Name: expression and purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator protein in saccharomyces cerevisiae
Uploaded: 2012-03-10T14:00:00
Duration: 14 min 56 s
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我々はそのCFTR 3次元構造コンソーシアム（承認番号FORD08XX0）を介して、この作業に資金を提供するため嚢胞性線維症財団（CFF）を感謝します。我々はCFTR遺伝子の設計では、特にこの仕事にコンソーシアム内のすべての仲間たちの巨大な貢献を認める。また、博士の貴重な貢献を認める。作業の初期段階ではジェームズBirtley（NCSR Demokritos、ギリシャ）、マーク·ヤング（カーディフ大学、英国）とデビッド·ドリュー（インペリアル·カレッジ、ロンドン、英国）。我々は、特に原稿の重要な読書のために博士伊那Urbatsch（テキサス工科。大学、ラボック）に感謝。

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	<li>Ford, R. C., Birtley, J., Rosenberg, M. F., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CFTR+three-dimensional+structure.">CFTR three-dimensional structure.</a> Methods Mol. Biol. 741, 329-346 (2011).</li><li>Rosenberg, M. F., Kamis, A. B., Aleksandrov, L. A., Ford, R. C., Riordan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+crystallization+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator.">Purification and crystallization of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator.</a> CFTR). J. Biol. Chem. 279, 39051-39051 (2004).</li><li>Zhang, L., Aleksandrov, L. A., Riordan, J. R., Ford, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Domain+location+within+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+protein+investigated+by+electron+microscopy+and+gold+labelling.">Domain location within the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator protein investigated by electron microscopy and gold labelling.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1808, 399-404 (2011).</li><li>Kiser, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+degradation+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Expression and degradation of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator in Saccharomyces cerevisiae.</a> Arch. Biochem. Biophys. 390, 195-205 (2001).</li><li>Huang, P., Stroffekova, K., Cuppoletti, J., Mahanty, S. K., Scarborough, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+expression+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+in+yeast.">Functional expression of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator in yeast.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1281, 80-90 (1996).</li><li>Ahner, A., Nakatsukasa, K., Zhang, H., Frizzell, R. A., Brodsky, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+heat-shock+proteins+select+deltaF508-CFTR+for+endoplasmic+reticulum-associated+degradation.">Small heat-shock proteins select deltaF508-CFTR for endoplasmic reticulum-associated degradation.</a> Mol. Biol. 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H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+degradation+depends+on.">Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator degradation depends on.</a> the lectins Htm1p/EDEM and the Cdc48 protein complex in. 15, 4125-4135 (2004).</li><li>Yoo, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-conventional+trafficking+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+through+the+early+secretory+pathway.">Non-conventional trafficking of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator through the early secretory pathway.</a> J. Biol. Chem. 277, 11401-11409 (2002).</li><li>Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Architecture+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+protein+and+structural+changes+associated+with+phosphorylation+and+nucleotide+binding.">Architecture of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator protein and structural changes associated with phosphorylation and nucleotide binding.</a> Journal of Structural Biology. 167, 242-251 (2009).</li><li>Wellhauser, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+small-molecule+modulator+interacts+directly+with+deltaPhe508-CFTR+to+modify+its+ATPase+activity+and+conformational+stability.">A small-molecule modulator interacts directly with deltaPhe508-CFTR to modify its ATPase activity and conformational stability.</a> Mol. Pharmacol. 75, 1430-148 (2009).</li><li>Ramjeesingh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+monomer+is+the+minimum+functional+unit+required+for+channel+and+ATPase+activity+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator.">A monomer is the minimum functional unit required for channel and ATPase activity of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator.</a> Biochemistry. 40, 10700-10706 (2001).</li><li>Huang, P., Liu, Q., Scarborough, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysophosphatidylglycerol:+a+novel+effective+detergent+for+solubilizing+and+purifying+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator.">Lysophosphatidylglycerol: a novel effective detergent for solubilizing and purifying the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator.</a> Anal. Biochem. 259, 89-97 (1998).</li></ol>

利害の衝突が宣言されません。

本論文では、嚢胞性線維症の研究を促進すべきである酵母細胞でネズミのCFTR蛋白質の発現方法を提供する。目的は、嚢胞性線維症財団（経由で利用できるようになりますマウスCFTR DNAコンストラクトのリリースでこの論文をリンクすることである<a href="http://www.cff.org/research/CFFT/">http://www.cff.org/research/CFFT/</a> ）。他のオルソログは、後で利用できるようになるはずです。 CFTRを含むベクターを用いた酵母細胞の形質転換は簡単ですが、それはCFTRの高発現コロニーをスクリーニングすることが重要です。変数の発現レベルは、いくつかの要因から発生する可能性がありますが、プラスミド細胞当たりのコピー数は、おそらく変動の重要度を占めています。ここで説明する重要なステップでは、CFTR発現酵母細胞およびCFTR含むミクロソーム膜の生産を許可する必要があります。酵母細胞の形質転換、成長、収穫や溶解が習得されたら、purifタンパク質のicationが可能であるべきであり、図3に我々は、有用なベンチマークとして、このケースでは達成可能でなければなりません純度の例を与えている。それは、タンパク質の精製のために詳細な方法論を提供するために、この原稿では我々の意図ではありません。しかし、そこにそのような細胞溶解とミクロソーム精製などS.cerevisae発現系に固有のいくつかの重要な下流の精製工程があり、これらは本稿で詳細に含まれています。それは離れて我々が使用している二つの方法から、別の酵母細胞の破砕方法は、フランス語圧力セルの使用など、用いることができること、しかし、言及されるべきである。組換えタンパク質は、タンパク質が誘導する（図4）の後に追跡することができTEV-開裂可能なC末端GFPのドメインを持っています。酵母は同じ条件で11、この下に蛍光が役に立つ間を提供することができます本質的な70kDaタンパク質（おそらくデヒドロゲナーゼ12コハク酸）が全細胞抽出物またはミクロソームにおけるCFTRの相対発現レベルの内部キャリブレーション標準（図3）。それはガラクトースで誘導後の細胞収穫のタイミングが重要であることを図4に示すデータから明らかである。 CFTRのドロップの収率は急激に誘導の約16時間後、酵母細胞内の任意の検出可能なCFTRは、誘導の24時間後にやっとそこにあるように。 精製タンパク質の収量は15リットル発酵槽培養液ごとに1-2mgを約CFTR蛋白質である。リカバリは、ミクロソームのステージに合計CFTR-GFP蛋白質までの約70％と推定され、タンパク質の精製約25％回復することができます。 S.のキャラクタリゼーション酵母発現CFTRは進行中である。図に見られる。 4、細胞内の蛋白質の場所は、蛍光顕微鏡で監視することができます。蛍光の多くが予想される10個のセルの周囲に発見されていますが、タンパク質の一部が点状の局在を表示、のいずれか、またはただ、おそらく後期ゴルジ体/エンドソーム経路14またはER 4からの輸送小胞の出芽のコンパートメント下流を通じてリサイクルをCFTRが原因である可能性があり、原形質膜の内側。 PNGaseF、タンパク質をdeglycosylates酵素を用いた治療は、それがグリコシル化されていることを意味し、SDS-PAGE上のCFTRタンパク質のバンドの移行に最小限の変化を示し、または最小限のグリコシル化15を有する。タンパク質のリン酸化状態の実験が進行中である。洗剤の一部にこれまでテストされ、精製されたタンパク質は、以前は2,15公開されたものに類似しているレートでATPase活性を（CFTR-特異的阻害剤16によって阻害されている）が表示されます。 CFTRチャネル活性の測定は、比較的高い臨界ミセル濃度（CMC）17を有する洗剤の最終的な精製工程を含意するでしょう精製タンパク質の再構成が必要になります。酵母ミクロソームのcontaininグラムCFTRは、例えば、一般的に&quot;マイルド&quot;であると考えられているドデシルマルトシド2のような界面活性剤を含むいくつかの一般的に用いられる界面活性剤18とsolublisedすることができます。しかし、最も高いCMC洗剤は、これらの界面活性剤にその交換を示唆し、これまでのところ、solubilsationでは不十分であることが判明している任意の精製スキームの後半の段階で考慮されるべきである。

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬/装置の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログがありません </td></tr><tr><td> PEP4削除10のFGY217 S.cerevisiae株 、 </td><td></td><td></td></tr><tr><td>アミノ酸を含まない酵母窒素塩基</td><td> Formedium </td><td> CYN0410 </td></tr><tr><td>ウラシルなく、サプリメント混合物を完了する</td><td> Formedium </td><td> DCS0169 </td></tr><tr><td>細菌学的寒天</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> A5306 </td></tr><tr><td> D-ガラクトース</td><td>フィッシャー</td><td> BP656-500 </td></tr><tr><td> D-グルコース</td><td>フィッシャー</td><td> D16-500 </td></tr><tr><td>ペプスタチン</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> P4265 </td></tr><tr><td>ロイペプチン</td><td>メルク</td><td> 108975 </td></tr><tr><td>キモスタチン</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> C7268 </td></tr><tr><td> Phenylmethanesulfonylfluoride（PMSF） </td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> P7626 </td></tr><tr><td> Epoxysuccinyl-leucylamido-ブタン（E-64） </td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> E3132 </td></tr><tr><td> Aminoethylbenzenesulfonylフッ化物（AEBSF） </td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> A8456 </td></tr><tr><td>ベンズアミジン塩酸塩</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> 434760 </td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド（DMSO） </td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> D8418 </td></tr><tr><td>ジチオスレイトール（DTT） </td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> 43815 </td></tr><tr><td>エチレンジアミン四酢酸（EDTA） </td><td>フィッシャー</td><td> BP120500 </td></tr><tr><td>トリス塩基</td><td> Formedium </td><td> TRIS01 </td></tr><tr><td>のTris-HCl </td><td>フィッシャー</td><td> P631 </td></TR&gt; <tr><td> D-ソルビトール</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> S1876 </td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>フィッシャー</td><td> 065017 </td></tr><tr><td> NaClを</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> S6191 </td></tr><tr><td> n-ドデシル-β-D-maltopyranoside </td><td>アフィメトリクス</td><td> D310S </td></tr><tr><td>ブロモフェノールブルー</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> 114391 </td></tr><tr><td> PageRulerプラスジウムタンパク質標準</td><td> Fermentas </td><td> SM1811 </td></tr><tr><td> NuSepトリス-Glyの4-20％グラジエントゲル</td><td> NuSep </td><td> NB10-420 </td></tr><tr><td>インスタントブルークマシー染色</td><td> Novexin </td><td> ISB1L </td></tr><tr><td>酸洗浄ガラスビーズ、 </td><td>シグマ</td><td> G8772 </td></tr><tr><td> 50ミリリットル滅菌ファルコンチューブ</td><td>ザルスタット</td><td> 62.547.254 </td></tr><tr><td> 2ミリリットル滅菌スクリュートップバイアル</td><td>ザルスタット</td><td> 72.694.005 </td></tr><tr><td> 250ミリリットル滅菌三角フラスコに困惑</td><td> BDバイオサイエンス</td><td> 355119 </td></tr><tr><td> 2リットル滅菌三角フラスコに困惑</td><td> BDバイオサイエンス</td><td> 355131 </td></tr><tr><td> 2ミリリットルマイクロチューブ</td><td>ザルスタット</td><td> 72.695 </td></tr><tr><td> 0.2μmのシリンジフィルター</td><td>縫工筋</td><td> FC121 </td></tr><tr><td>超遠心管</td><td>ベックマン·コールター</td><td> 355618 </td></tr><tr><td>遠心チューブ</td><td>ベックマン·コールター</td><td> 357000 </td></tr><tr><td> 1リットル遠心ポット</td><td>ベックマン·コールター</td><td> 969329 </td></tr><tr><td>軌道は、温度制御と振とう培養</td><td>ニューブランズウィックサイエンティフィック</td><td></td></tr><tr><td> Deltavision RT復元顕微鏡</td><td>アプライド·ビジョン</td><td></td></tr><tr><td>卓上型遠心機</td><td> HERMLE </td><td> Z300 </td></tr><tr><td>卓上型遠心</td><td>フィッシャー</td><td> 13-100-511 </td></tr><tr><td>ボルテックスミキサー</td><td>スターラボ</td><td></td></tr><tr><td>台風·トリオスキャナ</td><td> GEヘルスケア</td><td> 63-0055-87 </td></tr><tr><td> LAS3000イメージングシステム</td><td>富士</td><td></td></tr><tr><td> 20リットル発酵容器と制御ユニット</td><td> Applikon </td><td></td></tr><tr><td>定数系細胞のかく乱</td><td>定数システム</td><td></td></tr><tr><td> Beadbeater細胞かく乱</td><td> BioSpec </td><td> 1107900 </td></tr><tr><td>ミニbeadbeater-16 </td><td> BioSpec </td><td> 607 </td></tr><tr><td> JA-17ロトR </td><td>ベックマン·コールター</td><td> 369691 </td></tr><tr><td>オプティマL-100超遠心</td><td>ベックマン·コールター</td><td> 392050 </td></tr><tr><td> 50.2Tiローター</td><td>ベックマン·コールター</td><td> <a href="https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/page/itemDetails?itemNumber=337901" target="_blank">337901</a> </td></tr></tbody></table>

expression and purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator protein in saccharomyces cerevisiae

嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（CFTR）が変異すると、したがって、このタンパク質にはかなりの関心がhumans.Thereで嚢胞性線維症を生じさせることができるクロライドチャネルであるが、その構造と活性を研究するための努力は困難によって妨げられている1から3蛋白質の十分な量を発現し、精製する。多くの&quot;困難な&quot;真核生物の膜タンパク質と同様に、急成長している生物での発現が望ましいですが、やりがいがあり、酵母S.の酵母は 、これまで少量が得られた組換えタンパク質の急速な劣化が4-9を観察した。酵母における組換えCFTRの処理に関与するタンパク質は6-9に記載されている。本報告では、かなりの量の酵母とその浄化のCFTRの発現のための方法論を記述します。プロトコルは、以前のタンパク質分解の問題は克服することができる方法について説明し、どのように発現レベルのCFTRが大幅に細胞採取の前に特定の期間内に、細胞の成長条件を変更することにより、誘導条件を制御することによって改善することができます。このプロトコル（マウスCFTR発現酵母細胞または酵母プラスミド）に関連付けられているreagantsは、研究を後援している米国の嚢胞性線維症財団を介して配布されます。 CFTRの設計と合成、このレポートで用いコンストラクトを記述した記事が（; Thibodeau、P. ら 、未発表Urbatsch、I.）は別途公開されます。プラスミドを含む酵母（図1） - この記事では、CFTRの構築と酵母細胞の形質転換手法の始まりを説明します。構文は、C末端に融合CFTR緑色蛍光タンパク質（GFP）の配列を持っており、ドリューらによって開発されたシステム。（2008）10に従います 。 GFPは、CFTRの発現と精製は比較的容易に続くことができます。 Joveの可視化機能実装酵母細胞からミクロソームの調製後オール終了すると、我々はミクロソームからのタンパク質の精製のためのいくつかの提案が含まれていますが。読者はそれらに利用可能な蛋白質とローカル機器で実施される最終的な実験に依存し、ミクロソーム精製法に独自の変更を追加したい場合があります。酵母発現CFTR蛋白質は、部分的に本質的なポリヒスチジン精製タグを使用して、金属イオンアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製することができる。その後のサイズ排除クロマトグラフィーは、SDS-PAGEとゲルのクマシー染色で判定して、&gt; 90％純粋であると思われるタンパク質が得られます。

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Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

で嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（CFTR）を表現する試み<em&gt;サッカロマイセスセレビシエ</em&gt;今まで、タンパク質の比較的少量が得られている。嚢胞性線維症財団を介して配布このプロトコルと関連した試薬は、この &quot;難しい&quot;真核生物の膜蛋白質のミリグラム量の準備を許可する必要があります。

で嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子タンパク質の発現および精製サッカロマイセスセレビシエ

The  cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride  channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in  ...

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