Name: fruit volatile analysis using an electronic nose
Uploaded: 2012-03-30T13:00:00
Duration: 11 min 2 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fruit Volatile Analysis Using an Electronic Nose at JoVE.com

Författarna tackar Bill Klarar (Harris Moran Seed Company, Davis) för att ge melon frukt för denna analys. Projektet stöds av specialgrödor Research Initiative konkurrenskraftig Grants inte bevilja. 2009-51181-05783 från USDA National Institute of livsmedel och jordbruk.

1. Provberedning <ol><li> Harvest frukter i önskad mognad skede. Sköljning med kranvatten för att avlägsna smuts och damm. </li><li> Välj frukter för analys, baserade på frånvaron av yttre och inre defekter och storlek homogenitet. </li><li> Skär frukten i längdriktningen i klyftor som skall användas för flyktiga provtagning. I förekommande fall, ta bort skal, frön, utsäde hålrum vävnad eller grop. Frukt vävnaden val måste vara konsekvent genom hela experimentet och ta hänsyn till variationer i en enda frukt (dvs. få prov även från ekvatorn, blomma och stjälkdelar slut). </li><li> Kombinera den valda frukten vävnaden, blanda det för att slumpa den och sedan väger upp 200 g i en mixer. </li><li> Tillsätt 200 ml mättad CaCl2-lösning (372,5 g vid 20 ° C, i 500 ml avjoniserat vatten) och 50 pl av en 100 mM lösning av 2-metylbutyl isovalerat i metanol. Den CaCl 2 är tänkt att fungera som en hämmare av enzymatisk ACvitet, vilket kan inträffa efter skärning och homogenisering fruktköttet. 2-metylbutyl isovalerat tillsätts som en intern standard för att övervaka eventuella förluster av flyktiga ämnen under homogeniseringen processen. </li><li> Homogenisera blandning i en laboratorieblandare (Waring, USA), i 30 sekunder vid 18.000 rpm, sedan omedelbart häll glasflaska och tätning med Teflon lock. Hålla homogenatet i flaskan vid rumstemperatur tills alla prover framställes. </li><li> Efter hällning av homogenatet in i flaskan, vänta 10 minuter för att möjliggöra separation av skummet från vätskan, då pipetten 5 ml alikvoter av vätska, utan skum, i 20 ml glasflaska bärnsten små medicinflaskor och försegla flaskorna med lock stålskruv försedda med Teflon / silikon septa. Detta förfarande är lämpligt för melon och päron homogenat beredning. Om andra frukter används för analysen, kan ett centrifugeringssteg krävas. Därför, ta bort skummet och sedan centrifugera vätskan pellets partiklar som skulle kunnahindra pipett. Bered minst tre flaskor per prov för att tjäna som teknisk replikat. </li><li> Vid denna punkt kan proverna analyserades omedelbart eller snabbfrystes i flytande kväve och lagrades vid ultralåg temperatur (-80 ° C) för senare analys. </li><li> För frysta prover på analysen dagen ta prover från frysen och låt dem tina i en timme vid rumstemperatur. Efter upptining och före analys ska burkens lock med en ny som har en ren, torr septum. Om septumet inte ersätts, kan vatten kondenseras på skiljeväggen vid upptining dras in i instrumentet och skada den. </li></ol> 2. Gaskromatografi-ytakustisk Wave (GC-SAW) Set-up och Data Acquisition <ol><li> Ladda lämplig analysmetod på zNose. För analys av ester-rika flyktig profilen melon, våra parametrar i MicroSense versionen 5.44.22 mjukvara (Newbury Park, CA, USA) är som följer: gasutrymme sugning in iinlopp i 20 sekunder vid 30 ml min -1 via pump, inloppstemperatur vid 200 ° C, Tenax fällan temperatur vid 225 ° C, bärgas (helium renhet 99,999%) flöde på 2,9 ml min-1, kolonn (DB-5 kolonn, 1 m x 0,25 mm ID x 0,25 ^ m filmtjocklek) temperaturprogram från 45 ° C till 180 ° C vid en hastighet av 10 ° C sek -1; sensorn temperatur vid 40 ° C; ventil vid 165 ° C. Den totala analystiden är 1 minut per prov. </li><li> Ansluta en nål av rostfritt stål med icke borrande spets till zNose inlopp och rena systemet flera gånger med omgivande luft tills baslinjen är stabil och inga toppar är större än 200 räknevärden (Ct) detekteras. </li><li> Stämma instrumentet med användning av en lösning av rakkedjiga alkaner (C6-C14). I storleksordningen resultatet används som instrumentet mjukvara för att omvandla retentionstiden för de eluerade topparna från tidsenheter i Kovats index (Kl)-enheter. Följaktligen efter att systemet är inställd, är retentionstiderna redovisas i KI-enheter. </li&gt; <li> Före analys, så att provet uppnå jämvikt under 30 minuter. För att analysera ett av de prov flaskor, sätt en nål i flaskan septum för att lindra trycket. Sedan in nålen ansluten till instrumentet inloppet i flaskan septum och initiera headspace provtagning. Analysera minst tre tekniska replikat per prov. </li><li> Manuellt starta instrumentet genom att klicka på &quot;Play&quot;-knappen, pumpens aktiveras och drar bort ångorna närvarande över provet. Vid slutet av analysen visas ett kromatogram på skärmen, och sensorn automatiskt upphettas till 150 ° C under 10 sekunder för att rengöra den. När systemet statusrutan knappen blir grön igen är instrumentet redo att analysera ett annat prov. </li><li> För att säkerställa en stabil baslinje och korrekt system för rengöring, kör minst en luft tom mellan varje prov. För att övervaka för eventuella flyktiga föroreningar från flaskan och locket, analysera två flaska-ämnen (tomma flaskan med lock) i början och slutet av dagen. &lt;/ Li&gt; </ol> 3. Data Export och analys <ol><li> Exportera data till ett Microsoft Excel-fil efter förvärvet med &quot;Peak loggning&quot; funktionen i MicroSense programvara. När data exporteras, lägga till kolumner som innehåller etiketter för variabler och replikat. </li><li> Omvandla det dataformat för lättare hantering med hjälp av Python (version 2,6, fritt tillgänglig på nätet) script vi utvecklat, med namnet &quot;reform_data.py&quot; (se figur 1 för ett exempel på dataformat före och efter användning av skript &quot;reform_data. py &quot;). Namnet på källfilen (xls-format) och plåt namn för indata, liksom önskat filnamn för utdata (xls-format) är redigeras direkt i skriptet. </li><li> Starta &quot;kim_interface.py&quot; (även skrivet i Python 2,6, se figur 2) och importera data från filen som genereras i föregående steg. Närmare bestämt är analysen baserad på visa och analysera hur många gånger varje KI värde upptäckta(&quot;KI hits&quot;). Således programmet visar ett stapeldiagram över KI träffar för varje KI värde. </li><li> Utvärdera KI hits av specifika undergrupper av prover, analysera varje grupp av teknisk replikat tillsammans. För att göra detta, analysera varje behandling eller variabel separat genom att markera / avmarkera motsvarande rutor. Se figur 2 bildtext för detaljerad beskrivning av det grafiska användargränssnittet (GUI) funktioner. </li><li> Efter att ha identifierat bredden på varje KI fönstret med hjälp av GUI, slumpmässigt välja något av motsvarande kromatogrammen i Microsense program och utvärdera överlappande toppar bland tekniska replikat. Se figur 3 för ett exempel på överlagrade kromatogram av två tekniska replikat. </li><li> När KI fönstret individualiseras, använd &quot;Merge&quot;-funktionen tillgänglig i GUI att sammanföra KIs som faller i fönstret, i den mest befolkade KI. Genom att använda den här funktionen finns toppar märkta med en rad KI värden samman under ett och samma KI etikett, allowing behandla sådana toppar som en enda variabel. För att göra detta först klicka på &quot;Merge&quot; knappen för att aktivera funktionen och välja den mest befolkade KI som centrum av fönstret genom att vänsterklicka på motsvarande baren. När baren har valts, ändrar den färg och blir grön. Att slå samman KIs som faller inom fönstret i den valda KI, högerklicka på motsvarande stängerna, vilket gör att stängerna bli röd, medan en blå stapel av motsvarande längd läggs på toppen av den centrala KI (se figur 4 ). När alla de valda KIs har slagits samman till det lämpliga centrala KI, klicka på &quot;Merge&quot;-knappen igen för att acceptera ändringarna, vilket gör att &quot;Merge&quot; för att gulna. Vid fel, är &quot;unmerge&quot;-knappen också. För längre kommer, klicka på &quot;unmerge&quot; knappen i GUI, högerklicka på den röda baren som du vill unmerge. Från röd, blir stapeln blå. Klicka på &quot;unmerge&quot;-knappen igen för att acceptera ändringarna. </li><li> Om man försöker att incorrectly samman två toppar i ett enda prov till en enda KI värde är ett felmeddelande ut. Under sådana omständigheter, nära kontrollera kromatogrammet och omdefiniera KI fönstret i regionen. </li><li> När alla de fusionerande verksamheten har utförts, spara filen. </li><li> Innan statistisk analys är kromatogram i luften och ämnen injektionsflaska analyseras för att övervaka eventuella föroreningar. När väl KI av topparna i det att ämnena har identifierats, subtrahera arean av toppen detekteras i luft-och / eller ampull-ämnet från toppytan närvarande i provet. Fortsätt sedan med statistisk analys. </li></ol> 4. Representativa resultat Den elektroniska näsan kunde upptäcka skillnader i flyktiga profilerna bland melon frukt som skördats vid olika löptid stadier (Figur 5). Tjugo KI fönstren identifierades i alla prover. En analys av variansen visade att 14 toppar DeTected av den elektroniska näsan varierade kraftigt mellan mognad steg. I figur 6, är loggen för de genomsnittliga toppareorna av dessa 14 komponenter ritas för att visa skillnader i topp bestånd mellan två förfall steg, tidig mogna och helt mogen frukt. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/3821/3821fig1.jpg" /> Figur 1. Exempel på dataformatet som exporterats från instrumentets programvara (A) och efter transformation, som utförs med hjälp av &quot;reform_data.py&quot; script (B). För att underlätta datamanipulation och analys, är alla unika KIs identifierade i alla prover, sedan uppgifterna ordnas med prov information i rader och toppyta i kolumner, motsvarande unika KIs. Om en topp inte detekteras för ett Ki-värde i ett prov, förblir den motsvarande cellen tom. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/3821/3821fig2.jpg" /> Figur 2. Skärmdump från skrifternaT filen &quot;kim_interface.py&quot;. Handlingen i centrum visar antalet träffar per KI kontra KI. &quot;Hit per KI&quot; är det antal prover i vilka en topp med den specifika KI upptäcktes. På vänster sida finns tre gula rutor styr de valda uppgifterna. De visar parametrar för att dela upp datamängden (behandlingar, replikat, kvalitativa variabler, etc.). I denna figur är de (från topp till botten): Variety, plantering datum och Maturity stadium vid skörd. På botten: genom att klicka på 3 barer och flytta det blå fältet till vänster eller till höger, kan man välja den minsta och det högsta värdet på KI området, och den minsta topparean (Threshold &quot;). På höger: &quot;Sammanfoga&quot;-knappen kan samman utvalda KIs genom att manuellt klicka på staplarna i diagrammet. Den &quot;unmerge&quot;-knappen gör att man kan vända processen för utvalda fall. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/3821/3821fig3.jpg" /> Figur 3. Överlagrade kromatogram (i<html> svart och rött) av två tekniska replikat från melon flyktigt headspace för att illustrera en förändring i uppehållstid. <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/3821/3821fig4.jpg" /> Figur 4. Exempel på KI sammanslagning förfarandet. I den centrala tomten representerar det gröna fältet (Central KI) den mest befolkade KI, som har valts som centrum för KI fönstret. KI X och KI Y är KIs faller i fönstret av intresse och de behöver slås samman i den centrala KI. Genom att högerklicka på KI X bar, blir den röd och samtidigt visas ett blått fält av samma längd av KI X bar, på toppen av den gröna. Genom att upprepa samma procedur för KI Y, längden på det blå fältet (sammanslagna KIs) kommer att öka i motsvarande längd. När alla KIs har lagts genom att klicka på den gröna &quot;Merge&quot;-knappen, de fusionerande processen avslutas, sparas ändringarna, och knappen färgen blir gul. / Files/ftp_upload/3821/3821fig5.jpg &quot;/&gt; Figur 5. Två kromatogram av melon skördade vid olika löptider stadier, tidig mogen (överst) och helt mogna (botten), för att illustrera förmågan hos elektronisk näsa för att detektera skillnader i flyktiga tätheter. <img alt="Figur 6" src="/files/ftp_upload/3821/3821fig6.jpg" /> Figur 6. Radar diagram som visar topparean av 14 komponenter i två melon prov vid två olika löptider steg, tidig mogna och helt mogna. Toppareorna rapporteras i log-skala för att hjälpa visualisera jämförelse. Siffrorna i slutet av varje stråle representerar motsvarande Kovats Index.

<ol>
	<li>Kader, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flavor+quality+of+fruits+and+vegetables.">Flavor quality of fruits and vegetables.</a> Journal of the Science of Food and Agriculture. 88, 1863-1868 (2008).</li><li>Persaud, K., Dodd, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+discriminant+mechanisms+in+the+mammalian+olfactory+system+using+a+model+nose.">Analysis of discriminant mechanisms in the mammalian olfactory system using a model nose.</a> Nature. 299, 352-355 (1982).</li><li>Gardner, J. W., Bartlett, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+brief-history+of+electronic+noses.">A brief-history of electronic noses.</a> Sensors and Actuators. 18, 211-220 (1994).</li><li>Rock, F., Barsan, N., Weimar, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electronic+nose:+Current+status+and+future+trends.">Electronic nose: Current status and future trends.</a> Chem. Rev. 108, 705-725 (2008).</li><li>Li, C., Heinemann, P. H., Irudayaraj, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+apple+deterioration+using+an+electronic+nose+and+zNose.">Detection of apple deterioration using an electronic nose and zNose.</a> Transactions of the Asabe. 50, 1417-1425 (2007).</li><li>Li, Z. F., Wang, N., Raghavan, G. S. V., Vigneault, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ripeness+and+rot+evaluation+of+'Tommy+Atkins'+mango+fruit+through+volatiles+detection.">Ripeness and rot evaluation of 'Tommy Atkins' mango fruit through volatiles detection.</a> J. Food Eng. 91, 319-324 (2009).</li><li>Oh, S. Y., Ko, J. W., Jeong, S. Y., Hong, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+and+exploration+of+fast+gas+chromatography-surface+acoustic+wave+sensor+to+the+analysis+of+thymus+species.">Application and exploration of fast gas chromatography-surface acoustic wave sensor to the analysis of thymus species.</a> J. Chromatogr. A. 1205, 117-127 (2008).</li><li>Watkins, P., Wijesundera, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+zNose+for+the+analysis+of+selected+grape+aroma+compounds.">Application of zNose for the analysis of selected grape aroma compounds.</a> Talanta. 70, 595-601 (2006).</li><li>Gan, H. L., Man, Y. B. C., Tan, C. P., NorAini, I., Nazimah, S. A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+vegetable+oils+by+surface+acoustic+wave+sensing+electronic+nose.">Characterisation of vegetable oils by surface acoustic wave sensing electronic nose.</a> Food Chem. 89, 507-518 (2005).</li><li>Marina, A. M., Man, Y. B. C., Amin, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+the+SAW+Sensor+Electronic+Nose+for+Detecting+the+Adulteration+of+Virgin+Coconut+Oil+with+RBD+Palm+Kernel+Olein.">Use of the SAW Sensor Electronic Nose for Detecting the Adulteration of Virgin Coconut Oil with RBD Palm Kernel Olein.</a> Journal of the American Oil Chemists Society. 87, 263-270 (2010).</li><li>Evans, M. B., Haken, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+developments+in+the+gas-chromatographic+index+scheme.">Recent developments in the gas-chromatographic index scheme.</a> Journal of Chromatography. 472, 93-127 (1989).</li></ol>

Vi har inget att lämna ut.

Elektroniska näsor representerar en lovande metod för den snabba, objektiv utvärdering av arom profiler från frukter eller flyktiga-rika prover. Men har en förändrad uppehållstid utgör en utmaning för topp identifiering och kan leda till feltolkningar av data när två kromatogram inte är perfekt i linje. Visuell inspektion av kromatogram visade att variationen av retentionstiderna bland prover orsakas ofta samma topp som skall märkas med lite olika KI-värden (ca ± 10). Detta kan översättas till en överdriven antal unika upptäckta KIs. För att dra fördel av de fakta som (a) olika föreningar är närvarande vid olika löptid stadier och (b) tekniska replikerar är ungefär identiska två datorbaserade skript (&quot;kim_merge.py&quot;, som innehåller rutiner för hantering av data uppsättning, och &quot;kim_interface.py&quot;, som tillhandahåller ett grafiskt användargränssnitt (GUI)) har utvecklats för att systematisktjämföra prover i en halvautomatiserad sätt, vilket kraftigt minskar den tid som krävs för kromatogram analys av stora datamängder. Dessa program tillåter konsolidering, i förekommande fall, av topparna märkta med en rad KI värden under en enda KI etikett. Detta tjänar två viktiga syften: (a) den möjliggör en statistisk analys för att behandla sådana toppar som en enda variabel, och (b) den underlättar topp identifiering och jämförelse med andra system och publicerade värden. Resultat som presenteras här visar att melon prover skulle kunna diskrimineras på grundval av mognad och arom profilering med zNose i kombination med lämplig KI identifiering. Detta utgör en lovande ny teknik för analys av flyktiga ämnen som kan användas för program för kvalitetskontroll.

<table border="1"><tbody><tr><td> Namnet på reagens </td><td> Företaget </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentarer </td></tr><tr><td> Kalciumklorid </td><td> MP Biomedical </td><td> 195.088 </td><td></td></tr><tr><td> 2-metylbutyl isovalerat </td><td> SAFC Global </td><td> W350613 </td><td> ≥ 98%, naturlig, FCC </td></tr><tr><td> Metanol </td><td> Fisher Scientific </td><td> A411-4 </td><td></td></tr><tr><td> Ampull </td><td> Sigma / Supelco </td><td> SU860098 </td><td></td></tr><tr><td> Keps </td><td> Sigma / Supelco </td><td> SU860101 </td><td></td></tr><tr><td> Laboratorieblandare </td><td> Waring laboratorievetenskap </td><td> 7009G </td><td> 2-växlad mixer, 1 - Liter glasbehållare </td></tr><tr><td> Flaska </td><td> Fisher Scientific </td><td> 06-414-1C </td><td> Pyrex, 500 ml, polypropylen plug-Seal </td></tr><tr><td> Nål </td><td> Elektronisk Sensor Technology </td><td> TLC101046 </td><td> Sidohålet luer </td></tr><tr><td> Alkaner lösning </td><td> Elektronisk Sensor Technology </td><td></td><td> C6-C14 alkaner i metanol </td></tr><tr><td> zNose </td><td> Elektronisk Sensor Technology </td><td> Modell 4500 </td><td></td></tr><tr><td> DB-5 GC-kolonn </td><td> Elektronisk Sensor Technology </td><td> SYS4500C5 </td><td></td></tr><tr><td> MicroSense </td><td> Elektronisk Sensor Technology </td><td> Version 5.44.22 </td><td></td></tr><tr><td> Python 2,6 </td><td></td><td></td><td> Fritt tillgänglig on-line </td></tr><tr><td> &quot;Reform_data.py&quot; och &quot;kim_interface.py&quot; skript</td><td></td><td></td><td> Skript finns tillgängliga som kompletterande material på JUPITER </td></tr></tbody></table>

fruit volatile analysis using an electronic nose

Många och olika fysiologiska förändringar under fruktmognad, inklusive utvecklingen av en specifik flyktigt blandning som kännetecknar frukt arom. Mognad vid skörden är en av de viktigaste faktorer som påverkar smaken kvaliteten på frukt och grönsaker 1. Validering av robusta metoder som snabbt bedöma frukt mognad och arom kvaliteten skulle tillåta förbättrad förvaltning av avancerade avelsprogram, praxis produktion och efter skörd hantering. Under de senaste tre decennierna har mycket forskning gjorts för att utveckla så kallade elektroniska näsor, som är apparater som kan för att snabbt upptäcka lukter och smaker 2-4. För närvarande finns det flera kommersiellt tillgängliga elektroniska näsor kan utföra flyktiga analyser, baserade på olika tekniker. Den elektroniska näsan som används i vårt arbete (zNose, EST, Newbury Park, CA, USA), består av ultra-snabb gaskromatografi i kombination med en akustisk våg sensor (UFGC-SAW). Denna teknik har redan testats för sin förmåga att övervaka kvaliteten på olika varor, bland annat upptäcka försämringar i Apple 5, mognad och röta utvärdering mango 6, doft profilering av bräss arter 7, C 6 flyktiga föreningar i vindruvor 8; karakterisering av vegetabilisk olja 9 och upptäcka manipulationer i Virgin kokosolja 10. Detta system kan utföra de tre viktigaste stegen i doft analysen: headspace provtagning, separation av flyktiga föreningar och detektion. I ca en minut, matas utsignalen, ett kromatogram, som produceras och, efter en rening cykel, är instrumentet redo för ytterligare analys. De resultat som erhölls med zNose kan jämföras med dem för andra gas-kromatografiska system genom beräkning av Kovats Index (Kl). När instrumentet har avstämd med en alkan standardlösningen är retentionstiderna automatiskt omvandlas tillKI. Emellertid är små förändringar i temperatur och flödeshastighet förväntas inträffa med tiden, vilket orsakar retentionstider att glida. Också, beroende på polariteten hos kolonnen stationära fasen, kan reproducerbarheten av KI beräkningar variera med flera indexenheter 11. En serie program och grafiska gränssnitt har därför utvecklats för att jämföra beräknade KIs bland prov i ett semi-automatiserat sätt. Dessa program minska den tid som krävs för kromatogram analys av stora datamängder och minimera risken för feltolkning av data när kromatogrammen inte perfekt linje. Vi presenterar en metod för snabb flyktig förening analys i frukt. Provberedning, datainsamling och hantering, diskuteras också.

Watch this Scientific Journal Video about Fruit Volatile Analysis Using an Electronic Nose at JoVE.com

Fruit Volatile Analysis Using an Electronic Nose

En snabb metod för flyktig förening analys i frukt beskrivs. De flyktiga föreningar som föreligger i det övre utrymmet av ett homogenat av provet snabbt separeras och detekteras med en ultrasnabb gaskromatografi (GC) kopplad med en ytakustisk våg (SAW)-sensor. Ett förfarande för hantering av data och analys diskuteras också.

Frukt Flyktiga Analys Använda en elektronisk näsa

Numerous and diverse physiological changes occur during fruit ripening, including the development of a specific volatile blend that characterizes fruit ...

fruit-volatile-analysis-using-an-electronic-nose

Research

JoVE Journal

Biology

Studying Aggression in Drosophila (fruit flies)

Aggression is an innate behavior that evolved in the framework of defending or obtaining resources. This complex social behavior is influenced by genetic, hormonal and environmental factors. In many organisms, aggression is critical to survival but controlling and suppressing aggression in distinct contexts also has become increasingly important. In recent years, invertebrates have become increasingly useful as model systems for investigating the genetic and systems biological basis of complex social behavior. This is in part due to the diverse repertoire of behaviors exhibited by these organisms. In the accompanying video, we outline a method for analyzing aggression in Drosophila whose design encompasses important eco-ethological constraints. Details include steps for: making a fighting chamber; isolating and painting flies; adding flies to the fight chamber; and video taping fights. This approach is currently being used to identify candidate genes important in aggression and in elaborating the neuronal circuitry that underlies the output of aggression and other social behaviors.

Studying Aggression in Drosophila fruit flies

Studera Aggression i Drosophila (fruktflugor)

Aggression is an innate behavior that evolved in the framework of defending or obtaining resources.  This complex social behavior is influenced by ...

Homemade Site Directed Mutagenesis of Whole Plasmids

Site directed mutagenesis of whole plasmids is a simple way to create slightly different variations of an original plasmid. With this method the cloned target gene can be altered by substitution, deletion or insertion of a few bases directly into a plasmid. It works by simply amplifying the whole plasmid, in a non PCR-based thermocycling reaction. During the reaction mutagenic primers, carrying the desired mutation, are integrated into the newly synthesized plasmid. In this video tutorial we demonstrate an easy and cost effective way to introduce base substitutions into a plasmid. The protocol works with standard reagents and is independent from commercial kits, which often are very expensive. Applying this protocol can reduce the total cost of a reaction to an eighth of what it costs using some of the commercial kits. In this video we also comment on critical steps during the process and give detailed instructions on how to design the mutagenic primers.

Site directed mutagenesis of whole plasmids is a simple way to create slightly different variations of an original plasmid. Here we demonstrate an easy and cost effective way to introduce base substitutions into a plasmid using standard reagents.

Homemade Site Riktad mutagenes av Whole Plasmids

Site directed mutagenesis of whole plasmids is a simple way to create slightly different variations of an original plasmid. With this method the cloned ...

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing measurement of multiple cellular phenotypes within a single assay. In this study, we utilized HCA to develop a novel assay for neurotoxicity. Neurotoxicity assessment represents an important part of drug safety evaluation, as well as being a significant focus of environmental protection efforts. Additionally, neurotoxicity is also a well-accepted in vitro marker of the development of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's and Parkinson's diseases. Recently, the application of HCA to neuronal screening has been reported. By labeling neuronal cells with &beta;III-tubulin, HCA assays can provide high-throughput, non-subjective, quantitative measurements of parameters such as neuronal number, neurite count and neurite length, all of which can indicate neurotoxic effects. However, the role of astrocytes remains unexplored in these models. Astrocytes have an integral role in the maintenance of central nervous system (CNS) homeostasis, and are associated with both neuroprotection and neurodegradation when they are activated in response to toxic substances or disease states. GFAP is an intermediate filament protein expressed predominantly in the astrocytes of the CNS. Astrocytic activation (gliosis) leads to the upregulation of GFAP, commonly accompanied by astrocyte proliferation and hypertrophy. This process of reactive gliosis has been proposed as an early marker of damage to the nervous system. The traditional method for GFAP quantitation is by immunoassay. This approach is limited by an inability to provide information on cellular localization, morphology and cell number. We determined that HCA could be used to overcome these limitations and to simultaneously measure multiple features associated with gliosis - changes in GFAP expression, astrocyte hypertrophy, and astrocyte proliferation - within a single assay. In co-culture studies, astrocytes have been shown to protect neurons against several types of toxic insult and to critically influence neuronal survival. Recent studies have suggested that the use of astrocytes in an in vitro neurotoxicity test system may prove more relevant to human CNS structure and function than neuronal cells alone. Accordingly, we have developed an HCA assay for co-culture of neurons and astrocytes, comprised of protocols and validated, target-specific detection reagents for profiling &beta;III-tubulin and glial fibrillary acidic protein (GFAP). This assay enables simultaneous analysis of neurotoxicity, neurite outgrowth, gliosis, neuronal and astrocytic morphology and neuronal and astrocytic development in a wide variety of cellular models, representing a novel, non-subjective, high-throughput assay for neurotoxicity assessment. The assay holds great potential for enhanced detection of neurotoxicity and improved productivity in neuroscience research and drug discovery.

This article describes a novel protocol and reagent set designed for sensitive measurement of neurotoxic effects of compounds and treatments on co-cultures of neurons and astrocytes using high content analysis. Results demonstrate that high content analysis represents an exciting novel technology for neurotoxicity assessment.

En Neuronal och astrocyternas Co-Kultur-analys för High innehållsanalys av Neurotoxicitet

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

An Optimized Protocol for Rearing Fopius arisanus, a Parasitoid of Tephritid Fruit Flies

Fopius arisanus (Sonan) is an important parasitoid of Tephritid fruit flies for at least two reasons. First, it is the one of only three opiine parasitoids known to infect the host during the egg stage1. Second, it has a wide range of potential fruit fly hosts. Perhaps due to its life history, F. arisanus has been a successfully used for biological control of fruit flies in multiple tropical regions2-4. One impediment to the wide use of F. arisanus for fruit fly control is that it is difficult to establish a stable laboratory colony5-9. Despite this difficulty, in the 1990s USDA researchers developed a reliable method to maintain laboratory populations of F. arisanus10-12. There is significant interest in F. arisanus biology13,14, especially regarding its ability to colonize a wide variety of Tephritid hosts14-17; interest is especially driven by the alarming spread of Bactrocera fruit fly pests to new continents in the last decade18. Further research on F. arisanus and additional deployments of this species as a biological control agent will benefit from optimizations and improvements of rearing methods. In this protocol and associated video article we describe an optimized method for rearing F. arisanus based on a previously described approach12. The method we describe here allows rearing of F. arisanus in a small scale without the use of fruit, using materials available in tropical regions around the world and with relatively low manual labor requirements.

An Optimized Protocol for Rearing Fopius arisanus, a Parasitoid of Tephritid Fruit Flies

Fopius arisanus is an egg-larval parasitoid of Tephritid fruit flies that is successfully used in biological control of these important tropical pests. We describe here an optimized protocol for rearing F. arisanus on a small scale using readily available materials.

Ett optimerat protokoll för uppfödning Fopius arisanus Flugor ett parasitod av Tephritid frukt

Fopius arisanus (Sonan) is an important parasitoid of Tephritid fruit flies for at least two reasons. First, it is the one of only three opiine ...

Isolation and Biophysical Study of Fruit Cuticles

The cuticle, a hydrophobic protective layer on the aerial parts of terrestrial plants, functions as a versatile defensive barrier to various biotic and abiotic stresses and also regulates water flow from the external environment.1 A biopolyester (cutin) and long-chain fatty acids (waxes) form the principal structural framework of the cuticle; the functional integrity of the cuticular layer depends on the outer 'epicuticular' layer as well as the blend consisting of the cutin biopolymer and 'intracuticular' waxes.2 Herein, we describe a comprehensive protocol to extract waxes exhaustively from commercial tomato (Solanum lycopersicum) fruit cuticles or to remove epicuticular and intracuticular waxes sequentially and selectively from the cuticle composite. The method of Jetter and Sch&auml;ffer (2001) was adapted for the stepwise extraction of epicuticular and intracuticular waxes from the fruit cuticle.3,4 To monitor the process of sequential wax removal, solid-state cross-polarization magic-angle-spinning (CPMAS) 13C NMR spectroscopy was used in parallel with atomic force microscopy (AFM), providing molecular-level structural profiles of the bulk materials complemented by information on the microscale topography and roughness of the cuticular surfaces. To evaluate the cross-linking capabilities of dewaxed cuticles from cultivated wild-type and single-gene mutant tomato fruits, MAS 13C NMR was used to compare the relative proportions of oxygenated aliphatic (CHO and CH2O) chemical moieties.
Exhaustive dewaxing by stepwise Soxhlet extraction with a panel of solvents of varying polarity provides an effective means to isolate wax moieties based on the hydrophobic characteristics of their aliphatic and aromatic constituents, while preserving the chemical structure of the cutin biopolyester. The mechanical extraction of epicuticular waxes and selective removal of intracuticular waxes, when monitored by complementary physical methodologies, provides an unprecedented means to investigate the cuticle assembly: this approach reveals the supramolecular organization and structural integration of various types of waxes, the architecture of the cutin-wax matrix, and the chemical composition of each constituent. In addition, solid-state 13C NMR reveals differences in the relative numbers of CHO and CH2O chemical moieties for wild-type and mutant red ripe tomato fruits. The NMR techniques offer exceptional tools to fingerprint the molecular structure of cuticular materials that are insoluble, amorphous, and chemically heterogeneous. As a noninvasive surface-selective imaging technique, AFM furnishes an effective and direct means to probe the structural organization of the cuticular assembly on the nm-&mu;m length scale.

Aerial plant organs are protected by the cuticle, a supramolecular biopolyester-wax assembly. We present protocols to monitor selective removal of epi- and intracuticular waxes from tomato fruit cuticles on molecular and micro scales by solid-state NMR and atomic force microscopy, respectively, and to assess the cross-linking capacity of engineered cuticular biopolyesters.

Isolering och Biofysikalisk studie av frukt nagelband

The cuticle, a hydrophobic protective layer on the aerial parts of terrestrial plants, functions as a versatile defensive barrier to various biotic and ...

Analysis of SNARE-mediated Membrane Fusion Using an Enzymatic Cell Fusion Assay

The interactions of SNARE (soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor) proteins on vesicles (v-SNAREs) and on target membranes (t-SNAREs) catalyze intracellular vesicle fusion1-4. Reconstitution assays are essential for dissecting the mechanism and regulation of SNARE-mediated membrane fusion5. In a cell fusion assay6,7, SNARE proteins are expressed ectopically at the cell surface. These "flipped" SNARE proteins drive cell-cell fusion, demonstrating that SNAREs are sufficient to fuse cellular membranes. Because the cell fusion assay is based on microscopic analysis, it is less efficient when used to analyze multiple v- and t-SNARE interactions quantitatively.
Here we describe a new assay8 that quantifies SNARE-mediated cell fusion events by activated expression of &beta;-galactosidase. Two components of the Tet-Off gene expression system9 are used as a readout system: the tetracycline-controlled transactivator (tTA) and a reporter plasmid that encodes the LacZ gene under control of the tetracycline-response element (TRE-LacZ). We transfect tTA into COS-7 cells that express flipped v-SNARE proteins at the cell surface (v-cells) and transfect TRE-LacZ into COS-7 cells that express flipped t-SNARE proteins at the cell surface (t-cells). SNARE-dependent fusion of the v- and t-cells results in the binding of tTA to TRE, the transcriptional activation of LacZ and expression of &beta;-galactosidase. The activity of &beta;-galactosidase is quantified using a colorimetric method by absorbance at 420 nm.
The vesicle-associated membrane proteins (VAMPs) are v-SNAREs that reside in various post-Golgi vesicular compartments10-15. By expressing VAMPs 1, 3, 4, 5, 7 and 8 at the same level, we compare their membrane fusion activities using the enzymatic cell fusion assay. Based on spectrometric measurement, this assay offers a quantitative approach for analyzing SNARE-mediated membrane fusion and for high-throughput studies.

We have developed a cell fusion assay that quantifies SNARE-mediated membrane fusion events by activated expression of &beta;-galactosidase.

Analys av SNARE-medierad membran fusion Använda en enzymatisk analys Cellfusion

The interactions of SNARE (soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor)  proteins on vesicles (v-SNAREs) and on target membranes ...

Laboratory Protocol for Genetic Gut Content Analyses of Aquatic Macroinvertebrates Using Group-specific rDNA Primers

Analyzing food webs is essential for a better understanding of ecosystems. For example, food web interactions can undergo severe changes caused by the invasion of non-indigenous species. However, an exact identification of field predator-prey interactions is difficult in many cases. These analyses are often based on a visual evaluation of gut content or the analysis of stable isotope ratios (&#948;15N and &#948;13C). Such methods require comprehensive knowledge about, respectively, morphologic diversity or isotopic signature from individual prey organisms, leading to obstacles in the exact identification of prey organisms. Visual gut content analyses especially underestimate soft bodied prey organisms, because maceration, ingestion and digestion of prey organisms make identification of specific species difficult. Hence, polymerase chain reaction (PCR) based strategies, for example the use of group-specific primer sets, provide a powerful tool for the investigation of food web interactions. Here, we describe detailed protocols to investigate the gut contents of macroinvertebrate consumers from the field using group-specific primer sets for nuclear ribosomal deoxyribonucleic acid (rDNA). DNA can be extracted either from whole specimens (in the case of small taxa) or out of gut contents of specimens collected in the field. Presence and functional efficiency of the DNA templates need to be confirmed directly from the tested individual using universal primer sets targeting the respective subunit of DNA. We also demonstrate that consumed prey can be determined further down to species level via PCR with unmodified group-specific primers combined with subsequent single strand conformation polymorphism (SSCP) analyses using polyacrylamide gels. Furthermore, we show that the use of different fluorescent dyes as labels enables parallel screening for DNA fragments of different prey groups from multiple gut content samples via automated fragment analysis.

Most common gut content analyses of macroinvertebrates are visual. Requiring intense knowledge about morphological diversity of prey organisms, they miss soft bodied prey and, due to strong comminution of prey, are nearly impossible for some organisms, including amphipods. We provide detailed, novel genetic approaches for macroinvertebrate prey identification in the diet of amphipods.

Laboratoriet protokoll för genetiska Gut innehåll analyser av vattenlevande Macroinvertebrates använda gruppspecifika rDNA grundfärger

Analyzing food webs is essential for a better understanding of ecosystems. For example, food web interactions can undergo severe changes caused by the ...

Simple Homemade Tools to Handle Fruit Flies&#8212;Drosophila melanogaster

The fruit fly, Drosophila melanogaster, is widely used both in biological research and biology education. Handling adult flies is common but difficult in practice, as adult flies fly. Demonstrated here is how to make some simple and cost-effective tools to address difficult issues in the handling of Drosophila. Holes in foam stoppers are made and pipette tips or funnels are inserted into the holes. Flies then move only in one direction into the pipette tip/funnel assemblage, allowing efficient control of the transfer of adult Drosophila into or out of a vial. Existing protocols have been modified for cool-anesthetizing flies by chilling in crushed ice and transferring them onto a cold, hard icepack surface. The icepack is covered with a piece of medical gauze that keeps immobilized flies from the condensed water when examined under a stereomicroscope. The flies are finally euthanized for counting and sorting or discarded by microwaving. A bottle-shaped cage has also been developed for collecting eggs, as well as a labor-saving device and accompanying protocol for cleaning glass culture vials.

Simple Homemade Tools to Handle Fruit Flies&amp;#8212;&lt;em&gt;Drosophila melanogaster&lt;/em&gt;

Described here is the use of several homemade tools to transfer, chill, and kill adult Drosophila, as well as to clean glass culture vials and collect eggs. These tools are easy to make and are rather efficient in handling Drosophila.

Enkel hemlagad verktyg för att hantera bananflugor-Drosophila melanogaster

The fruit fly, Drosophila melanogaster, is widely used both in biological research and biology education. Handling adult flies is common but difficult in ...

Topical Application Bioassay to Quantify Insecticide Toxicity for Mosquitoes and Fruit Flies

The continued use of insecticides for public health and agriculture has led to widespread insecticide resistance and hampering of control methods. Insecticide resistance surveillance of mosquito populations is typically done through Centers for Disease Control and Prevention (CDC) bottle bioassays or World Health Organization (WHO) tube tests. However, these methods can result in a high degree of variability in mortality data due to variable insecticide contact with&#160;the insect, the relatively small numbers of organisms tested, extensive variation in mass between populations, and constantly changing environmental conditions, leading to variable outcomes. This paper presents the topical application bioassay, adapted as a high-throughput phenotypic bioassay for both mosquitoes and fruit flies, to test large numbers of insects along&#160;a range of insecticide concentrations.
This assay 1) ensures consistent treatment and insecticide contact with every organism, 2) produces highly specific dose-response curves that account for differences in average mass between strains and sexes (which is particularly important for field-collected organisms), and 3) allows for the calculation of statistically rigorous median lethal doses (LD50), which are necessary for resistance ratio comparisons-an alternative surveillance approach from diagnostic dose mortality, which is also used for larvicide resistance surveillance. This assay will be a complementary tool for accurately phenotyping mosquito populations and, as illustrated using fruit flies, is easily adaptable for use with other insects. We argue that this assay will help fill the gap between genotypic and phenotypic insecticide resistance in multiple insect species.

We describe the methodology and importance of the topical application bioassay to measure insecticide susceptibility in mosquitoes and fruit flies. The presented assay is high-throughput, utilizes insect mass-thus allowing for calculating a mass-relativized lethal dose instead of concentration-and likely has lower variability than other similar methods.

Aktuell applikationsbioassay för att kvantifiera insekticidtoxicitet för myggor och fruktflugor

The continued use of insecticides for public health and agriculture has led to widespread insecticide resistance and hampering of control methods. ...

Protocols for CRISPR/Cas9 Mutagenesis of the Oriental Fruit Fly Bactrocera dorsalis

The Oriental fruit fly, Bactrocera dorsalis, is a highly invasive and adaptive pest species that causes damage to citrus and over 150 other fruit crops worldwide. Since adult fruit flies have great flight capacity and females lay their eggs under the skins of fruit, insecticides requiring direct contact with the pest usually perform poorly in the field. With the development of molecular biological tools and high-throughput sequencing technology, many scientists are attempting to develop environmentally friendly pest management strategies. These include RNAi or gene editing-based pesticides that downregulate or silence genes (molecular targets), such as olfactory genes involved in searching behavior, in various insect pests. To adapt these strategies for Oriental fruit fly control, effective methods for functional gene research are needed. Genes with critical functions in the survival and reproduction of B. dorsalis serve as good molecular targets for gene knockdown and/or silencing. The CRISPR/Cas9 system is a reliable technique used for gene editing, especially in insects. This paper presents a systematic method for CRISPR/Cas9 mutagenesis of B. dorsalis, including the design and synthesis of guide RNAs, collecting embryos, embryo injection, insect rearing, and mutant screening. These protocols will serve as a useful guide for generating mutant flies for researchers interested in functional gene studies in B. dorsalis.

Protocols for CRISPR/Cas9 Mutagenesis of the Oriental Fruit Fly Bactrocera dorsalis

This paper presents the step-by-step protocols for CRISPR/Cas9 mutagenesis of the Oriental fruit fly Bactrocera dorsalis. Detailed steps provided by this standardized protocol will serve as a useful guide for generating mutant flies for functional gene studies in B. dorsalis.

Protokoll för CRISPR/Cas9 Mutagenes av den orientaliska bananflugan Bactrocera dorsalis

The Oriental fruit fly, Bactrocera dorsalis, is a highly invasive and adaptive pest species that causes damage to citrus and over 150 other fruit crops ...