Name: expression and purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator protein in saccharomyces cerevisiae
Uploaded: 2012-03-10T14:00:00
Duration: 14 min 56 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae at JoVE.com

Vi takker cystisk fibrose Foundation (CFF) for at finansiere dette arbejde gennem sin CFTR 3D Structure Consortium (tilskud nummer FORD08XX0). Vi anerkender det store bidrag fra alle vores kolleger inden for konsortiet til dette arbejde, især i udformningen af ​​CFTR gener. Vi anerkender også de uvurderlige bidrag Drs. James Birtley (NCSR Demokritos, Grækenland), Mark Young (University of Cardiff, Storbritannien) og David Drew (Imperial College, London, Storbritannien) i de tidlige faser af arbejdet. Vi takker især Dr. Ina Urbatsch (Texas Tech. University, Lubbock) til kritisk læsning af manuskriptet.

1. Udarbejdelse af medier og buffere <ol><li> YNB: Til en liter, 6,9 g gærnitrogenbase suspension uden aminosyrer og 0,77 g komplet supplement blandingen uden uracil i 1 l vand. Autoklav. Opbevares ved 4 ° C. </li><li> YNBA: Til 400 ml, 2,76 g gærnitrogenbase suspension uden aminosyrer, 0,38 g komplet supplement blandingen uden uracil og 8g bakteriologiske agar i 350 ml vand. Autoklav. Bland 8 g glucose med 50 ml vand og opvarmes forsigtigt, indtil opløst. Steriliseres gennem et 0,2 um filter og tilsættes til YNBA mens agar er smeltet. Opbevares ved stuetemperatur. </li><li> 20% glucose medium: Til 500 ml, 100 g glucose blandes med 500 ml YNB og opvarmes forsigtigt, indtil opløst. Passere gennem en 0,2 um filter ned i en steril Duran flasker. Opbevares ved stuetemperatur. </li><li> 20% galactose medium: Til 2 liter, bland 400 g galactose med 2L YNB og varme forsigtigt, indtil opløst. Passere gennem en 0,2 um filter ned i en steril Duran flasker. Opbevares ved stuetemperatur temperamentratur. </li><li> Proteasehæmmere lager: CFTR er meget følsom overfor proteolyse 4. Forfatterne fandt følgende hæmmere at være effektive i at begrænse proteolyse, men læserne kan ønske at skræddersy denne liste til at opfylde deres egne krav. Opbevares i 100 pi alikvoter ved -20 ° C til nedsættelse fryse-tø-problemer. Alle hæmmere bør fortyndes fra stamopløsninger til brugskoncentration som nedenfor: </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> Inhibitor </td><td> Stock Koncentration </td><td> Stamopløsningen </td><td> Arbejde Koncentration </td></tr><tr><td> AEBSF </td><td> 200 mM </td><td> Opløs 48 mg i 1 ml destilleret vand </td><td> 0,2 mM </td></tr><tr><td> Benzamidin </td><td> 300 mM </td><td> Opløs 36 mg i 1 ml destilleret vand </td><td> 0,3 mM </td></tr><tr><td> Chymostatin </td><td> 4 mM </td><td> Opløs 2,5 mg i 1 ml tørt DMSO </td><td> 4 uM </td></tr><tr><td> E-64 </td><td> 7 mM </td><td> Opløse 2,5 mg i 1 ml destilleret vand </td><td> 7 uM </td></tr><tr><td> Leupeptin </td><td> 20 mM </td><td> Opløs 10 mg i 1 ml destilleret vand </td><td> 20 uM </td></tr><tr><td> Pepstatin A </td><td> 15 mM </td><td> Opløs 10 mg i 1 ml tørt DMSO </td><td> 15 uM </td></tr><tr><td> PMSF </td><td> 1 M </td><td> Opløs 174 mg i 1 ml tørt DMSO </td><td> 1 mM </td></tr></tbody></table><ol start="6"><li> DTT (1 M): Opløs 154 mg dithiothreitol i 1 ml destilleret vand. Opbevar ved -20 ° C. Brug ved 1:1000 fortynding i buffere er angivet. </li><li> EDTA (0,5 M): Bland 29,22 g ethylendiamintetraeddikesyre med 100 ml vand. Tilsættes 10 N NaOH dråbevis, indtil al EDTA er opløst, og pH-værdien når op på 8. Der fyldes op til 200 ml med vand og passere gennem et 0,2 um filter til et sterilt Duran flasker. Opbevares ved stuetemperatur. </li><li> CRB (300 mM Tris-HCI,pH 7,4, 0,56 M sorbitol, 1 mM EDTA): Opløs 18,17 g Tris-base i 350 ml vand og justere pH til 7,4 ved tilsætning af HCI. Tilsæt 51,35 g sorbitol og at volumen op til 500 ml med vand. Autoklav. Tilsæt 1 ml EDTA stamopløsning og opbevares ved 4 ° C. </li><li> CFTR-buffer (50 mM Tris, pH 8,0, 10% v / v glycerol): Opløs 6,06 g Tris-base i 500 ml vand. Justér pH til 8 med HCl, tilsættes 100 ml glycerol og der fyldes op til 1 l med vand. Autoklave og opbevares ved 4 ° C. </li><li> 2x belastning farvestof: 50 mM Tris-HCI (pH 7,6), 5% glycerol, 5 mM EDTA (pH 8,0), 0,02% bromphenolblåt, 4% SDS, 0,05 M DTT. Gør 10 ml, alikvot og opbevares ved -20 ° C. </li></ol> 2. Screening Transformanterne Denne protokol antager, at CFTR-GFP-8His fusionsgenet er blevet indsat i en gær plasmid nedstrøms for en GAL1 galactose promotor (fig. 1), og at plasmidet er blevet omdannet til FGY217 celler, en pep4 deletionsmutant af S. cerevisiae 10 </em&gt;. Cellerne kan dyrkes på YNBA plader og opbevares i adskillige uger ved 4 ° C. Længere tids opbevaring, skal glycerolstamopløsninger fremstilles og opbevares ved -80 ° C. Fremgangsmåder til kloning og transformation er beskrevet i detaljer af Drew et al. (2008) 10. <ol><li> Vælg 5-10 godt adskilte kolonier fra en transformation plade. Overfør hver koloni en separat steril 50 ml Falcon-rør indeholdende 9 ml YNB og 1 ml 20% glucose-medium. Til dette trin er det vigtigt at have en slutkoncentration på 2% glucose (vægt / volumen) i kulturen til opretholdelse af cellevækst. Vokse natten over i 16 timer ved 250 rpm, 30 ° C i en orbital rysteinkubator. </li><li> Gøre glycerolstamopløsninger for hver af de screenede kolonier. Aseptisk tilsættes 0,8 ml af overnatskulturer til 0,2 ml steril glycerol i mærket skrue-top hætteglas, vortexes kort, og opbevares ved -80 ° C. </li><li> Fortynd de resterende overnatskulturer til et slutvolumen på 50 ml i YNB, herunder 250 pi 20% glucose-medium.Til dette trin er det vigtigt at fortynde glucosekoncentrationen til ca 0,1% (w / w) i kulturen, da høj glucose kan repressere GAL1 promotoren 10. Vokser kulturer i mærket 250 ml Erlenmeyer prelplader kolber til en OD600 på 0,7-0,8 ved 250 rpm, 30 ° C i en orbital rysteinkubator. </li><li> Inducere kulturerne ved tilsætning af 5 ml 20% galactose medium til hver kolbe og vokse på i 16 timer. </li><li> Bekræfte ekspression af CFTR anvendelse af fluorescens-mikroskopi. Tag 100 ul af kultur og tilsættes 100 ul glycerol at begrænse celle mobilitet i opløsning. Analyse celler på en Delta Vision RT restaurering mikroskop (eller lignende), under anvendelse af en blå laser under en FITC-filter (excitationsbølgelængde på 490 nm og emissionsbølgelængde på 528-538 nm). Positiv ekspression af CFTR-GFP-fusionsproteinet skal være synlig som en ring af fluorescens på plasmamembranen af ​​gærcellerne. Utransformerede gærceller kan anvendes som en kontrol. </li><li> Overførkulturer i 50 ml Falcon rør. Cellerne høstes ved centrifugering ved 3500 x g, 4 ° C i 10 minutter i en bordcentrifuge. Mens centrifugen kører, fremstilles 2 ml mikrocentrifugerør med skruelåg indeholdende cirka 500 ul syrevaskede glasperler og anbring på is. Kassér supernatanterne og resuspender hver pellet i 500-800 pi iskold CRB med proteaseinhibitorer. Overfør suspensioner til mikrocentrifugerør indeholdende perlerne og holde på is. </li><li> Lyse cellerne ved kraftig rystning / vortexing hvert mikrofugerør for 10 perioder af 30 sekunder, hviler på is i mellem perioder. En beadbeater kan anvendes som et alternativ, fx en Biospec mini beadbeater drives i 3 minutter. </li><li> Placere rørene i en benchtop mikrofuge og centrifugeres ved 3500 x g, 4 ° C i 5 minutter. Overfør supernatanterne indeholdende det rå membranen population at rengøre mikrocentrifugerør og anbring på is. Tilsæt 500 pi frisk is-cold CRB med proteaseinhibitorer til hvert rør og gentage processen at samle membranerne. </li><li> Indsamle de rå membraner ved centrifugering ved maksimal hastighed, 4 ° C i en benchtop mikrocentrifuge i 2 timer. Supernatanten og resuspender hver pellet i 50 pi iskold CFTR puffer. </li><li> I rene mikrocentrifugerør, blandes 15 ul af hver suspension med 15 ul 2x belastning farvestof ved at pipettere op og ned. Inkuber ved stuetemperatur i 10 minutter. Ikke koge prøverne, da dette vil medføre CFTR og andre membranproteiner til dannelse SDS-uopløselige aggregater og også denaturere GFP tag. </li><li> Indlæse prøver sammen med PageRuler Plus forud farvede proteinstandarder (Fermentas) på en 4-20% Tris / glycin-gradient gel (NuSep) og kørt ved 150 V i 40 minutter, eller indtil farvefronten front er i bunden af ​​gelen. </li><li> Identificere den højest udtrykkende celler ved in-gel fluorescens. Sted til et fluorescensimagografi, såsom en Typhoon scanner. Scan gelen usynge den blå laser ved en excitationsbølgelængde på 488 nm og en emissionsbølgelængde på 526 nm. CFTR-GFP-fusionen skal være synlige på omkring 220 kDa. Der vil også være en svagt fluorescerende bånd ses ved ca 70 kDa, som sandsynligvis er en iboende gær FAD-holdige membran-protein (såsom succinatdehydrogenase underenhed A) 11,12. </li><li> Plet gelen med Coomassie, affarves og scanne gelen til sammenligning af fluorescensen scanning under anvendelse af en bekvem billedvisning softwarepakke. Den Coomassie-farvet gel tillader en relativ bedømmelse af CFTR-GFP ekspressionsniveauer i forskellige klonale linjer efter normalisering for mængden af ​​totalt protein anbragt på hvert spor af gelen. </li><li> Udstryg ud højest udtrykkende cellelinie fra glycerolstamopløsning (2,2) på en frisk YNBA plade og inkuber ved 30 ° C i 2-3 dage. Denne plade kan derefter opbevares i op til 2 uger ved 4 ° C. </li></ol> 3. Storstilet Fermentortype Culture <ol><li> Forberede præ-kulturer for fermentoren. Skrabe 1cm 2 område af celler fra YNBA plade (2,13) ​​ved anvendelse af en steril løkke og tilsættes til 45 ml YNB og 5 ml 20% glucose medium, således at OD600 er cirka 0,1. Vokse i 250 ml Erlenmeyer-kolber skvulpeplader ved 250 rpm, 30 ° C i en orbital rysteinkubator, indtil OD600 når en. </li><li> Opdele kulturen mellem to 2 l Erlenmeyer-kolber, der hver indeholder 450 ml YNB og 25 ml 20% glucose-medium. Vokser disse på ved 250 rpm, 30 ° C i en orbital rysteinkubator, indtil OD600 når 1,2. </li><li> Selv om disse præ-kulturer vokser, oprettet fermenteringstanken. Gør 11.2l YNB som beskrevet i 1.1, men opløses en yderligere 8,28 g YNB og 0,95 g falder fra supplement for at kompensere for tilsætning af glycerol ved induktion. Aseptisk tilføje 11,2 l YNB og 75 ml 20% glucose medium til en steril 20L fermentationsbeholder og justere driftstemperatur for30 ° C. </li><li> Aseptisk tilføje prækulturer til fermentoren, og indstil omrøringshastighed på ca 800 rpm og temperaturen holdes ved 30 ° C. Trykluft skal strømme ved ca 15 dm 3 min-1. Når fermentoren kulturen når en OD600 på 1,2, fremkaldes ved aseptisk at tilsætte 1,5 l YNB 20% galactoseopløsning og 1,2 l glycerol. Reducere temperaturen til 25 ° C og vokser i kultur i 16 timer. </li><li> Overføres fermentorindholdene i kølede 1L centrifugering potter på is under anvendelse af en peristaltisk pumpe. Cellerne høstes ved centrifugering ved 3500 x g, 4 ° C i 30 minutter i en stor kapacitet rotor (f.eks 6 liter). Resuspender cellerne i 150 ml iskold CRB med proteaseinhibitorer. Herfra skal alt arbejde skal udføres ved 4 ° C. </li><li> Lysere cellerne ved passage gennem en konstant Systems Cell Disrupter i 4 passager ved 25, 30, 32 og 35 kPa, opsamling lysatet på is i hvert tilfælde. Alternativt kan du bruge en perle Beater (Biospec) med et tilsvarende volumen af ​​syre-vaskede 0,5 mm glaskugler og omrør i 3 minutter ved fuld effekt. Overføre lysatet til 50 ml Falcon-rør og pelletere celledebris ved centrifugering ved 3500 x g, 4 ° C i 15 minutter i en bordcentrifuge. </li><li> Supernatanten overføres til kølet centrifugerør. Centrifugeres ved 14.000 x g, 4 ° C i 30 minutter i en centrifuge for at fjerne mitokondrier. </li><li> Overfør supernatanten til kølet ultracentrifugerør. Centrifugeres ved 200.000 x g, 4 ° C i 90 minutter i en ultracentrifuge at indsamle mikrosomer. </li><li> Dekanteres forsigtigt og kassér supernatanten, og der tilsættes 2 ml iskold CFTR puffer med protease-inhibitorer og 1 mM DTT til hvert rør. Forsigtigt resuspendere-pellets under anvendelse af en pensel, fyld op hvert rør med CFTR-puffer og blandes under anvendelse af en vortex-blander. </li><li> Centrifugeres suspensionen ved 200.000 x g, 4 ° C i 60 minutter i en ultracentrifuge, Bortkast supernatanten og resuspender pellets i 2 ml iskold CFTR puffer wed proteaseinhibitorer (Ingen DTT) ved anvendelse af en pensel. </li><li> Pool de resuspenderede mikrosomer, det endelige rumfang justeres til 50 ml med CFTR buffer og bland godt. Reservere en 1 ml aliquot af SDS-PAGE-gel-analyse som beskrevet i 2,9-2,11. De mikrosomer kan nu lynfrosset i flydende nitrogen og derefter lagret ved -80 ° C indtil brug. </li><li> CFTR kan ekstraheres fra mikrosomer ved hjælp af en af ​​følgende detergenter: lithium perfluorooctonoate syre (LiPFO), tetradecanoly-lyso-phosphatidylglycerol (LPG14), n-dodecyl-β-D-maltosid (DDM). Bland mikrosomer med CFTR-puffer, proteaseinhibitorer og 5% detergent (vægt / vægt). Hvis DDM anvendes, også tilsættes 300 mM NaCI i bufferen. Omrystes ved 4 ° C i 15 minutter på et rør rotator. </li><li> Centrifugeres prøverne ved 100.000 x g, 4 ° C i 1 time i en ultracentrifuge. Bevarer supernatanten og tage en lille alikvot af SDS-PAGE-gelanalyse. CFTR kan nu oprenses fra solublised materiale ved immobiliseret metalaffinitetskromatografi efterfulgt af gelpermeationskromatografi. </li></ol> 4. Repræsentative resultater Transformationen af ​​gær med CFTR-holdige plasmid er ikke 100% effektiv. En repræsentativ mindre skærm af CFTR-ekspression i udvalgte kolonier fra en transformationsforsøg vil give omkring 1 i 4 kolonier, der udtrykker proteinet. Et typisk resultat af en skærm af 5 kolonier fra en plade er vist i panel A i fig. 3. En af de kolonier viser en høj grad af ekspression af CFTR-GFP-fusionsproteinet, som typisk kører mellem 250 kDa og 130 kDa markører, som vist. CFTR-GFP-fluorescens-niveauer vil variere betydeligt mellem forsøgene med koloni 4 i fig. 3 viser mindst 10 gange større fluorescens end den iboende fluorescerende bånd ved ca 70kDa. Hvis ekspressionsniveauer af CFTR-GFP synes at give mindre fluorescens end 70 kDa-båndet, så er det nok værd re-transformering og vælge en kolonimed højere niveauer af CFTR-GFP-ekspression. Som vist i fig. 3A, er det usandsynligt, at selv med et højt ekspressionsniveau af CFTR-GFP, som CFTR-GFP båndet bliver tydeligt i celleekstrakten af ​​Coomassie-farvning. Når udvalgte kolonier er blevet dyrket i større målestok eksperimenter, mikrosomer og isoleret, tilstedeværelsen af ​​CFTR-GFP i de mikrosomer skal vurderes, som vist i fig. 3B. Resultaterne af dette eksperiment er vigtige, ikke blot for at vurdere effektiviteten af ​​induktion af ekspression, men også at kontrollere, at mikrosomer er blevet fremstillet omhyggeligt, og at proteolyse er blevet minimeret. Resultaterne er vist i fig. 3B indebærer, at i dette eksperiment CFTR-GFP-ekspression er noget lavere (som bedømt i forhold til den indre 70kDa båndet) end i mindre eksperiment er vist i panel A. Imidlertid indtrykket er forspændt ved overeksponering af fluorescensdetektor i måling. Dette skyldtes, at forsøgslederen var checking for tilstedeværelsen af ​​proteolytiske fragmenter af CFTR-konstruktionen. Der er visse tegn i dette forsøg for nogle fluorescerende proteolytiske fragmenter mellem 130 kDa og 100 kDa markører, men disse er meget svag sammenlignet med fuld-længde CFTR-GFP-bånd. Med protease-inhibitorer er beskrevet her, finder vi få tegn for proteolytisk nedbrydning af CFTR efter cellebrud. Hvis der betydelige proteolyse der observeres, anbefaler vi gør friske proteasehæmmerresistensmutationer stamopløsninger. Vi har også fundet, at kommercielle proteaseinhibitor-cocktail tabletter ikke er så effektive til dette system. Vækst af celler ud over 16 timer (efter induktion) vil give anledning til reduceret CFTR ekspression som vist i figur 4. Dette skyldes sandsynligvis omsætning af proteinet, måske på grund opregulering af gærprotein kvalitetskontrol maskineri 6-9,13. Det er derfor tilrådeligt at overvåge CFTR ekspressionsniveauer efter induktion med galactose, hvis det er muligt, da det optimale tidspunkt at høste celler may varierer fra det ene laboratorium til et andet. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/3860/3860fig1.jpg" /> Figur 1. CFTR-konstruktionen indeholdende gær plasmid. CFTR-GFP-8His fusion indsættes i 2μ p424GAL1 ekspressionsvektor under styring af en galactose (GAL1)-promotoren. Vektoren indeholder også en uracil selektionsmarkør (URA) og et ampicillinresistensgen (amp). <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/3860/3860fig2.jpg" /> Figur 2. Et rutediagram opsummerer den visualiseret protokol. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/3860/3860fig3.jpg" /> Figur 3. Repræsentative SDS-PAGE-geler af CFTR ekspression og oprensning. Panel A viser fem tilfældigt valgte transformantkolonier (bane 1-5), som blev screenet for CFTR-ekspression. Panel B viser mikrosomer, der var isoleret fra en 15l FERMind kultur. Panel C viser oprenset murint CFTR opnået efter to-trins oprensning ved anvendelse af affinitetskromatografi efterfulgt af gelpermeationskromatografi. Alle geler er vist under belysning betingelser spændende fluorescens fra GFP-domænet (venstre) og efter Coomassie farvning (højre). De relative placeringer af molekylvægt-standarder er vist til venstre (kDa). <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/3860/3860fig4.jpg" /> Figur 4. Repræsentative data for ekspression af CFTR i gær. Panel A viser en tids-forløb CFTR-ekspression efter induktion med galactose. Celleekstrakter blev analyseret ved SDS-PAGE, og GFP-fluorescens for CFTR-GFP-protein-bånd blev integreret. Panel B viser typiske resultater for fluorescensmikroskopi af GFP-udtrykkende celler 16 timer efter induktion. Typisk kun en fraktion af cellerne udtrykker CFTR i høje niveauer.

<ol>
	<li>Ford, R. C., Birtley, J., Rosenberg, M. F., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CFTR+three-dimensional+structure.">CFTR three-dimensional structure.</a> Methods Mol. Biol. 741, 329-346 (2011).</li><li>Rosenberg, M. F., Kamis, A. B., Aleksandrov, L. A., Ford, R. C., Riordan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+crystallization+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator.">Purification and crystallization of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator.</a> CFTR). J. Biol. Chem. 279, 39051-39051 (2004).</li><li>Zhang, L., Aleksandrov, L. A., Riordan, J. R., Ford, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Domain+location+within+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+protein+investigated+by+electron+microscopy+and+gold+labelling.">Domain location within the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator protein investigated by electron microscopy and gold labelling.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1808, 399-404 (2011).</li><li>Kiser, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+degradation+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Expression and degradation of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator in Saccharomyces cerevisiae.</a> Arch. Biochem. Biophys. 390, 195-205 (2001).</li><li>Huang, P., Stroffekova, K., Cuppoletti, J., Mahanty, S. K., Scarborough, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+expression+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+in+yeast.">Functional expression of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator in yeast.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1281, 80-90 (1996).</li><li>Ahner, A., Nakatsukasa, K., Zhang, H., Frizzell, R. A., Brodsky, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+heat-shock+proteins+select+deltaF508-CFTR+for+endoplasmic+reticulum-associated+degradation.">Small heat-shock proteins select deltaF508-CFTR for endoplasmic reticulum-associated degradation.</a> Mol. Biol. Cell. 18, 806-814 (2007).</li><li>Fu, L., Sztul, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ER-associated+complexes+(ERACs)+containing+aggregated+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+(CFTR)+are+degraded+by+autophagy.">ER-associated complexes (ERACs) containing aggregated cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) are degraded by autophagy.</a> Eur. J. Cell. Biol. 88, 215-226 (2009).</li><li>Sun, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derlin-1+promotes+the+efficient+degradation+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+(CFTR)+and+CFTR+folding+mutants.">Derlin-1 promotes the efficient degradation of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) and CFTR folding mutants.</a> J. Biol. Chem. 281, 36856-36863 (2006).</li><li>Zhang, Y., Michaelis, S., Brodsky, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CFTR+expression+and+ER-associated+degradation+in+yeast.">CFTR expression and ER-associated degradation in yeast.</a> Methods Mol. Med. 70, 257-2565 (2002).</li><li>Drew, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GFP-based+optimization+scheme+for+the+overexpression+and+purification+of+eukaryotic+membrane+proteins+in+Saccharomyces+cerevisiae.">GFP-based optimization scheme for the overexpression and purification of eukaryotic membrane proteins in Saccharomyces cerevisiae.</a> Nat. Protoc. 3, 784-798 (2008).</li><li>Knight, A. W., Billinton, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seeing+the+wood+through+the+trees:+A+review+of+techniques+for+distinguishing+green+fluorescent+protein+from+endogenous+autofluorescence.">Seeing the wood through the trees: A review of techniques for distinguishing green fluorescent protein from endogenous autofluorescence.</a> Anal. Biochem. 291, 175-197 (2001).</li><li>Robinson, K. M., Lemire, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+nucleotide+sequence+of+the+Saccharomyces+cerevisiae+gene+for+the+succinate+dehydrogenase+flavoprotein+subunit.">Isolation and nucleotide sequence of the Saccharomyces cerevisiae gene for the succinate dehydrogenase flavoprotein subunit.</a> J. Biol. Chem. 267, 10101-10107 (1992).</li><li>Gnann, A., Riordan, J. R., Wolf, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+degradation+depends+on.">Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator degradation depends on.</a> the lectins Htm1p/EDEM and the Cdc48 protein complex in. 15, 4125-4135 (2004).</li><li>Yoo, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-conventional+trafficking+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+through+the+early+secretory+pathway.">Non-conventional trafficking of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator through the early secretory pathway.</a> J. Biol. Chem. 277, 11401-11409 (2002).</li><li>Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Architecture+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+protein+and+structural+changes+associated+with+phosphorylation+and+nucleotide+binding.">Architecture of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator protein and structural changes associated with phosphorylation and nucleotide binding.</a> Journal of Structural Biology. 167, 242-251 (2009).</li><li>Wellhauser, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+small-molecule+modulator+interacts+directly+with+deltaPhe508-CFTR+to+modify+its+ATPase+activity+and+conformational+stability.">A small-molecule modulator interacts directly with deltaPhe508-CFTR to modify its ATPase activity and conformational stability.</a> Mol. Pharmacol. 75, 1430-148 (2009).</li><li>Ramjeesingh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+monomer+is+the+minimum+functional+unit+required+for+channel+and+ATPase+activity+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator.">A monomer is the minimum functional unit required for channel and ATPase activity of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator.</a> Biochemistry. 40, 10700-10706 (2001).</li><li>Huang, P., Liu, Q., Scarborough, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysophosphatidylglycerol:+a+novel+effective+detergent+for+solubilizing+and+purifying+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator.">Lysophosphatidylglycerol: a novel effective detergent for solubilizing and purifying the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator.</a> Anal. Biochem. 259, 89-97 (1998).</li></ol>

Ingen interessekonflikter erklæret.

Dette dokument tilvejebringer en fremgangsmåde til ekspression af murint CFTR-proteinet i gærceller, der skulle lette forskning cystisk fibrose. Målet er at knytte dette papir med udgivelsen af det murine CFTR DNA-konstruktion, som vil være tilgængelig via cystisk fibrose Foundation ( <a href="http://www.cff.org/research/CFFT/">http://www.cff.org/research/CFFT/</a> ). Andre orthologer skulle blive tilgængelig senere. Transformation af gærceller med CFTR-holdige vektor er ligetil, men det er vigtigt at screene for kolonier, der udtrykker høje niveauer af CFTR. Variable ekspressionsniveauer kan skyldes flere faktorer, men antallet af kopier af plasmidet pr celle sandsynligvis udgør en signifikant grad af variation. Kritiske trin, der er beskrevet her, bør muliggøre produktion af CFTR-udtrykkende gærceller og CFTR-holdige mikrosomale membraner. Når transformation, vækst, høst og lysis af gærceller har mestret, purification af proteinet være muligt, og i figur 3 har vi har givet et eksempel på den renhed, der skal kunne opnås i dette tilfælde som en nyttig reference. Det er ikke vores hensigt i dette manuskript at give detaljeret metode til oprensning af proteinet. Imidlertid er der nogle kritiske nedstrøms oprensningstrin, der er specifikke for S.cerevisae ekspressionssystem, såsom cellelyse og mikrosom oprensning, og disse er medtaget i detaljer i dette håndskrift. Det skal imidlertid nævnes, at bortset fra de to metoder, vi har anvendt, kan alternative gær cellesprængning metoder kan anvendes, såsom anvendelse af en fransk trykcelle. Det rekombinante protein har en TEV-spaltelig C-terminale GFP domæne, der tillader at proteinet, der skal spores efter induktion (fig. 4). Gær har en iboende 70kDa protein (formentlig succinatdehydrogenase 12), der fluorescerer under de samme betingelser 11, og det kan give et nyttigt bl.a.Nal kalibreringsstandard til de relative ekspressionsniveauer af CFTR i hele celleekstrakter eller mikrosomer (fig. 3). Det er klart fra dataene vist i figur 4, at timingen af ​​cellehøst efter induktion med galactose er afgørende. Udbytter af CFTR dråbe brat efter ca 16 timer for induktion, således at der næsten ikke noget detekterbart CFTR i gærceller efter 24 timer af induktion. Udbyttet af oprenset protein er ca en-2 mg CFTR-protein pr 15 liters fermentor kultur. Genvinding kan estimeres som ca 70% af den totale CFTR-GFP-protein op til mikrosom fase og omkring 25% genvinding af oprensede protein. Karakterisering af S. cerevisiae-udtryk CFTR er i gang. Som det ses i fig. 4, kan proteinet placering i cellen monitoreres ved fluorescensmikroskopi. Skønt meget af fluorescens findes omkring periferien af cellen som forventet 10, en del af proteinet udviser en punktformet lokalisering, enten i ellerlige inden for plasmamembranen, som kunne skyldes CFTR genvindes ved hjælp af en forsinket Golgi / endosomale pathway 14 eller måske et rum nedstrøms for spirende af transport vesikler fra ER 4. Behandling med PNGaseF, et enzym, deglycosylates proteiner udviste minimal ændring i migration af CFTR-proteinet på SDS-PAGE, hvilket indebærer, at det er uglycosyleret, eller har minimal glycosylering 15. Forsøg på at phosphoryleringstilstanden af ​​proteinet er i gang. I nogle af de detergenter testede hidtil viser det oprensede protein ATPase-aktivitet (som inhiberes af en CFTR-specifik inhibitor 16) i doseringer, der svarer til de tidligere offentliggjorte 2,15. Måling af CFTR-kanalaktivitet vil kræve rekonstituering af det oprensede protein, hvilket ville indebære et sidste oprensningstrin i et detergent, der har en relativt høj kritisk micellekoncentration (CMC) 17. Gær mikrosomer containing CFTR kan solublised med flere almindeligt anvendte detergenter 18, herunder detergenter såsom dodecyl maltosid 2, som generelt anses for at være &quot;mild&quot;. Men de fleste store CMC rengøringsmidler har vist sig at være ineffektiv for solubilsation, så langt, tyder på, at udvekslingen i disse rengøringsmidler bør overvejes på et sent tidspunkt i enhver rensning ordning.

<table border="1"><tbody><tr><td> Navn på reagens / udstyr </td><td> Firma </td><td> Katalog nr. </td></tr><tr><td> FGY217 S. cerevisiae stamme med pep4 deletion 10 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Gærnitrogenbase uden aminosyrer </td><td> Formedium </td><td> CYN0410 </td></tr><tr><td> Komplet supplement blanding uden uracil </td><td> Formedium </td><td> DCS0169 </td></tr><tr><td> Bakteriologisk agar </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A5306 </td></tr><tr><td> D-galactose </td><td> Fisher </td><td> BP656-500 </td></tr><tr><td> D-glucose </td><td> Fisher </td><td> D16-500 </td></tr><tr><td> Pepstatin A </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P4265 </td></tr><tr><td> Leupeptin </td><td> Merck </td><td> 108975 </td></tr><tr><td> Chymostatin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C7268 </td></tr><tr><td> Phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P7626 </td></tr><tr><td> Epoxysuccinyl-leucylamido-butan (E-64) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E3132 </td></tr><tr><td> Aminoethylbenzenesulfonyl fluorid (AEBSF) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A8456 </td></tr><tr><td> Benzamidin-hydrochlorid </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 434760 </td></tr><tr><td> Dimethylsulfoxid (DMSO) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D8418 </td></tr><tr><td> dithiothreitol (DTT) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 43815 </td></tr><tr><td> ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA) </td><td> Fisher </td><td> BP120500 </td></tr><tr><td> Tris-base </td><td> Formedium </td><td> TRIS01 </td></tr><tr><td> Tris-HCI </td><td> Fisher </td><td> P631 </td></tr&gt; <tr><td> D-sorbitol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S1876 </td></tr><tr><td> Glycerol </td><td> Fisher </td><td> 065017 </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S6191 </td></tr><tr><td> n-dodecyl-β-D-maltopyranoside </td><td> Affymetrix </td><td> D310S </td></tr><tr><td> Bromphenolblåt </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 114391 </td></tr><tr><td> PageRuler Plus forud farvede proteinstandarder </td><td> Fermentas </td><td> SM1811 </td></tr><tr><td> NuSep tris-Gly 4-20% gradientgeler </td><td> NuSep </td><td> NB10-420 </td></tr><tr><td> Instant Blå Coomassie Stain </td><td> Novexin </td><td> ISB1L </td></tr><tr><td> Glasperler, syrevasket </td><td> Sigma </td><td> G8772 </td></tr><tr><td> 50ml Sterile Falcon-rør </td><td> Sarstedt </td><td> 62.547.254 </td></tr><tr><td> 2 mlSterile skruelåg hætteglas </td><td> Sarstedt </td><td> 72.694.005 </td></tr><tr><td> 250 ml Steril Erlenmeyer skvulpeplader kolber </td><td> BD Biosciences </td><td> 355119 </td></tr><tr><td> 2L Steril Erlenmeyer forvirret kolber </td><td> BD Biosciences </td><td> 355131 </td></tr><tr><td> 2 ml mikrocentrifugerør </td><td> Sarstedt </td><td> 72,695 </td></tr><tr><td> 0,2 um sprøjtefilter </td><td> Sartorius </td><td> FC121 </td></tr><tr><td> ultracentrifugerør </td><td> Beckman Coulter </td><td> 355618 </td></tr><tr><td> centrifugerør </td><td> Beckman Coulter </td><td> 357000 </td></tr><tr><td> 1L centrifugeres potter </td><td> Beckman Coulter </td><td> 969329 </td></tr><tr><td> Orbital rysteinkubator med temperaturstyring </td><td> New Brunswick Scientific </td><td></td></tr><tr><td> Deltavision RT restaurering mikroskop </td><td> Applied Vision </td><td></td></tr><tr><td> Bordcentrifuge </td><td> HERMLE </td><td> Z300 </td></tr><tr><td> Stationære mikrofugeglas </td><td> Fisher </td><td> 13-100-511 </td></tr><tr><td> Hvirvelstrømsblanderen </td><td> Stjerne Labs </td><td></td></tr><tr><td> Typhoon Trio Scanner </td><td> GE Healthcare </td><td> 63-0055-87 </td></tr><tr><td> LAS3000 billeddannelsessystem </td><td> Fuji </td><td></td></tr><tr><td> 20L fermentationsbeholder og styreenhed </td><td> Applikon </td><td></td></tr><tr><td> Konstant systemer Cell Disrupter </td><td> Konstant systemer </td><td></td></tr><tr><td> Beadbeater Cell Disrupter </td><td> Biospec </td><td> 1107900 </td></tr><tr><td> Mini-beadbeater-16 </td><td> Biospec </td><td> 607 </td></tr><tr><td> JA-17 rotor </td><td> Beckman Coulter </td><td> 369691 </td></tr><tr><td> Optima L-100 ultracentrifuge </td><td> Beckman Coulter </td><td> 392050 </td></tr><tr><td> 50.2Ti rotor </td><td> Beckman Coulter </td><td> <a href="https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/page/itemDetails?itemNumber=337901" target="_blank">337901</a> </td></tr></tbody></table>

expression and purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator protein in saccharomyces cerevisiae

Cystisk fibrose transmembran konduktans regulator (CFTR), er en chlorid-kanal, at når muteret, kan give anledning til cystisk fibrose humans.There er derfor betydelig interesse i dette protein, men bestræbelser på at studere dets struktur og aktivitet er blevet vanskeliggjort af vanskeligheden udtrykke og oprense tilstrækkelige mængder af proteinet 1-3. Ligesom mange &#39;vanskelige&#39; eukaryote membranproteiner, er udtryk i en hurtigt voksende organisme ønskeligt, men udfordrende, og i gær S. cerevisiae hidtil lave mængder opnåedes og hurtig nedbrydning af det rekombinante protein blev observeret 4-9. Proteiner involveret i behandlingen af rekombinant CFTR i gær er blevet beskrevet 6-9. I denne rapport beskriver vi en metode til ekspression af CFTR i gær og oprensning i signifikante mængder. Protokollen beskriver, hvordan de tidligere proteolyse problemer kan overvindes, og hvordan ekspressionsniveauer afCFTR kan blive kraftigt forbedret ved at ændre celle vækstbetingelser, og ved at styre induktion betingelser, navnlig den periode forud for celle høst. De reagants i forbindelse med denne protokol (murine CFTR-udtrykker gærceller eller gær plasmider), vil blive distribueret via den amerikanske cystisk fibrose Foundation, som har sponsoreret forskning. En artikel, der beskriver design og syntese af CFTR konstruktion anvendt i denne rapport vil blive offentliggjort særskilt (Urbatsch, I.;. Thibodeau, P. et al, upubliceret). I denne artikel vil vi forklare vores metode begynder med transformationen af ​​gærcellerne med CFTR konstruere - indeholder gær-plasmid (fig. 1). Konstruktionen har et grønt fluorescerende protein (GFP)-sekvens fusioneret til CFTR ved sin C-terminus og følger udviklet af Drew et al. (2008) 10. GFP tillader ekspression og oprensning af CFTR følges relativt let. Jové visualiseret protokolol slutter efter fremstillingen af ​​mikrosomer fra gærceller, selv om vi omfatter nogle forslag til oprensning af proteinet fra mikrosomer. Læsere kan ønske at tilføje deres egne modifikationer til mikrosom rensning procedure, afhænger af den endelige eksperimenter, der skal udføres med protein og det lokale udstyr til rådighed for dem. Gær-udtrykt CFTR-protein kan delvist oprenset under anvendelse metalion affinitetskromatografi under anvendelse af en indre polyhistidin rensnings-taggen. Efterfølgende gelpermeationskromatografi giver et protein, som synes at være&gt; 90% rent, som bedømt ved SDS-PAGE og Coomassie-farvning af gelen.

Watch this Scientific Journal Video about Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae at JoVE.com

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

Forsøg på at udtrykke den cystisk fibrose transmembran konduktans regulator (CFTR) i<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; Har indtil nu gav relativt lave mængder af protein. Denne protokol og de tilhørende reagenser distribueres via cystisk fibrose Foundation bør tillade udarbejdelse af milligram mængder af denne &#39;svære&#39; eukaryot membranprotein.

Ekspression og oprensning af cystisk fibrose-transmembrankonduktans-regulator protein i Saccharomyces cerevisiae

The  cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride  channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in  ...

Research

JoVE Journal

Biology

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground ...

Purification of the M. magneticum Strain AMB-1 Magnetosome Associated Protein MamA&Delta;41

Magnetotactic bacteria comprise a diverse group of aquatic microorganisms that are able to orientate themselves along geomagnetic fields. This behavior is ...

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen ...

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualisering og analyse af mRNA molekyler under anvendelse Fluorescens<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisering i<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Koblede Analyser for Monitoring Proteingenfoldningstrin i<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Oprensning af cystisk fibrose Ledningsevne regulator protein udtrykt i<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein cause cystic fibrosis (CF), an autosomal recessive disease that ...

EPR Monitored Redox Titration of the Cofactors of Saccharomyces cerevisiae Nar1

EPR Monitored Redox Titration of the Cofactors of Saccharomyces cerevisiae Nar1

EPJ Overvåget Redox Titrering af cofaktorerne af<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; Nar1

Electron Paramagnetic Resonance (EPR) monitored redox titrations are a powerful method to determine the midpoint potential of cofactors in proteins and to ...