Name: fruit volatile analysis using an electronic nose
Uploaded: 2012-03-30T13:00:00
Duration: 11 min 2 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fruit Volatile Analysis Using an Electronic Nose at JoVE.com

Los autores agradecen a Bill Copes (Harris Moran Seed Company, Davis) para proporcionar frutos de melón para este análisis. Este proyecto es apoyado por la especialidad de Investigación de Cultivos Programa de Iniciativa de Subvenciones Competitivas conceder ninguna. 2009-51181-05783 del Instituto Nacional del USDA de la Agricultura y la Alimentación.

1. Preparación de la muestra <ol><li> Cosecha frutos en la etapa de madurez deseada. Enjuagar con agua del grifo con el fin de eliminar la suciedad y el polvo. </li><li> Seleccione frutas para el análisis basado en la ausencia de defectos externos e internos, y la homogeneidad de tamaño. </li><li> Cortar las frutas en trozos longitudinales que se utilizarán para toma de muestras volátiles. En su caso, retirar la piel, las semillas, tejidos cavidad de la semilla, o pozo. Selección de los tejidos del fruto debe ser consistente durante todo el experimento y tomar en cuenta la variabilidad dentro de una sola fruta (es decir, obtener una muestra por igual de la flor ecuatorial, y partes del tallo finales). </li><li> Combinar el tejido de la fruta seleccionada, se mezclan con el fin de aleatorizar y, a continuación, pesar 200 g en una batidora. </li><li> Añadir 200 ml de solución de CaCl2 saturado (372,5 g, a 20 ° C, en 500 ml de agua desionizada) y 50 l de una solución 100 mM de 2-metilbutil isovalerato en metanol. El 2 CaCl está destinado a actuar como un inhibidor enzimático de corriente alternaproductividad, lo que podría ocurrir después del corte y homogeneización de la carne de la fruta. 2-metilbutil isovalerato se añade como un patrón interno para controlar las posibles pérdidas de compuestos volátiles durante el proceso de homogeneización. </li><li> Homogeneizar la mezcla en una licuadora de laboratorio (Waring, EE.UU.), durante 30 segundos a 18.000 rpm, e inmediatamente después verter en la botella de vidrio y sellado con tapa de teflón. Mantener el homogeneizado en la botella a temperatura ambiente hasta que todas las muestras se preparan. </li><li> Después de verter el homogeneizado en la botella, espere 10 minutos para permitir la separación de la espuma del líquido, entonces pipeta alícuotas de 5 ml de líquido, sin espuma, en viales de 20 ml de vidrio ámbar y sellar los frascos con tapón de rosca de acero equipados con teflón / silicona septos. Este procedimiento es adecuado para la preparación de melón y homogeneizado pera. Si otras frutas se utilizan para el análisis, una etapa de centrifugación se pueda requerir. Por lo tanto, eliminar la espuma y centrifugar el líquido a las partículas de pellets que podríaobstruir la pipeta. Preparar por lo menos tres viales por muestra para servir como técnicos repeticiones. </li><li> En este punto, las muestras pueden ser analizadas inmediatamente o flash-congelados en nitrógeno líquido y se almacena a temperatura ultra-baja (-80 ° C) para su posterior análisis. </li><li> Para las muestras congeladas, en el día análisis retirar las muestras del congelador y permitir que se descongele durante una hora a temperatura ambiente. Después de la descongelación, y antes de su análisis, vuelva a colocar el tapón del vial con una nueva que tiene un tabique seco y limpio. Si el tabique no se reemplaza, el agua condensada en el tabique durante la descongelación se pueden extraer en el instrumento y dañarlo. </li></ol> 2. Cromatografía de Gases-onda acústica de superficie (GC-SAW) Puesta en marcha y adquisición de datos <ol><li> Cargue el método de análisis apropiado en el zNose. Para el análisis del éster-rico perfil volátil de melón, nuestros parámetros en la versión de software microsentido 5.44.22 (Newbury Park, CA, EE.UU.) son los siguientes: succión del espacio de cabeza en elde entrada durante 20 segundos a 30 ml min -1 a través de la bomba, la temperatura de entrada a 200 ° C, la temperatura Tenax trampa a 225 ° C, el flujo de gas portador (helio, la pureza del 99,999%) la tasa de 2,9 ml min-1, columna (DB-5 columna, 1 mx 0,25 mm DI x 0,25 m de espesor de película) programa de temperatura desde 45 ° C a 180 ° C a una velocidad de 10 ° C seg -1; sensor de temperatura a 40 ° C; válvula a 165 ° C. El tiempo total de análisis es de 1 minuto por muestra. </li><li> Conectar una aguja de acero inoxidable con no ahuecada punta a la entrada de zNose y purgar el sistema varias veces con el aire ambiente hasta que la línea de base es estable y sin picos de más de 200 cuentas (Ct) se detectan. </li><li> Afinar el instrumento con una solución de alcanos de cadena lineal (C6-C14). El resultado sintonía es utilizado por el software del instrumento para convertir el tiempo de retención de los picos eluidos de unidades de tiempo en Kovats Index (KI) unidades. En consecuencia, después de que el sistema está sintonizado, los tiempos de retención se indican en unidades de KI. </li&gt; <li> Antes del análisis, que la muestra se equilibre durante 30 minutos. Para el análisis de uno de los viales de muestra, insertar una aguja en el septo del vial para aliviar la presión. A continuación se introduce la aguja conectada a la entrada del instrumento en el septo del vial e iniciar el muestreo de espacio de cabeza. Analizar al menos tres repeticiones por técnica de la muestra. </li><li> Inicie manualmente el instrumento haciendo clic en botón &quot;Play&quot;, se active la bomba y se retira de los vapores presentes por encima de la muestra. Al final del análisis, un cromatograma aparece en la pantalla, y el sensor se calienta automáticamente a 150 ° C durante 10 segundos para limpiarlo. Cuando el estado del sistema de botón de la caja se vuelve verde de nuevo, el instrumento está listo para analizar otra muestra. </li><li> Para garantizar una línea de base estable y la limpieza adecuada del sistema, ejecutar al menos un blanco de aire entre cada muestra. Para controlar una posible contaminación volátil del vial y la tapa, analizar dos vial de los espacios en blanco (vial vacío con tapa), al principio y al final del día. &lt;/ Li&gt; </ol> 3. Exportación de Datos y Análisis <ol><li> Exportar los datos en un archivo de Microsoft Excel después de la adquisición a través del &quot;registro de pico&quot; en función de software de microsentido. Una vez que los datos se exportan, agregar columnas que contienen las etiquetas de las variables y las repeticiones. </li><li> Transformar el formato de datos para facilitar la manipulación con el Python (versión 2.6, disponible gratuitamente en línea) script que hemos desarrollado, llamado &quot;reform_data.py&quot; (ver Figura 1 para ver un ejemplo del formato de datos antes y después de usar el script &quot;reform_data. py &quot;). El nombre del archivo de origen (formato xls) y nombre de la hoja de los datos de entrada, así como el nombre del archivo de salida (xls), se editan directamente en el guión. </li><li> Inicio &quot;kim_interface.py&quot; (también escrito en Python 2.6, ver Figura 2), e importar los datos desde el archivo generado en el paso anterior. Específicamente, el análisis se basa en la visualización y el análisis del número de veces que cada valor de Ki se detectó(&quot;Éxitos ki&quot;). Así, el programa muestra un gráfico de barras de accesos para cada valor de KI KI. </li><li> Evaluar los impactos de KI de subconjuntos específicos de las muestras, el análisis de cada grupo de técnicos repeticiones juntos. Para ello, analizar cada variable por separado el tratamiento o marcando / desmarcando las casillas correspondientes. Ver Figura 2 epígrafe para una descripción detallada de la interfaz gráfica de usuario (GUI). </li><li> Después de identificar el ancho de cada ventana de KI mediante la interfaz gráfica de usuario, seleccionar al azar algunos de los cromatogramas correspondientes en el software microsentido y evaluar superposición de picos entre los técnicos repeticiones. Ver Figura 3 para un ejemplo de cromatogramas superpuestos de dos técnicos repeticiones. </li><li> Una vez que la ventana de KI está individualizada, utilice la función disponible &#39;Merge&#39; en la interfaz gráfica de usuario de fusionar el KIS que se encuentran en la ventana, en la más poblada de KI. Mediante el uso de esta característica, los picos marcados con un rango de valores de KI se consolidan bajo una etiqueta única KI, allowing el tratamiento de los picos, como una sola variable. Para ello, primero haga clic en el botón &#39;Merge&#39; para activar la función y seleccione el KI más poblada como el centro de la ventana de la izquierda clic en la barra correspondiente. Una vez que la barra ha sido seleccionada, cambia de color y se vuelve verde. Para combinar el KIS que caen dentro de la ventana en el KI seleccionado, haga clic en las barras correspondientes, lo que hace que las barras de color rojo, mientras que una barra azul de la longitud correspondiente se añade en la parte superior de la central de KI (Ver Figura 4 ). Una vez que todos los KIs seleccionados se han fusionado en el KI central que corresponda, haga clic en el botón &#39;Merge&#39; de nuevo para aceptar los cambios, lo que hace que el botón &#39;Merge&#39; se vuelva amarilla. En caso de errores, el botón &#39;Unmerge &quot;también está disponible. Para desinstala, haga clic en el botón &#39;Unmerge&#39; en la interfaz gráfica de usuario, a continuación, haga clic en la barra roja que desea desinstala. De rojo, la barra se vuelve azul. Haga clic en el &#39;Unmerge&#39; de nuevo el botón para aceptar los cambios. </li><li> Si se intenta a incorrectly fusionar dos picos en una sola muestra en un valor de KI única, un mensaje de error se imprime. En tales circunstancias, estrechamente comprobar el cromatograma y redefinir la ventana KI en esa región. </li><li> Una vez que todas las operaciones de fusión se han realizado, guarde el archivo. </li><li> Antes de proceder con el análisis estadístico, los cromatogramas del aire y los espacios en blanco de los viales son analizadas para vigilar a posibles contaminaciones. Una vez que el KI de los picos en los espacios en blanco han sido identificados, restar el área del pico detectado en el aire y / o vial en blanco desde el área de la presente pico en la muestra. A continuación, proceder con el análisis estadístico. </li></ol> 4. Los resultados representativos La nariz electrónica fue capaz de detectar diferencias en los perfiles volátiles entre los frutos de melón cosechados en diferentes estados de madurez (Figura 5). Veinte KI ventanas fueron identificadas en todas las muestras. Un análisis de varianza mostró que 14 picos deteriorarseDirección Ejecutiva de la nariz electrónica variaron significativamente entre los estados de madurez. En la figura 6, el registro de las zonas medias máximas de estos 14 elementos se trazan para mostrar las diferencias en las abundancias máximas entre dos estados de madurez, a principios maduras y frutas maduras. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3821/3821fig1.jpg" /> Figura 1. Ejemplos de formato de los datos exportados de software del instrumento (A) y después de la transformación, realizado mediante &quot;reform_data.py&quot; secuencia de comandos (B). Para facilitar la manipulación de datos y el análisis, todos los KIs únicas se identifican a través de todas las muestras, a continuación, los datos se reordenan, con información de la muestra en filas y columnas en el área del pico, que corresponden a KIs únicas. Si un pico no se detecta por un valor de KI en una muestra, la celda correspondiente permanece vacía. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3821/3821fig2.jpg" /> Figura 2. Captura de pantalla de la alforjat archivo &quot;kim_interface.py&quot;. La parcela en el centro muestra el número de visitas por KI KI vs. &quot;Pedir por KI &#39;es el número de muestras en las que se detectó un pico con el que el KI específico. En el lado izquierdo, hay tres recuadros amarillos que controlan los datos seleccionados. En ellas se muestran los parámetros para dividir el conjunto de datos (tratamientos, repeticiones, las variables cualitativas, etc.) En esta figura, que son (de arriba a abajo): Variedad, fecha de siembra y la etapa de madurez en la cosecha. En la parte inferior: haciendo clic en los 3 bares y mover la barra azul a la izquierda oa la derecha, se puede seleccionar el mínimo y el valor máximo del rango de KI, y el área del pico mínimo (&#39;Threshold&#39;). A la derecha: el botón &#39;Merge&#39; permite la fusión de KI seleccionados de forma manual haciendo clic en los bares de la trama. El botón &#39;Unmerge&#39; permite invertir el proceso para casos seleccionados. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3821/3821fig3.jpg" /> Figura 3. Cromatogramas superpuestos (en<html> negro y rojo) de dos repeticiones técnica de espacio de cabeza de melón volátil para ilustrar un cambio en el tiempo de retención. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3821/3821fig4.jpg" /> Figura 4. Ejemplo del KI fusión procedimiento. En la trama central, la barra verde (Central KI) es la más poblada de KI, que ha sido seleccionado como centro de la ventana de KI. KI X e Y son KI KI que caen en la ventana de su interés y es necesario que se fusionarán en el KI central. Al hacer clic derecho en la barra de KI X, se convierte en rojo y, al mismo tiempo, una barra azul de la misma longitud de la barra de KI X, aparece en la parte superior de la verde. Repitiendo el mismo procedimiento para el KI Y, la longitud de la barra azul (KIS fusionados) aumentará de la longitud correspondiente. Una vez que todos los KI se han añadido, haciendo clic en el botón verde &quot;Merge&quot;, finaliza el proceso de fusión, los cambios se guardan, y el color del botón cambia a amarillo. / Files/ftp_upload/3821/3821fig5.jpg &quot;/&gt; Figura 5. Dos cromatogramas de las muestras de melón cosechados en diferentes estados de madurez, a principios de madura (arriba) y totalmente madura (abajo), para ilustrar la capacidad de la nariz electrónica para detectar diferencias en la abundancia de volátiles. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/3821/3821fig6.jpg" /> Figura 6. Parcela de radar que muestra el área del pico de 14 componentes presentes en dos muestras de melón en dos etapas diferentes, madurez temprana maduras y maduras completamente. Las áreas de los picos se presentan en escala logarítmica para ayudar a visualizar la comparación. Los números al final de cada rayo representan los índices Kovats correspondientes.

<ol>
	<li>Kader, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flavor+quality+of+fruits+and+vegetables.">Flavor quality of fruits and vegetables.</a> Journal of the Science of Food and Agriculture. 88, 1863-1868 (2008).</li><li>Persaud, K., Dodd, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+discriminant+mechanisms+in+the+mammalian+olfactory+system+using+a+model+nose.">Analysis of discriminant mechanisms in the mammalian olfactory system using a model nose.</a> Nature. 299, 352-355 (1982).</li><li>Gardner, J. W., Bartlett, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+brief-history+of+electronic+noses.">A brief-history of electronic noses.</a> Sensors and Actuators. 18, 211-220 (1994).</li><li>Rock, F., Barsan, N., Weimar, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electronic+nose:+Current+status+and+future+trends.">Electronic nose: Current status and future trends.</a> Chem. Rev. 108, 705-725 (2008).</li><li>Li, C., Heinemann, P. H., Irudayaraj, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+apple+deterioration+using+an+electronic+nose+and+zNose.">Detection of apple deterioration using an electronic nose and zNose.</a> Transactions of the Asabe. 50, 1417-1425 (2007).</li><li>Li, Z. F., Wang, N., Raghavan, G. S. V., Vigneault, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ripeness+and+rot+evaluation+of+'Tommy+Atkins'+mango+fruit+through+volatiles+detection.">Ripeness and rot evaluation of 'Tommy Atkins' mango fruit through volatiles detection.</a> J. Food Eng. 91, 319-324 (2009).</li><li>Oh, S. Y., Ko, J. W., Jeong, S. Y., Hong, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+and+exploration+of+fast+gas+chromatography-surface+acoustic+wave+sensor+to+the+analysis+of+thymus+species.">Application and exploration of fast gas chromatography-surface acoustic wave sensor to the analysis of thymus species.</a> J. Chromatogr. A. 1205, 117-127 (2008).</li><li>Watkins, P., Wijesundera, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+zNose+for+the+analysis+of+selected+grape+aroma+compounds.">Application of zNose for the analysis of selected grape aroma compounds.</a> Talanta. 70, 595-601 (2006).</li><li>Gan, H. L., Man, Y. B. C., Tan, C. P., NorAini, I., Nazimah, S. A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+vegetable+oils+by+surface+acoustic+wave+sensing+electronic+nose.">Characterisation of vegetable oils by surface acoustic wave sensing electronic nose.</a> Food Chem. 89, 507-518 (2005).</li><li>Marina, A. M., Man, Y. B. C., Amin, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+the+SAW+Sensor+Electronic+Nose+for+Detecting+the+Adulteration+of+Virgin+Coconut+Oil+with+RBD+Palm+Kernel+Olein.">Use of the SAW Sensor Electronic Nose for Detecting the Adulteration of Virgin Coconut Oil with RBD Palm Kernel Olein.</a> Journal of the American Oil Chemists Society. 87, 263-270 (2010).</li><li>Evans, M. B., Haken, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+developments+in+the+gas-chromatographic+index+scheme.">Recent developments in the gas-chromatographic index scheme.</a> Journal of Chromatography. 472, 93-127 (1989).</li></ol>

No tenemos nada que revelar.

Las narices electrónicas representan un método prometedor para la evaluación rápida y objetiva de los perfiles de aroma de las frutas o las muestras volátiles ricos. Sin embargo, los cambios en el tiempo de retención representa un reto para la identificación de los picos y podría dar lugar a una interpretación errónea de los datos cuando dos cromatogramas no están perfectamente alineadas. La inspección visual de los cromatogramas se indica que la variabilidad de los tiempos de retención entre las muestras debidos el mismo pico que ser etiquetados con los valores de KI ligeramente diferente (aproximadamente ± 10). Esto se tradujo en un número exagerado de KI únicos detectados. Con el fin de aprovechar el hecho de que (a) compuestos diferentes están presentes en diferentes estados de madurez y (b) replica técnica son aproximadamente idénticas, dos guiones computarizado (&quot;kim_merge.py&quot;, que contiene las rutinas para la manipulación de los datos conjunto, y &quot;kim_interface.py&quot;, que proporciona una interfaz gráfica de usuario (GUI)) se han desarrollado de manera sistemáticacomparar las muestras de forma semi-automatizada, reduciendo considerablemente el tiempo necesario para el análisis de cromatograma de grandes conjuntos de datos. Estos programas permiten la consolidación, en su caso, de los picos marcados con un rango de valores de KI en una etiqueta KI clave. Esto tiene dos propósitos importantes: (a) que permite un análisis estadístico para el tratamiento de estos picos como una sola variable, y (b) facilita la identificación de los picos y la comparación con otros sistemas y los valores publicados. Los resultados presentados aquí indican que las muestras de melón podría ser objeto de discriminación basada en la madurez y el perfil de aroma mediante el sistema zNose en combinación con la identificación adecuada de KI. Esto representa una nueva tecnología prometedora para el análisis de volátiles que pueden ser utilizados para los programas de control de calidad.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> Cloruro de calcio </td><td> MP Biomédica </td><td> 195088 </td><td></td></tr><tr><td> 2-metilbutil isovalerato </td><td> Caminar Mundial </td><td> W350613 </td><td> ≥ 98%, natural, de la FCC </td></tr><tr><td> El metanol </td><td> Fisher Scientific </td><td> A411-4 </td><td></td></tr><tr><td> Frasco </td><td> Sigma / Supelco </td><td> SU860098 </td><td></td></tr><tr><td> Tapa </td><td> Sigma / Supelco </td><td> SU860101 </td><td></td></tr><tr><td> Laboratorio de la licuadora </td><td> Waring Laboratorio de Ciencias </td><td> 7009G </td><td> 2-la velocidad de una licuadora 1 - recipiente de vidrio litros </td></tr><tr><td> Botella </td><td> Fisher Scientific </td><td> 06 a 414-1C </td><td> Pyrex, 500 ml, de polipropileno plug-cierre </td></tr><tr><td> Aguja </td><td> Tecnología de Sensor Electrónico </td><td> TLC101046 </td><td> Lado del agujero luer </td></tr><tr><td> Alcanos solución </td><td> Tecnología de Sensor Electrónico </td><td></td><td> C6-C14 alcanos solución en metanol </td></tr><tr><td> zNose </td><td> Tecnología de Sensor Electrónico </td><td> Modelo 4500 </td><td></td></tr><tr><td> DB-5 GC columna </td><td> Tecnología de Sensor Electrónico </td><td> SYS4500C5 </td><td></td></tr><tr><td> Microsentido </td><td> Tecnología de Sensor Electrónico </td><td> Versión 5.44.22 </td><td></td></tr><tr><td> Python 2.6 </td><td></td><td></td><td> Disponible gratuitamente en línea </td></tr><tr><td> &quot;Reform_data.py&quot; y &quot;scripts&quot; kim_interface.py</td><td></td><td></td><td> Secuencias de comandos disponibles como material complementario de Jove </td></tr></tbody></table>

fruit volatile analysis using an electronic nose

Numerosos cambios fisiológicos y diversa ocurren durante la maduración del fruto, incluyendo el desarrollo de una mezcla específica volátil que caracteriza aroma de fruta. La madurez en la cosecha es uno de los factores clave que influyen en la calidad del sabor de las frutas y verduras 1. La validación de métodos robustos que evalúan rápidamente la madurez del fruto y la calidad del aroma que permitiría una mejor gestión de los programas avanzados de mejoramiento genético, prácticas de producción y manejo poscosecha. Durante las últimas tres décadas, la investigación se ha llevado a cabo para desarrollar las llamadas narices electrónicas, que son dispositivos capaces de detectar rápidamente los olores y sabores 2-4. En la actualidad hay varias narices electrónicas disponibles en el mercado capaces de realizar análisis de volátiles, basadas en diferentes tecnologías. La nariz electrónica utilizada en nuestro trabajo (zNose, hora del Este, Newbury Park, CA, EE.UU.), se compone de cromatografía de gases ultra-rápido, junto con un sensor de superficie de onda acústica (UFGC-SAW). Esta tecnología ya ha sido probado por su capacidad para monitorear la calidad de diversos productos, incluyendo la detección de deterioro de la manzana 5, maduración y evaluación de la podredumbre en mango 6; perfiles de aroma de las especies timo 7, C 6 compuestos volátiles en las bayas de uva 8; caracterización de de aceite vegetal 9 y la detección de adulterantes en el aceite virgen de coco 10. Este sistema puede realizar las tres etapas principales de un análisis de aroma: muestreo del espacio de cabeza, la separación de compuestos volátiles, y la detección. En aproximadamente un minuto, la salida, un cromatograma, se produce y, después de un ciclo de purga, el instrumento está listo para su posterior análisis. Los resultados obtenidos con el zNose puede compararse con los de otros sistemas de cromatografía de gases mediante el cálculo de los índices de Kovats (KI). Una vez que el instrumento ha sido adaptado con una solución estándar de alcano, los tiempos de retención se convierten automáticamente enKis. Sin embargo, ligeros cambios en la temperatura y el caudal se espera que ocurran en el tiempo, causando tiempos de retención a la deriva. También, dependiendo de la polaridad de la fase estacionaria columna, la reproducibilidad de los cálculos de KI puede variar por las unidades de índice varias 11. Una serie de programas e interfaces gráficas se han desarrollado por lo tanto, para comparar KIs calculadas entre las muestras de una manera semi-automática. Estos programas reducen el tiempo requerido para el análisis cromatograma de grandes conjuntos de datos y minimizar la posibilidad de interpretación errónea de los datos cuando cromatogramas no están perfectamente alineados. Se presenta un método para el análisis rápido de compuestos volátiles de las frutas. Ejemplos de procedimientos de preparación, adquisición de datos y la manipulación también se discuten.

Watch this Scientific Journal Video about Fruit Volatile Analysis Using an Electronic Nose at JoVE.com

Fruit Volatile Analysis Using an Electronic Nose

Un método rápido para el análisis de compuestos volátiles de las frutas se describe. Los compuestos volátiles presentes en el espacio de cabeza de un homogeneizado de la muestra se separaron rápidamente y se detecta con cromatografía de gases ultra-rápida (GC) acoplado con una onda acústica de superficie (SAW) del sensor. Un procedimiento para el manejo y análisis de datos también se discute.

Frutas volátil análisis mediante una nariz electrónica

Numerous and diverse physiological changes occur during fruit ripening, including the development of a specific volatile blend that characterizes fruit ...

fruit-volatile-analysis-using-an-electronic-nose

Research

JoVE Journal

Biology

Studying Aggression in Drosophila (fruit flies)

Aggression is an innate behavior that evolved in the framework of defending or obtaining resources. This complex social behavior is influenced by genetic, hormonal and environmental factors. In many organisms, aggression is critical to survival but controlling and suppressing aggression in distinct contexts also has become increasingly important. In recent years, invertebrates have become increasingly useful as model systems for investigating the genetic and systems biological basis of complex social behavior. This is in part due to the diverse repertoire of behaviors exhibited by these organisms. In the accompanying video, we outline a method for analyzing aggression in Drosophila whose design encompasses important eco-ethological constraints. Details include steps for: making a fighting chamber; isolating and painting flies; adding flies to the fight chamber; and video taping fights. This approach is currently being used to identify candidate genes important in aggression and in elaborating the neuronal circuitry that underlies the output of aggression and other social behaviors.

Studying Aggression in Drosophila fruit flies

El estudio de la agresión en Drosophila (mosca de la fruta)

Aggression is an innate behavior that evolved in the framework of defending or obtaining resources.  This complex social behavior is influenced by ...

Investigación

Biología

Homemade Site Directed Mutagenesis of Whole Plasmids

Site directed mutagenesis of whole plasmids is a simple way to create slightly different variations of an original plasmid. With this method the cloned target gene can be altered by substitution, deletion or insertion of a few bases directly into a plasmid. It works by simply amplifying the whole plasmid, in a non PCR-based thermocycling reaction. During the reaction mutagenic primers, carrying the desired mutation, are integrated into the newly synthesized plasmid. In this video tutorial we demonstrate an easy and cost effective way to introduce base substitutions into a plasmid. The protocol works with standard reagents and is independent from commercial kits, which often are very expensive. Applying this protocol can reduce the total cost of a reaction to an eighth of what it costs using some of the commercial kits. In this video we also comment on critical steps during the process and give detailed instructions on how to design the mutagenic primers.

Site directed mutagenesis of whole plasmids is a simple way to create slightly different variations of an original plasmid. Here we demonstrate an easy and cost effective way to introduce base substitutions into a plasmid using standard reagents.

Mutagénesis dirigida casera de plásmidos enteros

Site directed mutagenesis of whole plasmids is a simple way to create slightly different variations of an original plasmid. With this method the cloned ...

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing measurement of multiple cellular phenotypes within a single assay. In this study, we utilized HCA to develop a novel assay for neurotoxicity. Neurotoxicity assessment represents an important part of drug safety evaluation, as well as being a significant focus of environmental protection efforts. Additionally, neurotoxicity is also a well-accepted in vitro marker of the development of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's and Parkinson's diseases. Recently, the application of HCA to neuronal screening has been reported. By labeling neuronal cells with &beta;III-tubulin, HCA assays can provide high-throughput, non-subjective, quantitative measurements of parameters such as neuronal number, neurite count and neurite length, all of which can indicate neurotoxic effects. However, the role of astrocytes remains unexplored in these models. Astrocytes have an integral role in the maintenance of central nervous system (CNS) homeostasis, and are associated with both neuroprotection and neurodegradation when they are activated in response to toxic substances or disease states. GFAP is an intermediate filament protein expressed predominantly in the astrocytes of the CNS. Astrocytic activation (gliosis) leads to the upregulation of GFAP, commonly accompanied by astrocyte proliferation and hypertrophy. This process of reactive gliosis has been proposed as an early marker of damage to the nervous system. The traditional method for GFAP quantitation is by immunoassay. This approach is limited by an inability to provide information on cellular localization, morphology and cell number. We determined that HCA could be used to overcome these limitations and to simultaneously measure multiple features associated with gliosis - changes in GFAP expression, astrocyte hypertrophy, and astrocyte proliferation - within a single assay. In co-culture studies, astrocytes have been shown to protect neurons against several types of toxic insult and to critically influence neuronal survival. Recent studies have suggested that the use of astrocytes in an in vitro neurotoxicity test system may prove more relevant to human CNS structure and function than neuronal cells alone. Accordingly, we have developed an HCA assay for co-culture of neurons and astrocytes, comprised of protocols and validated, target-specific detection reagents for profiling &beta;III-tubulin and glial fibrillary acidic protein (GFAP). This assay enables simultaneous analysis of neurotoxicity, neurite outgrowth, gliosis, neuronal and astrocytic morphology and neuronal and astrocytic development in a wide variety of cellular models, representing a novel, non-subjective, high-throughput assay for neurotoxicity assessment. The assay holds great potential for enhanced detection of neurotoxicity and improved productivity in neuroscience research and drug discovery.

This article describes a novel protocol and reagent set designed for sensitive measurement of neurotoxic effects of compounds and treatments on co-cultures of neurons and astrocytes using high content analysis. Results demonstrate that high content analysis represents an exciting novel technology for neurotoxicity assessment.

A neuronales y astrocitos Co-cultivo de ensayo para el análisis de alto contenido de neurotoxicidad

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

An Optimized Protocol for Rearing Fopius arisanus, a Parasitoid of Tephritid Fruit Flies

Fopius arisanus (Sonan) is an important parasitoid of Tephritid fruit flies for at least two reasons. First, it is the one of only three opiine parasitoids known to infect the host during the egg stage1. Second, it has a wide range of potential fruit fly hosts. Perhaps due to its life history, F. arisanus has been a successfully used for biological control of fruit flies in multiple tropical regions2-4. One impediment to the wide use of F. arisanus for fruit fly control is that it is difficult to establish a stable laboratory colony5-9. Despite this difficulty, in the 1990s USDA researchers developed a reliable method to maintain laboratory populations of F. arisanus10-12. There is significant interest in F. arisanus biology13,14, especially regarding its ability to colonize a wide variety of Tephritid hosts14-17; interest is especially driven by the alarming spread of Bactrocera fruit fly pests to new continents in the last decade18. Further research on F. arisanus and additional deployments of this species as a biological control agent will benefit from optimizations and improvements of rearing methods. In this protocol and associated video article we describe an optimized method for rearing F. arisanus based on a previously described approach12. The method we describe here allows rearing of F. arisanus in a small scale without the use of fruit, using materials available in tropical regions around the world and with relatively low manual labor requirements.

An Optimized Protocol for Rearing Fopius arisanus, a Parasitoid of Tephritid Fruit Flies

Fopius arisanus is an egg-larval parasitoid of Tephritid fruit flies that is successfully used in biological control of these important tropical pests. We describe here an optimized protocol for rearing F. arisanus on a small scale using readily available materials.

Un protocolo optimizado para cría Fopius arisanus, Un parasitoide de moscas de fruta tefrítidas

Fopius arisanus (Sonan) is an important parasitoid of Tephritid fruit flies for at least two reasons. First, it is the one of only three opiine ...

Isolation and Biophysical Study of Fruit Cuticles

The cuticle, a hydrophobic protective layer on the aerial parts of terrestrial plants, functions as a versatile defensive barrier to various biotic and abiotic stresses and also regulates water flow from the external environment.1 A biopolyester (cutin) and long-chain fatty acids (waxes) form the principal structural framework of the cuticle; the functional integrity of the cuticular layer depends on the outer 'epicuticular' layer as well as the blend consisting of the cutin biopolymer and 'intracuticular' waxes.2 Herein, we describe a comprehensive protocol to extract waxes exhaustively from commercial tomato (Solanum lycopersicum) fruit cuticles or to remove epicuticular and intracuticular waxes sequentially and selectively from the cuticle composite. The method of Jetter and Sch&auml;ffer (2001) was adapted for the stepwise extraction of epicuticular and intracuticular waxes from the fruit cuticle.3,4 To monitor the process of sequential wax removal, solid-state cross-polarization magic-angle-spinning (CPMAS) 13C NMR spectroscopy was used in parallel with atomic force microscopy (AFM), providing molecular-level structural profiles of the bulk materials complemented by information on the microscale topography and roughness of the cuticular surfaces. To evaluate the cross-linking capabilities of dewaxed cuticles from cultivated wild-type and single-gene mutant tomato fruits, MAS 13C NMR was used to compare the relative proportions of oxygenated aliphatic (CHO and CH2O) chemical moieties.
Exhaustive dewaxing by stepwise Soxhlet extraction with a panel of solvents of varying polarity provides an effective means to isolate wax moieties based on the hydrophobic characteristics of their aliphatic and aromatic constituents, while preserving the chemical structure of the cutin biopolyester. The mechanical extraction of epicuticular waxes and selective removal of intracuticular waxes, when monitored by complementary physical methodologies, provides an unprecedented means to investigate the cuticle assembly: this approach reveals the supramolecular organization and structural integration of various types of waxes, the architecture of the cutin-wax matrix, and the chemical composition of each constituent. In addition, solid-state 13C NMR reveals differences in the relative numbers of CHO and CH2O chemical moieties for wild-type and mutant red ripe tomato fruits. The NMR techniques offer exceptional tools to fingerprint the molecular structure of cuticular materials that are insoluble, amorphous, and chemically heterogeneous. As a noninvasive surface-selective imaging technique, AFM furnishes an effective and direct means to probe the structural organization of the cuticular assembly on the nm-&mu;m length scale.

Aerial plant organs are protected by the cuticle, a supramolecular biopolyester-wax assembly. We present protocols to monitor selective removal of epi- and intracuticular waxes from tomato fruit cuticles on molecular and micro scales by solid-state NMR and atomic force microscopy, respectively, and to assess the cross-linking capacity of engineered cuticular biopolyesters.

El aislamiento y estudio biofísico de las cutículas de fruta

The cuticle, a hydrophobic protective layer on the aerial parts of terrestrial plants, functions as a versatile defensive barrier to various biotic and ...

Analysis of SNARE-mediated Membrane Fusion Using an Enzymatic Cell Fusion Assay

The interactions of SNARE (soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor) proteins on vesicles (v-SNAREs) and on target membranes (t-SNAREs) catalyze intracellular vesicle fusion1-4. Reconstitution assays are essential for dissecting the mechanism and regulation of SNARE-mediated membrane fusion5. In a cell fusion assay6,7, SNARE proteins are expressed ectopically at the cell surface. These "flipped" SNARE proteins drive cell-cell fusion, demonstrating that SNAREs are sufficient to fuse cellular membranes. Because the cell fusion assay is based on microscopic analysis, it is less efficient when used to analyze multiple v- and t-SNARE interactions quantitatively.
Here we describe a new assay8 that quantifies SNARE-mediated cell fusion events by activated expression of &beta;-galactosidase. Two components of the Tet-Off gene expression system9 are used as a readout system: the tetracycline-controlled transactivator (tTA) and a reporter plasmid that encodes the LacZ gene under control of the tetracycline-response element (TRE-LacZ). We transfect tTA into COS-7 cells that express flipped v-SNARE proteins at the cell surface (v-cells) and transfect TRE-LacZ into COS-7 cells that express flipped t-SNARE proteins at the cell surface (t-cells). SNARE-dependent fusion of the v- and t-cells results in the binding of tTA to TRE, the transcriptional activation of LacZ and expression of &beta;-galactosidase. The activity of &beta;-galactosidase is quantified using a colorimetric method by absorbance at 420 nm.
The vesicle-associated membrane proteins (VAMPs) are v-SNAREs that reside in various post-Golgi vesicular compartments10-15. By expressing VAMPs 1, 3, 4, 5, 7 and 8 at the same level, we compare their membrane fusion activities using the enzymatic cell fusion assay. Based on spectrometric measurement, this assay offers a quantitative approach for analyzing SNARE-mediated membrane fusion and for high-throughput studies.

We have developed a cell fusion assay that quantifies SNARE-mediated membrane fusion events by activated expression of &beta;-galactosidase.

Análisis de la fusión de la membrana SNARE mediada usando un ensayo de fusión celular enzimática

The interactions of SNARE (soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor)  proteins on vesicles (v-SNAREs) and on target membranes ...

Laboratory Protocol for Genetic Gut Content Analyses of Aquatic Macroinvertebrates Using Group-specific rDNA Primers

Analyzing food webs is essential for a better understanding of ecosystems. For example, food web interactions can undergo severe changes caused by the invasion of non-indigenous species. However, an exact identification of field predator-prey interactions is difficult in many cases. These analyses are often based on a visual evaluation of gut content or the analysis of stable isotope ratios (&#948;15N and &#948;13C). Such methods require comprehensive knowledge about, respectively, morphologic diversity or isotopic signature from individual prey organisms, leading to obstacles in the exact identification of prey organisms. Visual gut content analyses especially underestimate soft bodied prey organisms, because maceration, ingestion and digestion of prey organisms make identification of specific species difficult. Hence, polymerase chain reaction (PCR) based strategies, for example the use of group-specific primer sets, provide a powerful tool for the investigation of food web interactions. Here, we describe detailed protocols to investigate the gut contents of macroinvertebrate consumers from the field using group-specific primer sets for nuclear ribosomal deoxyribonucleic acid (rDNA). DNA can be extracted either from whole specimens (in the case of small taxa) or out of gut contents of specimens collected in the field. Presence and functional efficiency of the DNA templates need to be confirmed directly from the tested individual using universal primer sets targeting the respective subunit of DNA. We also demonstrate that consumed prey can be determined further down to species level via PCR with unmodified group-specific primers combined with subsequent single strand conformation polymorphism (SSCP) analyses using polyacrylamide gels. Furthermore, we show that the use of different fluorescent dyes as labels enables parallel screening for DNA fragments of different prey groups from multiple gut content samples via automated fragment analysis.

Most common gut content analyses of macroinvertebrates are visual. Requiring intense knowledge about morphological diversity of prey organisms, they miss soft bodied prey and, due to strong comminution of prey, are nearly impossible for some organisms, including amphipods. We provide detailed, novel genetic approaches for macroinvertebrate prey identification in the diet of amphipods.

Protocolo de laboratorio para análisis genéticos de contenido intestinal de macroinvertebrados acuáticos con grupo-específica rDNA cartillas

Analyzing food webs is essential for a better understanding of ecosystems. For example, food web interactions can undergo severe changes caused by the ...

Simple Homemade Tools to Handle Fruit Flies&#8212;Drosophila melanogaster

The fruit fly, Drosophila melanogaster, is widely used both in biological research and biology education. Handling adult flies is common but difficult in practice, as adult flies fly. Demonstrated here is how to make some simple and cost-effective tools to address difficult issues in the handling of Drosophila. Holes in foam stoppers are made and pipette tips or funnels are inserted into the holes. Flies then move only in one direction into the pipette tip/funnel assemblage, allowing efficient control of the transfer of adult Drosophila into or out of a vial. Existing protocols have been modified for cool-anesthetizing flies by chilling in crushed ice and transferring them onto a cold, hard icepack surface. The icepack is covered with a piece of medical gauze that keeps immobilized flies from the condensed water when examined under a stereomicroscope. The flies are finally euthanized for counting and sorting or discarded by microwaving. A bottle-shaped cage has also been developed for collecting eggs, as well as a labor-saving device and accompanying protocol for cleaning glass culture vials.

Simple Homemade Tools to Handle Fruit Flies&amp;#8212;&lt;em&gt;Drosophila melanogaster&lt;/em&gt;

Described here is the use of several homemade tools to transfer, chill, and kill adult Drosophila, as well as to clean glass culture vials and collect eggs. These tools are easy to make and are rather efficient in handling Drosophila.

Herramientas caseras simples para manejar moscas de la fruta—Drosophila melanogaster

The fruit fly, Drosophila melanogaster, is widely used both in biological research and biology education. Handling adult flies is common but difficult in ...

Topical Application Bioassay to Quantify Insecticide Toxicity for Mosquitoes and Fruit Flies

The continued use of insecticides for public health and agriculture has led to widespread insecticide resistance and hampering of control methods. Insecticide resistance surveillance of mosquito populations is typically done through Centers for Disease Control and Prevention (CDC) bottle bioassays or World Health Organization (WHO) tube tests. However, these methods can result in a high degree of variability in mortality data due to variable insecticide contact with&#160;the insect, the relatively small numbers of organisms tested, extensive variation in mass between populations, and constantly changing environmental conditions, leading to variable outcomes. This paper presents the topical application bioassay, adapted as a high-throughput phenotypic bioassay for both mosquitoes and fruit flies, to test large numbers of insects along&#160;a range of insecticide concentrations.
This assay 1) ensures consistent treatment and insecticide contact with every organism, 2) produces highly specific dose-response curves that account for differences in average mass between strains and sexes (which is particularly important for field-collected organisms), and 3) allows for the calculation of statistically rigorous median lethal doses (LD50), which are necessary for resistance ratio comparisons-an alternative surveillance approach from diagnostic dose mortality, which is also used for larvicide resistance surveillance. This assay will be a complementary tool for accurately phenotyping mosquito populations and, as illustrated using fruit flies, is easily adaptable for use with other insects. We argue that this assay will help fill the gap between genotypic and phenotypic insecticide resistance in multiple insect species.

We describe the methodology and importance of the topical application bioassay to measure insecticide susceptibility in mosquitoes and fruit flies. The presented assay is high-throughput, utilizes insect mass-thus allowing for calculating a mass-relativized lethal dose instead of concentration-and likely has lower variability than other similar methods.

Bioensayo de aplicación tópica para cuantificar la toxicidad de insecticidas para mosquitos y moscas de la fruta

The continued use of insecticides for public health and agriculture has led to widespread insecticide resistance and hampering of control methods. ...

Protocols for CRISPR/Cas9 Mutagenesis of the Oriental Fruit Fly Bactrocera dorsalis

The Oriental fruit fly, Bactrocera dorsalis, is a highly invasive and adaptive pest species that causes damage to citrus and over 150 other fruit crops worldwide. Since adult fruit flies have great flight capacity and females lay their eggs under the skins of fruit, insecticides requiring direct contact with the pest usually perform poorly in the field. With the development of molecular biological tools and high-throughput sequencing technology, many scientists are attempting to develop environmentally friendly pest management strategies. These include RNAi or gene editing-based pesticides that downregulate or silence genes (molecular targets), such as olfactory genes involved in searching behavior, in various insect pests. To adapt these strategies for Oriental fruit fly control, effective methods for functional gene research are needed. Genes with critical functions in the survival and reproduction of B. dorsalis serve as good molecular targets for gene knockdown and/or silencing. The CRISPR/Cas9 system is a reliable technique used for gene editing, especially in insects. This paper presents a systematic method for CRISPR/Cas9 mutagenesis of B. dorsalis, including the design and synthesis of guide RNAs, collecting embryos, embryo injection, insect rearing, and mutant screening. These protocols will serve as a useful guide for generating mutant flies for researchers interested in functional gene studies in B. dorsalis.

Protocols for CRISPR/Cas9 Mutagenesis of the Oriental Fruit Fly Bactrocera dorsalis

This paper presents the step-by-step protocols for CRISPR/Cas9 mutagenesis of the Oriental fruit fly Bactrocera dorsalis. Detailed steps provided by this standardized protocol will serve as a useful guide for generating mutant flies for functional gene studies in B. dorsalis.

Protocolos para la mutagénesis CRISPR/Cas9 de la mosca oriental de la fruta Bactrocera dorsalis

The Oriental fruit fly, Bactrocera dorsalis, is a highly invasive and adaptive pest species that causes damage to citrus and over 150 other fruit crops ...