Name: determination of mammalian cell counts, cell size and cell health using the moxi z mini automated cell counter
Uploaded: 2012-06-21T12:00:00
Duration: 13 min 16 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Determination of Mammalian Cell Counts, Cell Size and Cell Health Using the Moxi Z Mini Automated Cell Counter at JoVE.com

1. Fremstillinq af prøver <ol><li> Fortyndes cellesuspensionen med ORFLO fortyndingsmiddel eller en egnet fortyndingsmiddel, således at cellekoncentrationen er inden for rækkevidde af instrumentet (3000 til 500.000 celler / ml for type M-kassetten, eller 3.000 til 2.500.000 celler / ml for type S kassette). </li><li> En fortynding på 1:5 til 1:20 (type M-kassette) eller ingen fortynding 1:05 fortynding (type S-kassette) anbefales for de fleste mammale cellelinier, men den passende fortynding, vil afhænge af celletypen og podningstæthed. Det volumen, der kræves for at en nøjagtig optælling er ca 75 uL. </li></ol> 2. Running Prøver <ol><li> Drej Moxi Z ved at trykke på afbryderknappen og startskærmen vises. </li><li> Tryk på bakken ned og indsætte en kassette i Moxi Z. afpipetteres 75μL Sample ... skærmen vil blive vist. </li><li> Afpipetteres en 75 pi prøve i fyldeporten af ​​kassetten (blå ovalmærket 1 eller 2, afhængigt af, hvilken ende af kassetten blev indsat i instrumentet). Disse er engangs kassetter, som kan anvendes for 2 afprøvninger. Bemærk: Anbring pipettespidsen direkte til belastningen godt ved ~ 45 ° vinkel, så at spidsen er fanget under den forreste læbe af brønden. Ved afgivelse, er det vigtigt, at vakuumet ikke &quot;komme foran&quot; af afgivelse af fluidet, som kan forårsage lommer af luft ind i kassetten. Det anbefales at have en lille kugle (størrelse ind brønd) i flydende form i brønden under dispensering. </li><li> For at tælle de fleste mammale celler, trykke på skærmen sted at starte. Til tælling meget små partikler (4 til 8 um gennemsnitlig diameter for type M og 3-8 um gennemsnitlig diameter for Type S) kan Moxi Z drives i Small Particle tilstand. Bemærk: kasettetypen er angivet i den sorte øverst på skærmen. I denne tilstand, sætter Moxi Z diameteren skalaen til 2 til 10 um som standard og udfører tæller usynge optimerede parametre til påvisning af små celler. Tryk på TOUCH HER lille partikel Mode-knappen (sort firkant) at indlede testen og køre i denne tilstand. </li><li> Den Moxi Z vil begynde testen og celletallet resultaterne vil være komplet i ca 8 sekunder (type M kassette) eller 15 sekunder (Type S kassette). </li><li> Den kurvetilpasning og MVI beregninger starter automatisk og kræver kun et par ekstra sekunder. Når en passende tilpasning er fundet, vil resultaterne derefter automatisk blive vist på skærmen. </li><li> For at gøre Indløbs standard købet skal du trykke på kurvetilpasningen Count knappen for at skifte til Indløbs mode. </li><li> På dette tidspunkt kassetten kan fjernes fra apparatet. </li></ol> 3. Håndtering af data <ol><li> Hvis auto skalering er slukket, er resultaterne i første omgang vises i en kurvetilpasning regne med en diameter skala fra 2-34 um (Type M kassette) eller 2-26 μm (type S-kassette). Hvis auto skalering er aktiveret, så Moxi Z automatisk skalere den vandrette akse (x-akse) for det område, der er tættest på bredden af den kurve-tilpasning populationen samtidig alle kurve-fit data vises. </li><li> Hvis auto skalering er slukket, manuelt at vise resultaterne i en højere opløsning, skal du trykke på 2-26 um ikonet (Type M) eller 2-18 um ikonet (type S). Bemærk: kasettetypen er angivet i den blå boks øverst til venstre på skærmen. Dette anbefales, når tæller mindre celler eller partikler for at forbedre både kurve-tilpassede funktioner samt brugerens evne til visuelt at skelne nuancer af data. </li><li> Ved at øge den horisontale opløsning, vil skaleringen knappen dynamisk tilpasser sig mulighed for at cykle mellem de tilgængelige x-aksens skala intervaller: 2-34 og 2-26 og 2-18 og 2-10 um for Type M kassette eller 2 -26, 2-18, og 2-10 um for Type S kassetten. Denne funktion er kun availawas umiddelbart efter en celletælling. </li><li> Tæl information (celler / ml) for kurven-fit eller gated region vises i en sort boks under den venstre side af histogrammet. Betyder cellestørrelse information vises i den sorte kasse i højre side af histogrammet. </li><li> Den MVI værdi vises en blå boks øverst til højre i histogrammet. Hvis testen blev kørt i små partikler tilstand, betyder MVI ikke anvendelse, og vil blive vist som &quot;MVI = SPM&quot;. Derudover hvis koncentrationen af ​​celler er uden for MVI driftsområde, et budskab om &quot;MVI = Out of Range&quot; vil blive vist. </li><li> For at gemme den aktuelle histogrammet, røre Udført ikonet. Denne gemmer data med et navn &quot;Test XXX&quot; hvor XXX er den tilsvarende test nummer. </li><li> Hvis du manuelt gate histogrammet, for at slå Curve Fit tæller resultater knap røre. Dette gør Indløbs standard dataopsamling. Skub derefter hvert blå gating markør for at indstille portene eller tryk the venstre og højre pile (disse vises ved at røre den blå gating markør) for fine gate reguleringer kun de celler, mellem markørerne tælles. Histogrammet vertikal skala skaleres automatisk baseret på kurven-fit population amplitude. For at justere denne lodrette skala, skubbe skærmen op eller ned i histogrammet regionen. </li><li> Tryk på Gated Count resultater knappen for at vende tilbage til skærmbilledet kurvetilpasningen tilstand og gøre kurvetilpasning tilstand standard dataopsamling. </li><li> Tryk derefter på Udført ikonet for at gemme resultaterne og vende tilbage til startskærmen. Hvis du vil slette resultaterne, skal du trykke på Delete-ikonet til enhver tid for permanent at slette resultaterne af testen. </li></ol> 4. Analyse af tidligere indsamlede data <ol><li> For at åbne en gemt test, skal du trykke på Histogram ikonet på startskærmen. </li><li> Ikoner for op til ni gemte histogrammerne vil blive vist på skærmen.Tryk på ikonet for testen af interesse, eller tryk på Page Up eller Page Down ikoner for at se flere testresultater. </li><li> Hvert histogram vil blive åbnet i enten Curve Fit Count tilstand eller Gated Grev tilstand, afhængigt af hvordan det blev gemt. I Gated Grev tilstand, kan gating markører placeres som ønsket ved at skubbe den enkelte blå gating mærke uafhængigt af hinanden. Auto Gate ved at trykke på den ønskede peak. Tryk for at skifte mellem Gated Greven og kurvetilpasning Måletilstande. </li><li> Tryk på Zoom og Unzoom ikoner til at justere den lodrette skala i histogrammet. Den vertikale skala kan også ændres ved vertikalt at føre en finger på displayet op (for at øge) eller nedad (for at formindske). </li><li> Tryk på ikonet Slet for permanent at slette resultaterne af testen. </li><li> Tryk på Udført ikonet for atlukke testresultater og vende tilbage til startskærmen. (Bemærk: zoomet billede vil ikke blive gemt.) </li></ol> 5. Overførsel af data til en pc <ol><li> Data kan overføres til en pc ved hjælp af Orflo Moxichart ansøgningen eller via USB-overførsel ved at sætte Moxi Z USB-kabel til en PC eller Mac. For Bluetooth overførsel (MoxiChart), først bestemme enhedens Bluetooth-ID ved at trykke på Bluetooth-ikonet på startskærmen af Moxi Z enheden. </li><li> På computeren, skal du åbne MoxiChart programmet og klik på Bluetooth-ikonet i øverste højre hjørne. Derefter vælge den enhed, der svarer til Bluetooth-id Moxi Z og vælge en destinationsmappe for de uploadede filer. </li><li> Moxichart automatisk overføre alle filerne til den angivne mappe via Bluetooth-forbindelsen. </li><li> Filer, der overføres via Bluetooth (MoxiChart) eller USB, kan åbnes og analyserZed direkte med MoxiChart ansøgningen, eller fordi de er formateret. csv-filer, kan de direkte åbnes i Microsoft Excel eller andre dataanalyse programmer for yderligere / custom analyse. </li></ol> 6. Repræsentative resultater For at vurdere præcision og nøjagtighed af Moxi Z, tællinger af HEK-293, HeLa-celler, CHO-K1, gær, Jurkat E6-1 celler, PC12 celler og præcisions-kalibreret perle suspensioner med koncentrationer fra 0-500,000 celler / ml (type M-kassette) og 0-2-2.5E 6 celler / ml (type S-kassette) blev talt og sammenlignet med en Coulter Z2 og Moxi Z. Alle pattedyrceller blev opnået fra American Type Culture Collection (ATCC) og dyrket som tidligere beskrevet 7-11. Kort fortalt blev celler dyrket i suspension i 75 mm 2 vævskulturkolber med kerne medier i RPMI 1640 (Jurkat E6-1, PC12), MEM (HEK-293, HeLa-celler) eller F12K (CHO-K1-celler). Alle medier blev suppleret med10% føtalt bovint serum og 100 U penicillin/100 ug streptomycin. Kolberne blev holdt i en inkubator ved 37 ° C med 5% CO2. Cellerne blev passeret hver 3. dag. Gærceller (X5, C. albicans, Vin 13) blev doneret og anvendt straks som angivet. Oprindelige stikprøve koncentrationer på ~ 500.000 celler / ml for de Type M kassette data og ~ 2-2.5e 6 celler / ml for Type S kassetten blev etableret ved brug af Coulter Z2. Efterfølgende teoretiske koncentrationsniveauer blev fremstillet ved serielle fortyndinger med fysiologiske puffere (Isoton II eller Hanks Balanced Salt Solution). Ved hver koncentration, blev identiske prøver målt ved begge systemer og plottet mod hinanden. Som det ses i figur 2, var der en stærk lineær korrelation (Type M r2&gt; 0,9886, type S r2&gt; 0,9781) mellem tællingerne for alle prøver. Koncentrationer blev også sammenlignet med de forventede / teoretisk cellekoncentrationer med både Moxi Z og Z2 ( <strOng&gt; figur 3) og igen viste kraftig lineære korrelationer (Type M r2&gt; 0,9758, type S r2&gt; 0,9774). At vurdere præcision blev HEK-293-og HeLa-celletal udført under anvendelse af Coulter Z2, Moxi Z og et hæmocytometer. Den gennemsnitlige variationskoefficient (CV, n = 19) af celletællinger ved hjælp af Moxi Z (type M-kassette), Coulter Z2 og et hæmocytometer blev beregnet med CV er målt fra 5 separate tællinger i 200.000-300.000 celler / ml området. Den lille gennemsnitlige CV (Figur 4) i Moxi Z er sammenlignelig med Z2 og er repræsentativ for den høje grad af præcision, kun kan opnås med Coulter-baserede tælle teknologier. Dimensionering præcision Moxi Z instrument blev evalueret ud gennem måling af indkøbte, præcision kalibrerede polystyrenkugler. Midlede partikelstørrelsesmålinger (n = 5) fra Moxi Z er plottet mod producentens rapporteret størrelser. Som det kan ses in Figur 5 er Moxi Z målingerne konsekvent matchede producentens med en høj lineær korrelation (r 2 = 0,9989). Ud over størrelse og antal oplysninger, giver Moxi Z et reagens-fri, generel vurdering af pattedyrcellekultur sundhed med en rapporteret Moxi Levedygtighed Index (MVI) værdi. Dette indeks genereres fra et forhold mellem antallet af celler i populationen af ​​interesse med hensyn til de samlede partikelformige tællinger. For at demonstrere de MVI målekapaciteten, blev MVI aflæsninger (Type M kassette) sammenlignet med standard manuel og flowcytometriske levende / død måleteknikker. Populationer af døde (&lt;10% levedygtige) HEK-293-og HeLa-celler blev skabt ved natten inkubationer af de levende celler i en næringsstof-fri, natriumfluorid indeholdende fortyndingsmiddel (Isoton II, Beckman Coulter) ved 37 ° C. Kontrollerede teoretiske levedygtighed niveauer blev fremstillet ved ratiometrically blande kendte koncentrationer af levende og døde celler. Resulting løsninger blev analyseret for rentabilitet niveauer i to eksemplarer med både hæmocytometer tæller og flowcytometer målinger. Hæmocytometer målinger blev foretaget under anvendelse af en traditionel 50/50 blanding af 0,1% Trypan Blue Solution og celler. Flow-cytometriske målinger blev foretaget under anvendelse af en Guava PCA-cytometer (Merck) ved anvendelse af Viacount reagens og fabrikanten-specificeret protokol (Merck). Som vist i figur 6, er Pearson korrelation koefficientværdierne (R2) &quot;af den lineære tilpasning af MVI data til analoge hæmocytometer levedygtighed procentdele for&quot; HEK-celler og HeLa-celler blev r2 = 0,9937 og R2 = 0,9728, henholdsvis. Disse resultater viser, at denne fremgangsmåde giver kultur sundhedsinformationer tværs af en bred vifte af celler levedygtighed, som tåler sammenligning med Live / Dead målinger opnået under anvendelse af en flow-cytometer og hæmocytometer. Tabeller og Tal (Fra Dittami et al, 2011.) 15: Figur 1. Tyndfilms Coulter-tælning: Elektrisk strøm ledes gennem cellen følezonen i tynd-film kassette. Som celler flyde gåsegang gennem CSZ, er de momentane stigninger i spænding målt ved Moxi Z. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/3842/3842fig2.jpg" /> Figur 2. Moxi Z tæller er sammenlignelige med Coulter Z2 tællinger. Identiske tællinger af celle-og vulsten suspensioner blev talt under anvendelse af både en Coulter Z2 og Moxi Z. gennemsnit af tælleværdier (n = 3-4) af Moxi Z tællinger blev afbildet i forhold til Coulter tilsvarende Z2 tæller og R2 værdier lineære fit blev bestemt. A) Type M kassette - koncentrationsområde på 0 - 500.000 celler / ml. B) Type S kassette - koncentrationsområde på 0 - 2-2.5e 6 / ml.Error Barer angiver ± 1 standardafvigelse. Figur 3. Moxi Z koncentrationsmålinger kontra teoretiske celle koncentrationer. A) Type M kassette - teoretiske koncentrationsværdier blev fremstillet ud fra seriefortyndinger af et indledende 500.000 celler / ml prøve B) Type S kassette -. Teoretiske koncentration værdier blev fremstillet ud fra seriefortyndinger af en initial 2 - 2.5E 6 celler / ml prøve. Fejllinjer angiver ± 1 standardafvigelse. <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/3842/3842fig4.jpg" /> Figur 4. Variationskoefficient for den Coulter Z2, Moxi Z (Type M kassette), og hæmocytometer. Den gennemsnitlige variationskoefficient (CV, n = 19) af HEK-293 og HeLa celletal for hver tilgang blev beregnet med CV&#39;er målt fra 5 separate tællinger af HEK-293-og HeLa-celler i 200.000 - 300.000 celler / ml området. Fejllinjer angiver ± 1 standardafvigelse. Figur 5. Præcision af partikelstørrelse målinger ved hjælp af Moxi Z-Moxi Z målt perle størrelse (Type M kassette) vs producent rapporteret perle størrelse. Fejllinjer angiver ± 1 standardafvigelse. <img alt="Figur 6" src="/files/ftp_upload/3842/3842fig6.jpg" /> Figur 6. Kultur Sundhedsvurdering hjælp MVI - Sammenligning af MVI målinger (Type M kassette) og Guava PCA Viacount levedygtighed versus visuelle, Trypan-blå farvede levedygtighedstællinger ved hjælp af en hæmocytometer.

<ol>
	<li>Fernyhough, M. E., Helterline, D. L., Vierck, J. L., Hill, R. A., Dodson, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coulter+counter+use+in+the+enumeration+of+muscle+and+fat+stem+cells.">Coulter counter use in the enumeration of muscle and fat stem cells.</a> Methods. Cell. Sci. 25, 221-225 (2003).</li><li>Blades, A. N., Flavell, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observations+on+the+use+of+the+Coulter+model+D+electronic+cell+counter+in+clinical+haematology.">Observations on the use of the Coulter model D electronic cell counter in clinical haematology.</a> J. Clin. Pathol. 16, 158-163 (1963).</li><li>Morris, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle+Size+Analysis+of+Beer+Solids+using+a+Coulter+Counter.">Particle Size Analysis of Beer Solids using a Coulter Counter.</a> J. Inst. Brew. 90, 162-166 (1984).</li><li>Marth, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electronic+Somatic+Cell+Counting+Procedure.">Electronic Somatic Cell Counting Procedure.</a> Standard Methods for the Examination of Dairy Products. , 134-140 (1978).</li><li>Parks, L. R., Jurbergs, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Number+and+size+distribution+of+particles+in+cellulosic+solutions.">Number and size distribution of particles in cellulosic solutions.</a> J. Appl. Polym. Sci. 11, 193-199 (1960).</li><li>Davis, R. E., Green, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+platelet+counting+with+the+Couler+particle+counter.">Automatic platelet counting with the Couler particle counter.</a> J. Clin. Pathol. 20, 777-779 (1967).</li><li>Dittami, G. D., Rabbitt, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrically+evoking+and+electrochemically+resolving+quantal+release+on+a+microchip.">Electrically evoking and electrochemically resolving quantal release on a microchip.</a> Lab on a Chip. 10, 30-35 (2010).</li><li>Nahreini, P., Hanson, A., Prasad, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-yield+production+of+recombinant+antibody+fragments+in+HEK-293+cells+using+sodium+butyrate.">High-yield production of recombinant antibody fragments in HEK-293 cells using sodium butyrate.</a> BioTechiques. 34, 968-972 (2003).</li><li>Escuyer, V., Collier, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anthrax+Protective+Antigen+Interacts+with+a+Specific+Receptor+on+the+surface+of+CHO-K1+Cells.">Anthrax Protective Antigen Interacts with a Specific Receptor on the surface of CHO-K1 Cells.</a> Infection and Immunity. 59, 3381-3386 (1991).</li><li>Isaacs, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Borrelia+bugdorferi+bind+to+epithelial+cell+proteoglycans.">Borrelia bugdorferi bind to epithelial cell proteoglycans.</a> J. Clin. Invest. 93, 809-819 (1994).</li><li>Saito, Y., Takahashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+selenoprotein+P+as+a+selenium+supply+protein.">Characterization of selenoprotein P as a selenium supply protein.</a> Eur. J. Biochem. 269, 5746-5751 (2002).</li><li>Kataoka, S., Tsuruo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physician+Education:+Apoptosis.">Physician Education: Apoptosis.</a> Oncologist. 1, 399-401 (1996).</li><li>Liegler, T. J., Hyun, W., Yen, T. S., Stites, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+quantification+of+live,+apoptotic,+and+necrotic+human+peripheral+lymphocytes+by+single-laser+flow+cytometry.">Detection and quantification of live, apoptotic, and necrotic human peripheral lymphocytes by single-laser flow cytometry.</a> Clin. Diagn. Lab Immunol. 2, 369-376 (1995).</li><li>Sheridan, J. W., Bishop, C. J., Simmons, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biophysical+and+morphological+correlates+of+kinetic+change+and+death+in+a+starved+human+melanoma+cell+line.">Biophysical and morphological correlates of kinetic change and death in a starved human melanoma cell line.</a> J. Cell. Sci. 49, 119-137 (1981).</li><li>Dittami, G. M., Rabbitt, R. D., Ayliffe, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ORFLO+Moxi+Z:+Revolutionizing+electronic+cell+count+accuracy+and+cell+viability+estimates+through+curve+fitting.">ORFLO Moxi Z: Revolutionizing electronic cell count accuracy and cell viability estimates through curve fitting.</a> Life Science Magazine, VWR International. , (2011).</li></ol>

Gregory M. Dittami og HE Ayliffe er medarbejdere i Orflo Technologies, selskabet, at designet, fremstiller og sælger Moxi Z. Richard D. Rabbitt giver en del tid, betalt rådgivning ekspertise Orflo Technologies. Produktion og fri adgang til denne artikel er sponsoreret af Orflo Technologies.

Den underliggende implementering Coulter tilgang kan være meget deterministisk af den samlede nøjagtighed af målingerne. Et kritisk område er en korrektion af de rå celletal for &quot;tilfældighed events&quot;, hvor to eller flere celler samtidigt passerer gennem åbningen, og måles som en enkelt elektrisk begivenhed. &quot;Tilfældighed begivenheder&quot; bidrage til fejl, som varierer afhængig af en række faktorer, herunder cellens størrelse og graden af klyngedannelse (Davis et al 1967) 6. Som et resultat heraf kan den ønskede sammenfaldet korrektion for en given prøve ikke forudsiges, varierer bredt mellem celler / partikel typer og også mellem forskellige kulturer af identiske celletyper. Etableret teori, rodfæstet i første udgivelser af Coulter, indebærer anvendelse af en logaritmisk justering af de rå tæller baseret på antallet af observerede begivenheder og en empirisk-målrettet, partikel-specifik korrektionsfaktor, z. Mens nøjagtige tæller kan blive ordentligt opnås med tsin algoritme til korrektion, er den begrænset i sin praktiske anvendelighed på grund af de store variationer i z-værdier mellem celletyper og den tilsvarende vanskelighed ved nøjagtigt at forudsige dens værdi. Her ved hjælp af den &quot;sande&quot; celletal identificeret ved Moxi Z kurvetilpasning sammen med tilfældigt algoritme til korrektion af det Moxi Z dynamisk korrigerer for tilfældighed at opnå de sande koncentrationer. Hvis der sammenlignes med resultater opnået ved hjælp af high-end Coulter Z2, produceret Moxi Z sammenlignelige tæller over et koncentrationsområde på 0 - 500.000 celler / ml (Type M kassette) og 3.000 - 2-2.5e 6 celler / ml (Type S kassette) . Desuden Moxi Z opnår dette tæller nøjagtighed med en tilsvarende lav variationskoefficient i tæller og en præcision i partikel størrelse, der er karakteristisk for guldstandarden, Coulter-teknik i celletælling. Desuden er de data, som præsenteres her indikerer, at Moxi Z kan give værdifulde oplysningermed hensyn til den generelle sundhed i cellekulturer. Den Moxi Z udnytter kurvetilpasning tilgang med en proprietær software algoritme til at afgøre denne kultur sundhedsmæssig vurdering. Morfologiske ændringer forbundet med celledød, såsom blæredannelse og adskillelse fra hinanden, og volumetriske forvrængninger (Kataoka og Tsuruo 1996 Liegler et al 1995, Sheridan et al 1981) 12-14, gør det muligt for Moxi-Z at skelne impedimetric forskelle mellem lever befolkninger og døde hudceller og / snavs befolkninger. Den MVI genereres ved at analysere kultur / partikelstørrelsesfordelingen for at identificere de relative bidrag af partikel rester og formindskede nekrotiske celler og kurven-monteret cellepopulationen af ​​interesse. Den MVI værdi afspejler således en population indeks eller ratiometrisk mål for monodisperse befolkningen tæller med hensyn til den samlede partikel population profil. Denne værdi er så algoritmisk-justeres på baggrund befolkningsstatistikker og empiriske observationer. Because den MVI ser på andre parametre end traditionelle farvning fremgangsmåder, forventes det ikke at afspejle disse teknikker, men i stedet indeholder et værdifuldt alternativ henblik på sundheden af ​​en cellekultur, især med hensyn til resterne og mikrobielle kontaminanter. Sammenfattende er Moxi-Z celletæller en meget lille benchtop instrument, der giver præcise og reproducerbare analyser af celletal, cellestørrelsen og celle sundhed ved hjælp af Coulter-princippet, og kurvetilpasning softwarealgoritmer kombineret med en patenteret tyndfilms sensorteknik . Med type M kassetten er i stand til at tælle partikler i området fra 4 - 25 mikron i diameter (dynamikområde af 2 - 34 mikrometer) i 8 sekunder. Med type S kassetten er i stand til at tælle partikler i området fra 3 - 20 mikron i diameter (dynamikområde af 2 - 26 mikrometer) i 15 sekunder. Endvidere Moxi-Z udfører helbredsvurderinger uden brug af reagenser. Det er meget mindre arbejdskraft intensive og subjektiv end manuel optælling. I sammenligning med standard Coulter-tælling, er Moxi hurtigere, betydeligt mindre, giver mere information kræver betydeligt mindre vedligeholdelse, er lettere at bruge, og er en brøkdel af omkostningerne.

<table border="1" ><tbody><tr><td> Navn på reagenset </td><td> Firma </td><td> Katalog nummer </td><td> Kommentarer </td></tr><tr><td> ORFLO Diluent </td><td> ORFLO </td><td> MXA006 </td><td></td></tr><tr><td> Kassette Dispenser </td><td> ORFLO </td><td></td><td> Butikker op til 25 kassetter til praktisk dispensering </td></tr><tr><td> USB-kabel </td><td> ORFLO </td><td></td><td> Tilsluttes instrument til PC / Mac eller strømforsyning </td></tr><tr><td> Power Adapter (USA og EU modeller) </td><td> ORFLO </td><td></td><td> Tilsluttes USB-kabel til en stikkontakt </td></tr><tr><td> USB Flash Drive </td><td> ORFLO </td><td></td><td> Butikker MoxJeg Z software og brugermanual </td></tr><tr><td> Kalibrering Tjek perler </td><td> ORFLO </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Elektronisk Kalibrering Kassette </td><td> ORFLO </td><td></td><td> Elektronisk kassette for at kontrollere korrekt driften af ​​systemet og kalibrering </td></tr></tbody></table>

determination of mammalian cell counts, cell size and cell health using the moxi z mini automated cell counter

Partiklen og celletælling anvendes til en række anvendelser, herunder rutine cellekultur, hæmatologiske analyser og industrielle kontrol 1-5. En kritisk gennembrud i celle / partikeltælling teknologi var udviklingen af ​​Coulter teknik ved Wallace Coulter over 50 år siden. Den teknik involverer anvendelsen af ​​et elektrisk felt over en mikrometerstore åbning og hydrodynamisk fokusering enkeltpartikler gennem åbningen. Den resulterende okklusion af åbningen af ​​partiklerne giver en målelig ændring i elektrisk impedans, som kan direkte og præcist korreleret cellestørrelse / volumen. Anerkendelsen af ​​den tilgang, som benchmark i celle / partikeltælling stammer fra den ekstraordinære præcision og nøjagtighed af partikel dimensionering og tæller, især sammenlignet med manuelle og billedbehandling baseret teknologi (nøjagtigheder i størrelsesordenen 98% for Coulter tællerne versus 75 - 80% for manuelle og vision-baserede systemer). Dettekan tilskrives det faktum, at i modsætning til billeddannelse-baserede metoder til celletælling, Coulter teknik gør en sand tredimensional (3-D) måling af celler / partikler, der drastisk reducerer tæller interferens fra affald og klyngedannelse ved beregning præcise volumetriske information om celler / partikler. Alt dette giver et middel til at optælle og dimensionering celler i en mere præcis, mindre kedelige, mindre tidskrævende, og mindre subjektive måde end andre tælleteknikker 6. Trods fremtrædende Coulter teknik celletælling, har udbredt anvendelse i rutinemæssige biologiske undersøgelser været prohibitive grund af omkostningerne og størrelsen af ​​traditionelle instrumenter. Selv om en billigere Coulter-baserede instrument er blevet fremstillet, den har begrænsninger i forhold til de dyrere modstykker i korrektionen for &quot;tilfældighed begivenheder&quot;, hvor to eller flere celler passerer gennem åbningen og måles samtidigt. Frelser begrænsning med eksisterende Coulter teknologier, er manglen på målinger på den generelle sundhed i celleprøver. Følgelig skal yderligere teknikker ofte blive anvendt i forbindelse med Coulter tæller for at vurdere cellernes levedygtighed. Dette udvider forsøgsopstilling tid og omkostninger, da de traditionelle metoder for vurderingen af ​​virksomhedens levedygtighed kræver cellefarvning og / eller brug af dyre og besværlige udstyr såsom et flowcytometer. Den Moxi Z mini automatiseret celletæller, der er beskrevet her, er en ultra-lille benchtop instrument, der kombinerer nøjagtigheden af ​​Coulter-princippet med en tynd-film sensorteknologi at muliggøre præcis dimensionering og tælling af partikler i området fra 3-25 um, afhængigt Den celletælling kassetten anvendes. M typen kassetten kan anvendes til at tælle partikler med en gennemsnitlig diameter på 4 - 25 mikron (dynamikområde 2 - 34 um), og Type S kassetten kan anvendes til at tælle partikler med og gennemsnitlig diameter på 3 - 20 mikron (dynamisk ringedee 2 - 26 mikrometer). Idet systemet anvender en volumetrisk målemetode de 4-25 mikron svarer til et cellevolumen række 34 - 8180 fl og 3 - 20 mikron svarer til en cellevolumen række 14-4200 FL, der er relevant, når ikke-sfærisk partikler måles. At udføre mammale celletællinger ved hjælp af Moxi Z er cellerne, der skal tælles først fortyndet med ORFLO eller lignende fortyndingsmiddel. En celletælling kassetten indsat i instrumentet, og prøven indføres i porten af ​​kassetten. Tusindvis af celler er trukket, single-fil via en &quot;Cell Sensing Zone&quot; (CSZ) i den tynde-film membran i løbet af 8-15 sekunder. Efter kørslen anvender instrumentet proprietære kurvetilpasning i forbindelse med en beskyttet software-algoritme for at tilvejebringe tilfældigt arrangement korrektion sammen med en vurdering af den samlede kultur helbred ved at bestemme forholdet mellem antallet af celler i populationen af ​​interesse til det samlede antal partikler. De samlede partikel tællinger herune indskrumpet og nedbrudt døde celler, samt andre vragrester og forurenende stoffer. Resultaterne er vist i histogramformat med en automatisk kurvetilpasning med porte, der kan justeres manuelt efter behov. I sidste ende, det Moxi Z muligt at tælle med en præcision og nøjagtighed kan sammenlignes med en Coulter Z2, den nuværende guldstandarden, men samtidig give yderligere kultur information om sundhed. Endvidere opnår disse resultater på kortere tid med mindre plads, med betydeligt lettere drift og vedligeholdelse, og til en brøkdel af omkostningerne ved sammenlignelige teknologier.

Watch this Scientific Journal Video about Determination of Mammalian Cell Counts, Cell Size and Cell Health Using the Moxi Z Mini Automated Cell Counter at JoVE.com

Determination of Mammalian Cell Counts, Cell Size and Cell Health Using the Moxi Z Mini Automated Cell Counter

Den Moxi Z miniature automatiseret celletæller er et hidtil ukendt middel, der kombinerer Coulter-princippet med patenteret tynd-film-sensor teknologi og en beskyttet software-algoritme til at udføre dimensionering og optælling af et bredt størrelsesområde af partikler såvel som til at bestemme den generelle sundhed af monodisperse mammale cellekulturer. Denne protokol beskrives anvendelsen af ​​dette instrument til tælling og vurdering af sundheden af ​​cellekulturer.

Bestemmelse af pattedyr celletal, celler og deres størrelse sundhedstilstand ved hjælp af Moxi Z Mini automatiseret celletæller

Particle and cell counting is used for a variety of applications including routine cell culture, hematological analysis, and industrial controls1-5. A ...

Research

JoVE Journal

Biology

Long-term Imaging Mammalian Cells using Wide-Field Microscopy

Pulse-chase Analysis of N-linked Sugar Chains from Glycoproteins in Mammalian Cells

Attachment of the Glc3Man9GlcNAc2 precursor oligosaccharide to nascent polypeptides in the ER is a common modification for secretory proteins. Although ...

MISSION esiRNA for RNAi Screening in Mammalian Cells

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as ...

Determining Cell Number During Cell Culture using the Scepter Cell Counter

Counting cells is often a necessary but tedious step for in vitro cell culture. Consistent cell concentrations ensure experimental reproducibility and ...

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

Analyse af Cell Cycle Position i pattedyrceller

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

Pull-down of Calmodulin-binding Proteins

Pull-down af Calmodulin-bindende proteiner

Calcium (Ca2+) is an ion vital in regulating cellular function through a variety of mechanisms. Much of Ca2+ signaling is mediated through the ...

Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells

Måling af hæmoglobinsyntese Niveauer i pattedyrceller

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in ...

Generation of Plasmid Vectors Expressing FLAG-tagged Proteins Under the Regulation of Human Elongation Factor-1&#945; Promoter Using Gibson Assembly

Generation of Plasmid Vectors Expressing FLAG-tagged Proteins Under the Regulation of Human Elongation Factor-1ÃƒÅ½Ã‚Â± Promoter Using Gibson Assembly

Generation af Plasmidvektorer udtrykker FLAG-mærkede proteiner henhold til forordningen for Human elongeringsfaktor-1α Promoter Brug Gibson Assembly

Gibson assembly (GA) cloning offers a rapid, reliable, and flexible alternative to conventional DNA cloning methods. We used GA to create customized ...

Direct Protein Delivery to Mammalian Cells Using Cell-permeable Cys2-His2 Zinc-finger Domains

Direct Protein Delivery to Mammalian Cells Using Cell-permeable Cys2-His2 Zinc-finger Domains

Direkte Protein Delivery for pattedyrsceller Brug Cell-permeable Cys<sub&gt; 2</sub&gt; -His<sub&gt; 2</sub&gt; Zink-finger Domæner

Due to their modularity and ability to be reprogrammed to recognize a wide range of DNA sequences, Cys2-His2 zinc-finger DNA-binding domains have emerged ...

Anaerobic Growth and Maintenance of Mammalian Cell Lines

Anaerob vækst og vedligeholdelse af pattedyr cellelinjer

Most mucosal surfaces along with the midpoints in tumors and stem cell niches are geographic areas of the body that are anoxic. Previous studies show that ...