a área do pico de 14 componentes presentes em duas amostras de melão em dois estádios de maturação diferentes, cedo maduros e totalmente maduros. As áreas de pico são relatados em escala logarítmica para ajudar a visualizar a comparação. Os números no final de cada raio representam os Índices de Kovats correspondentes.

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Não temos nada a divulgar.

Narizes eletrônicos representam um método promissor para a avaliação rápida e objetiva de perfis de aroma de frutas ou volátil ricas amostras. No entanto, se desloca em tempo de retenção representam um desafio para a identificação de pico e pode levar a erros de interpretação dos dados, quando dois cromatogramas não estão perfeitamente alinhados. A inspecção visual dos cromatogramas indicaram que a variabilidade de tempos de retenção entre as amostras frequentemente causada mesmo pico de ser rotulados com valores de Ki ligeiramente diferente (aproximadamente ± 10). Isso se traduziu em um número exagerado de KIs únicos detectados. A fim de tirar vantagem dos factos de que (a) compostos diferentes estão presentes em diferentes estádios de maturação e (b) técnico repetições são aproximadamente idênticas, dois scripts baseados em computador (&quot;kim_merge.py&quot;, que contém as rotinas para a manipulação dos dados conjunto, e &quot;kim_interface.py&quot;, que fornece uma interface gráfica de usuário (GUI)) foram desenvolvidos de forma sistemáticacomparar amostras de uma forma semi-automatizada, reduzindo significativamente o tempo necessário para análise cromatograma de grandes conjuntos de dados. Estes programas permitir a consolidação, se for caso disso, de picos marcados com uma gama de valores de Ki sob uma etiqueta KI único. Isso serve para duas finalidades importantes: (a) que permite uma análise estatística para tratar esses picos como uma única variável, e (b) que facilita a identificação de pico e comparação com outros sistemas e os valores publicados. Os resultados apresentados aqui indicam que as amostras de melão, puderam ser discriminados com base na maturidade e aroma utilizando o sistema de zNose em combinação com a identificação KI adequada. Isto representa uma nova tecnologia promissora para a análise de compostos voláteis que podem ser utilizados para os programas de controlo de qualidade.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Cloreto de cálcio </td><td> MP Biomédica </td><td> 195088 </td><td></td></tr><tr><td> 2-metilbutilo isovalerato </td><td> SAFC global </td><td> W350613 </td><td> ≥ 98%, natural, FCC </td></tr><tr><td> Metanol </td><td> Fisher Scientific </td><td> A411-4 </td><td></td></tr><tr><td> Vial </td><td> Sigma / Supelco </td><td> SU860098 </td><td></td></tr><tr><td> Capa </td><td> Sigma / Supelco </td><td> SU860101 </td><td></td></tr><tr><td> Laboratório de liquidificador </td><td> Waring Laboratório de Ciências </td><td> 7009G </td><td> 2 velocidades liquidificador, 1 - recipiente de vidro Litro </td></tr><tr><td> Garrafa </td><td> Fisher Scientific </td><td> 06-414-1C </td><td> Pyrex, 500 mL; polipropileno bujão de vedação- </td></tr><tr><td> Agulha </td><td> Tecnologia Sensor Eletrônico </td><td> TLC101046 </td><td> Side buraco luer </td></tr><tr><td> Solução Alcanos </td><td> Tecnologia Sensor Eletrônico </td><td></td><td> C6-C14 solução alcanos em metanol </td></tr><tr><td> zNose </td><td> Tecnologia Sensor Eletrônico </td><td> Modelo 4500 </td><td></td></tr><tr><td> DB-5 de coluna GC </td><td> Tecnologia Sensor Eletrônico </td><td> SYS4500C5 </td><td></td></tr><tr><td> Microsense </td><td> Tecnologia Sensor Eletrônico </td><td> Versão 5.44.22 </td><td></td></tr><tr><td> Python 2.6 </td><td></td><td></td><td> Disponível gratuitamente on-line </td></tr><tr><td> &quot;Reform_data.py&quot; e &quot;roteiros&quot; kim_interface.py</td><td></td><td></td><td> Scripts disponíveis como material suplementar em JOVE </td></tr></tbody></table>

fruit volatile analysis using an electronic nose

Numerosas e diversas alterações fisiológicas ocorrer durante o amadurecimento de frutos, incluindo o desenvolvimento de uma mistura específica volátil que caracteriza aroma de fruta. Maturação na colheita é um dos principais fatores que influenciam a qualidade do sabor de frutas e vegetais 1. A validação de métodos robustos que avaliar rapidamente maturação e qualidade aroma permitiria uma melhor gestão de programas de melhoramento avançados, práticas de produção e manuseio pós-colheita. Ao longo das últimas três décadas, muitas pesquisas têm sido realizadas para desenvolver os chamados narizes eletrônicos, que são dispositivos capazes de detectar rapidamente os odores e sabores 2-4. Actualmente, existem vários comercialmente disponíveis narizes electrónicos capazes de realizar a análise volátil, com base em tecnologias diferentes. O nariz eletrônico usado em nosso trabalho (zNose, EST, Newbury Park, CA, EUA), consiste em ultra-rápido de cromatografia gasosa acoplada com um sensor de onda acústica de superfície (UFGC-SAW). Esta tecnologia já foi testada por sua capacidade de monitorar a qualidade de várias commodities, incluindo a detecção de deterioração da maçã 5; maturação e avaliação podridão em manga 6; perfil de aroma de espécies timo 7; C 6 compostos voláteis em bagos de uva 8; caracterização de óleo vegetal 9 e detecção de adulterantes em óleo de coco virgem 10. Este sistema pode executar as três etapas principais de análise aroma: headspace de amostragem, a separação de compostos voláteis, e de detecção. Em cerca de um minuto, a saída, um cromatograma, é produzida e, depois de um ciclo de purga, o aparelho está pronto para análise posterior. Os resultados obtidos com o zNose podem ser comparados com os de outros sistemas de gás-cromatográficos por cálculo dos Índices de Kovats (Kl). Uma vez que o instrumento foi ajustado com uma solução alcano padrão, os tempos de retenção são automaticamente convertidos emKIS. No entanto, pequenas alterações na temperatura e na taxa de fluxo Espera-se que ocorrem ao longo do tempo, fazendo com que os tempos de retenção à deriva. Além disso, dependendo da polaridade da fase de coluna estacionária, a reprodutibilidade dos cálculos Ki pode variar de acordo com as unidades de índice vários 11. Uma série de programas e interfaces gráficas foram desenvolvidas, portanto, comparar KIs calculadas entre amostras de uma forma semi-automatizada. Estes programas reduzir o tempo necessário para a análise cromatograma de grandes conjuntos de dados e minimizar o potencial para a interpretação errada dos dados quando cromatogramas não são perfeitamente alinhadas. Nós apresentamos um método para análise de compostos voláteis em frutas rápida. Procedimentos de preparação de amostras, aquisição de dados e manipulação também são discutidos.

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Fruit Volatile Analysis Using an Electronic Nose

Um método rápido para análise composto volátil na fruta é descrito. Os compostos voláteis presentes no espaço de topo de um homogenato da amostra são rapidamente separados e detectados com ultra-rápida cromatografia gasosa (GC) acoplado com uma onda acústica de superfície (SAW) do sensor. Um procedimento para manipulação de dados e análise também é discutida.

Análise de Frutas volátil Usando um Nariz Eletrônico

Numerous and diverse physiological changes occur during fruit ripening, including the development of a specific volatile blend that characterizes fruit ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Studying Aggression in Drosophila (fruit flies)

Aggression is an innate behavior that evolved in the framework of defending or obtaining resources. This complex social behavior is influenced by genetic, hormonal and environmental factors. In many organisms, aggression is critical to survival but controlling and suppressing aggression in distinct contexts also has become increasingly important. In recent years, invertebrates have become increasingly useful as model systems for investigating the genetic and systems biological basis of complex social behavior. This is in part due to the diverse repertoire of behaviors exhibited by these organisms. In the accompanying video, we outline a method for analyzing aggression in Drosophila whose design encompasses important eco-ethological constraints. Details include steps for: making a fighting chamber; isolating and painting flies; adding flies to the fight chamber; and video taping fights. This approach is currently being used to identify candidate genes important in aggression and in elaborating the neuronal circuitry that underlies the output of aggression and other social behaviors.

Studying Aggression in Drosophila fruit flies

Agressão a estudar em Drosophila (mosca da fruta)

Aggression is an innate behavior that evolved in the framework of defending or obtaining resources.  This complex social behavior is influenced by ...

Biologia

Homemade Site Directed Mutagenesis of Whole Plasmids

Site directed mutagenesis of whole plasmids is a simple way to create slightly different variations of an original plasmid. With this method the cloned target gene can be altered by substitution, deletion or insertion of a few bases directly into a plasmid. It works by simply amplifying the whole plasmid, in a non PCR-based thermocycling reaction. During the reaction mutagenic primers, carrying the desired mutation, are integrated into the newly synthesized plasmid. In this video tutorial we demonstrate an easy and cost effective way to introduce base substitutions into a plasmid. The protocol works with standard reagents and is independent from commercial kits, which often are very expensive. Applying this protocol can reduce the total cost of a reaction to an eighth of what it costs using some of the commercial kits. In this video we also comment on critical steps during the process and give detailed instructions on how to design the mutagenic primers.

Site directed mutagenesis of whole plasmids is a simple way to create slightly different variations of an original plasmid. Here we demonstrate an easy and cost effective way to introduce base substitutions into a plasmid using standard reagents.

Mutagênese do site caseiros Direção de Plasmids Whole

Site directed mutagenesis of whole plasmids is a simple way to create slightly different variations of an original plasmid. With this method the cloned ...

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing measurement of multiple cellular phenotypes within a single assay. In this study, we utilized HCA to develop a novel assay for neurotoxicity. Neurotoxicity assessment represents an important part of drug safety evaluation, as well as being a significant focus of environmental protection efforts. Additionally, neurotoxicity is also a well-accepted in vitro marker of the development of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's and Parkinson's diseases. Recently, the application of HCA to neuronal screening has been reported. By labeling neuronal cells with &beta;III-tubulin, HCA assays can provide high-throughput, non-subjective, quantitative measurements of parameters such as neuronal number, neurite count and neurite length, all of which can indicate neurotoxic effects. However, the role of astrocytes remains unexplored in these models. Astrocytes have an integral role in the maintenance of central nervous system (CNS) homeostasis, and are associated with both neuroprotection and neurodegradation when they are activated in response to toxic substances or disease states. GFAP is an intermediate filament protein expressed predominantly in the astrocytes of the CNS. Astrocytic activation (gliosis) leads to the upregulation of GFAP, commonly accompanied by astrocyte proliferation and hypertrophy. This process of reactive gliosis has been proposed as an early marker of damage to the nervous system. The traditional method for GFAP quantitation is by immunoassay. This approach is limited by an inability to provide information on cellular localization, morphology and cell number. We determined that HCA could be used to overcome these limitations and to simultaneously measure multiple features associated with gliosis - changes in GFAP expression, astrocyte hypertrophy, and astrocyte proliferation - within a single assay. In co-culture studies, astrocytes have been shown to protect neurons against several types of toxic insult and to critically influence neuronal survival. Recent studies have suggested that the use of astrocytes in an in vitro neurotoxicity test system may prove more relevant to human CNS structure and function than neuronal cells alone. Accordingly, we have developed an HCA assay for co-culture of neurons and astrocytes, comprised of protocols and validated, target-specific detection reagents for profiling &beta;III-tubulin and glial fibrillary acidic protein (GFAP). This assay enables simultaneous analysis of neurotoxicity, neurite outgrowth, gliosis, neuronal and astrocytic morphology and neuronal and astrocytic development in a wide variety of cellular models, representing a novel, non-subjective, high-throughput assay for neurotoxicity assessment. The assay holds great potential for enhanced detection of neurotoxicity and improved productivity in neuroscience research and drug discovery.

This article describes a novel protocol and reagent set designed for sensitive measurement of neurotoxic effects of compounds and treatments on co-cultures of neurons and astrocytes using high content analysis. Results demonstrate that high content analysis represents an exciting novel technology for neurotoxicity assessment.

A Neuronal e astrocitária Ensaio Co-Cultura de Análise de Conteúdo de Alta de neurotoxicidade

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

An Optimized Protocol for Rearing Fopius arisanus, a Parasitoid of Tephritid Fruit Flies

Fopius arisanus (Sonan) is an important parasitoid of Tephritid fruit flies for at least two reasons. First, it is the one of only three opiine parasitoids known to infect the host during the egg stage1. Second, it has a wide range of potential fruit fly hosts. Perhaps due to its life history, F. arisanus has been a successfully used for biological control of fruit flies in multiple tropical regions2-4. One impediment to the wide use of F. arisanus for fruit fly control is that it is difficult to establish a stable laboratory colony5-9. Despite this difficulty, in the 1990s USDA researchers developed a reliable method to maintain laboratory populations of F. arisanus10-12. There is significant interest in F. arisanus biology13,14, especially regarding its ability to colonize a wide variety of Tephritid hosts14-17; interest is especially driven by the alarming spread of Bactrocera fruit fly pests to new continents in the last decade18. Further research on F. arisanus and additional deployments of this species as a biological control agent will benefit from optimizations and improvements of rearing methods. In this protocol and associated video article we describe an optimized method for rearing F. arisanus based on a previously described approach12. The method we describe here allows rearing of F. arisanus in a small scale without the use of fruit, using materials available in tropical regions around the world and with relatively low manual labor requirements.

An Optimized Protocol for Rearing Fopius arisanus, a Parasitoid of Tephritid Fruit Flies

Fopius arisanus is an egg-larval parasitoid of Tephritid fruit flies that is successfully used in biological control of these important tropical pests. We describe here an optimized protocol for rearing F. arisanus on a small scale using readily available materials.

Um protocolo Optimizado para Criação Fopius arisanus, Um parasitóide de Frutas Tephritid Flies

Fopius arisanus (Sonan) is an important parasitoid of Tephritid fruit flies for at least two reasons. First, it is the one of only three opiine ...

Isolation and Biophysical Study of Fruit Cuticles

The cuticle, a hydrophobic protective layer on the aerial parts of terrestrial plants, functions as a versatile defensive barrier to various biotic and abiotic stresses and also regulates water flow from the external environment.1 A biopolyester (cutin) and long-chain fatty acids (waxes) form the principal structural framework of the cuticle; the functional integrity of the cuticular layer depends on the outer 'epicuticular' layer as well as the blend consisting of the cutin biopolymer and 'intracuticular' waxes.2 Herein, we describe a comprehensive protocol to extract waxes exhaustively from commercial tomato (Solanum lycopersicum) fruit cuticles or to remove epicuticular and intracuticular waxes sequentially and selectively from the cuticle composite. The method of Jetter and Sch&auml;ffer (2001) was adapted for the stepwise extraction of epicuticular and intracuticular waxes from the fruit cuticle.3,4 To monitor the process of sequential wax removal, solid-state cross-polarization magic-angle-spinning (CPMAS) 13C NMR spectroscopy was used in parallel with atomic force microscopy (AFM), providing molecular-level structural profiles of the bulk materials complemented by information on the microscale topography and roughness of the cuticular surfaces. To evaluate the cross-linking capabilities of dewaxed cuticles from cultivated wild-type and single-gene mutant tomato fruits, MAS 13C NMR was used to compare the relative proportions of oxygenated aliphatic (CHO and CH2O) chemical moieties.
Exhaustive dewaxing by stepwise Soxhlet extraction with a panel of solvents of varying polarity provides an effective means to isolate wax moieties based on the hydrophobic characteristics of their aliphatic and aromatic constituents, while preserving the chemical structure of the cutin biopolyester. The mechanical extraction of epicuticular waxes and selective removal of intracuticular waxes, when monitored by complementary physical methodologies, provides an unprecedented means to investigate the cuticle assembly: this approach reveals the supramolecular organization and structural integration of various types of waxes, the architecture of the cutin-wax matrix, and the chemical composition of each constituent. In addition, solid-state 13C NMR reveals differences in the relative numbers of CHO and CH2O chemical moieties for wild-type and mutant red ripe tomato fruits. The NMR techniques offer exceptional tools to fingerprint the molecular structure of cuticular materials that are insoluble, amorphous, and chemically heterogeneous. As a noninvasive surface-selective imaging technique, AFM furnishes an effective and direct means to probe the structural organization of the cuticular assembly on the nm-&mu;m length scale.

Aerial plant organs are protected by the cuticle, a supramolecular biopolyester-wax assembly. We present protocols to monitor selective removal of epi- and intracuticular waxes from tomato fruit cuticles on molecular and micro scales by solid-state NMR and atomic force microscopy, respectively, and to assess the cross-linking capacity of engineered cuticular biopolyesters.

Isolamento e Estudo de Biofísica de Cutículas Frutas

The cuticle, a hydrophobic protective layer on the aerial parts of terrestrial plants, functions as a versatile defensive barrier to various biotic and ...

Analysis of SNARE-mediated Membrane Fusion Using an Enzymatic Cell Fusion Assay

The interactions of SNARE (soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor) proteins on vesicles (v-SNAREs) and on target membranes (t-SNAREs) catalyze intracellular vesicle fusion1-4. Reconstitution assays are essential for dissecting the mechanism and regulation of SNARE-mediated membrane fusion5. In a cell fusion assay6,7, SNARE proteins are expressed ectopically at the cell surface. These "flipped" SNARE proteins drive cell-cell fusion, demonstrating that SNAREs are sufficient to fuse cellular membranes. Because the cell fusion assay is based on microscopic analysis, it is less efficient when used to analyze multiple v- and t-SNARE interactions quantitatively.
Here we describe a new assay8 that quantifies SNARE-mediated cell fusion events by activated expression of &beta;-galactosidase. Two components of the Tet-Off gene expression system9 are used as a readout system: the tetracycline-controlled transactivator (tTA) and a reporter plasmid that encodes the LacZ gene under control of the tetracycline-response element (TRE-LacZ). We transfect tTA into COS-7 cells that express flipped v-SNARE proteins at the cell surface (v-cells) and transfect TRE-LacZ into COS-7 cells that express flipped t-SNARE proteins at the cell surface (t-cells). SNARE-dependent fusion of the v- and t-cells results in the binding of tTA to TRE, the transcriptional activation of LacZ and expression of &beta;-galactosidase. The activity of &beta;-galactosidase is quantified using a colorimetric method by absorbance at 420 nm.
The vesicle-associated membrane proteins (VAMPs) are v-SNAREs that reside in various post-Golgi vesicular compartments10-15. By expressing VAMPs 1, 3, 4, 5, 7 and 8 at the same level, we compare their membrane fusion activities using the enzymatic cell fusion assay. Based on spectrometric measurement, this assay offers a quantitative approach for analyzing SNARE-mediated membrane fusion and for high-throughput studies.

We have developed a cell fusion assay that quantifies SNARE-mediated membrane fusion events by activated expression of &beta;-galactosidase.

Análise de SNARE mediada por fusão de membrana usando um ensaio de fusão celular enzimática

The interactions of SNARE (soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor)  proteins on vesicles (v-SNAREs) and on target membranes ...

Laboratory Protocol for Genetic Gut Content Analyses of Aquatic Macroinvertebrates Using Group-specific rDNA Primers

Analyzing food webs is essential for a better understanding of ecosystems. For example, food web interactions can undergo severe changes caused by the invasion of non-indigenous species. However, an exact identification of field predator-prey interactions is difficult in many cases. These analyses are often based on a visual evaluation of gut content or the analysis of stable isotope ratios (&#948;15N and &#948;13C). Such methods require comprehensive knowledge about, respectively, morphologic diversity or isotopic signature from individual prey organisms, leading to obstacles in the exact identification of prey organisms. Visual gut content analyses especially underestimate soft bodied prey organisms, because maceration, ingestion and digestion of prey organisms make identification of specific species difficult. Hence, polymerase chain reaction (PCR) based strategies, for example the use of group-specific primer sets, provide a powerful tool for the investigation of food web interactions. Here, we describe detailed protocols to investigate the gut contents of macroinvertebrate consumers from the field using group-specific primer sets for nuclear ribosomal deoxyribonucleic acid (rDNA). DNA can be extracted either from whole specimens (in the case of small taxa) or out of gut contents of specimens collected in the field. Presence and functional efficiency of the DNA templates need to be confirmed directly from the tested individual using universal primer sets targeting the respective subunit of DNA. We also demonstrate that consumed prey can be determined further down to species level via PCR with unmodified group-specific primers combined with subsequent single strand conformation polymorphism (SSCP) analyses using polyacrylamide gels. Furthermore, we show that the use of different fluorescent dyes as labels enables parallel screening for DNA fragments of different prey groups from multiple gut content samples via automated fragment analysis.

Most common gut content analyses of macroinvertebrates are visual. Requiring intense knowledge about morphological diversity of prey organisms, they miss soft bodied prey and, due to strong comminution of prey, are nearly impossible for some organisms, including amphipods. We provide detailed, novel genetic approaches for macroinvertebrate prey identification in the diet of amphipods.

Protocolo do laboratório para análises genéticas de conteúdo intestino de rDNA usando de macroinvertebrados aquáticos grupo-específicos Primers

Analyzing food webs is essential for a better understanding of ecosystems. For example, food web interactions can undergo severe changes caused by the ...

Simple Homemade Tools to Handle Fruit Flies&#8212;Drosophila melanogaster

The fruit fly, Drosophila melanogaster, is widely used both in biological research and biology education. Handling adult flies is common but difficult in practice, as adult flies fly. Demonstrated here is how to make some simple and cost-effective tools to address difficult issues in the handling of Drosophila. Holes in foam stoppers are made and pipette tips or funnels are inserted into the holes. Flies then move only in one direction into the pipette tip/funnel assemblage, allowing efficient control of the transfer of adult Drosophila into or out of a vial. Existing protocols have been modified for cool-anesthetizing flies by chilling in crushed ice and transferring them onto a cold, hard icepack surface. The icepack is covered with a piece of medical gauze that keeps immobilized flies from the condensed water when examined under a stereomicroscope. The flies are finally euthanized for counting and sorting or discarded by microwaving. A bottle-shaped cage has also been developed for collecting eggs, as well as a labor-saving device and accompanying protocol for cleaning glass culture vials.

Simple Homemade Tools to Handle Fruit Flies&amp;#8212;&lt;em&gt;Drosophila melanogaster&lt;/em&gt;

Described here is the use of several homemade tools to transfer, chill, and kill adult Drosophila, as well as to clean glass culture vials and collect eggs. These tools are easy to make and are rather efficient in handling Drosophila.

Ferramentas caseiras simples para lidar com moscas de frutas —Drosophila melanogaster

The fruit fly, Drosophila melanogaster, is widely used both in biological research and biology education. Handling adult flies is common but difficult in ...

Topical Application Bioassay to Quantify Insecticide Toxicity for Mosquitoes and Fruit Flies

The continued use of insecticides for public health and agriculture has led to widespread insecticide resistance and hampering of control methods. Insecticide resistance surveillance of mosquito populations is typically done through Centers for Disease Control and Prevention (CDC) bottle bioassays or World Health Organization (WHO) tube tests. However, these methods can result in a high degree of variability in mortality data due to variable insecticide contact with&#160;the insect, the relatively small numbers of organisms tested, extensive variation in mass between populations, and constantly changing environmental conditions, leading to variable outcomes. This paper presents the topical application bioassay, adapted as a high-throughput phenotypic bioassay for both mosquitoes and fruit flies, to test large numbers of insects along&#160;a range of insecticide concentrations.
This assay 1) ensures consistent treatment and insecticide contact with every organism, 2) produces highly specific dose-response curves that account for differences in average mass between strains and sexes (which is particularly important for field-collected organisms), and 3) allows for the calculation of statistically rigorous median lethal doses (LD50), which are necessary for resistance ratio comparisons-an alternative surveillance approach from diagnostic dose mortality, which is also used for larvicide resistance surveillance. This assay will be a complementary tool for accurately phenotyping mosquito populations and, as illustrated using fruit flies, is easily adaptable for use with other insects. We argue that this assay will help fill the gap between genotypic and phenotypic insecticide resistance in multiple insect species.

We describe the methodology and importance of the topical application bioassay to measure insecticide susceptibility in mosquitoes and fruit flies. The presented assay is high-throughput, utilizes insect mass-thus allowing for calculating a mass-relativized lethal dose instead of concentration-and likely has lower variability than other similar methods.

Bioensaio de aplicação tópico para quantificar toxicidade de inseticida para mosquitos e moscas de frutas

The continued use of insecticides for public health and agriculture has led to widespread insecticide resistance and hampering of control methods. ...

Protocols for CRISPR/Cas9 Mutagenesis of the Oriental Fruit Fly Bactrocera dorsalis

The Oriental fruit fly, Bactrocera dorsalis, is a highly invasive and adaptive pest species that causes damage to citrus and over 150 other fruit crops worldwide. Since adult fruit flies have great flight capacity and females lay their eggs under the skins of fruit, insecticides requiring direct contact with the pest usually perform poorly in the field. With the development of molecular biological tools and high-throughput sequencing technology, many scientists are attempting to develop environmentally friendly pest management strategies. These include RNAi or gene editing-based pesticides that downregulate or silence genes (molecular targets), such as olfactory genes involved in searching behavior, in various insect pests. To adapt these strategies for Oriental fruit fly control, effective methods for functional gene research are needed. Genes with critical functions in the survival and reproduction of B. dorsalis serve as good molecular targets for gene knockdown and/or silencing. The CRISPR/Cas9 system is a reliable technique used for gene editing, especially in insects. This paper presents a systematic method for CRISPR/Cas9 mutagenesis of B. dorsalis, including the design and synthesis of guide RNAs, collecting embryos, embryo injection, insect rearing, and mutant screening. These protocols will serve as a useful guide for generating mutant flies for researchers interested in functional gene studies in B. dorsalis.

Protocols for CRISPR/Cas9 Mutagenesis of the Oriental Fruit Fly Bactrocera dorsalis

This paper presents the step-by-step protocols for CRISPR/Cas9 mutagenesis of the Oriental fruit fly Bactrocera dorsalis. Detailed steps provided by this standardized protocol will serve as a useful guide for generating mutant flies for functional gene studies in B. dorsalis.

Protocolos para a Mutagênese CRISPR/Cas9 da Mosca da Fruta Oriental Bactrocera dorsalis

The Oriental fruit fly, Bactrocera dorsalis, is a highly invasive and adaptive pest species that causes damage to citrus and over 150 other fruit crops ...