Name: avidity-based extracellular interaction screening (avexis) for the scalable detection of low-affinity extracellular receptor-ligand interactions
Uploaded: 2012-03-05T13:00:00
Duration: 12 min 30 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Avidity-based Extracellular Interaction Screening AVEXIS for the Scalable Detection of Low-affinity Extracellular Receptor-Ligand Interactions at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av Wellcome Trust tilskuddet nummer [077108] tildelt GJW.

1. Kompilering et bibliotek med agn og byttedyr Plasmid-uttrykk vektorer <ol><li> Kompilere en liste over celleoverflaten reseptor og skilles proteiner av interesse å bli screenet for interaksjoner og hente sine sekvenser fra en passende protein sekvens database. De fleste proteinene inneholder en N-terminal sekretoriske signal peptid er egnet (disse inkluderer type I, GPI-koblede og skilles proteiner). Vanligvis ville en protein familie (f.eks immunglobulin superfamily eller alle reseptorer begrenset til en bestemt celletype som erytrocytt) velges. </li><li> Fastslå omfanget av ekstracellulær regionene ved å identifisere plasseringen av signal peptid og transmembrane region bruke protein funksjonen prediksjon programvare. Vi bruker vanligvis SignalP v3.0 5 og TMHMM v2.0 6. </li><li> Design primer sett som forsterker hele ectodomain fragment for hver reseptor. Vi har en pakke med agn og byttedyr vektorer som er egnet til dette formålet som er envailable fra Addgene ( <a href="http://www.addgene.org/">http://www.addgene.org/~~V</a> ). Design forstand primer rundt starten metionin å inkludere en Noti restriksjonsenzym området og en optimal Kozak sekvens, dette er fulgt av 25 basepar av eksakt match gen-spesifikk sekvens (fig 2A). </li><li> Designe antisens primer avkorte type I-reseptor proteiner rett før spådd transmembrane region slik som å uttrykke hele ectodomain som en løselig rekombinant protein. Inkluder en ASCI begrensning nettstedet i dette primer som deretter oversette i rammen til en C-terminal rotte Cd4d3 4 protein tag 7 (Fig. 2A). </li><li> Forsterke ectodomain fragmenter fra alle genene som bruker disse primere og klone dem inn agnet eller byttedyr vektor. Vi noen ganger finner det nyttig å først klone dem til shuttle vektorer før subcloning inn en passende pattedyr uttrykk vektor, bruker vi et derivat av den pTT3 vektoren 3,4. Både agnet og byttedyr vektorer contain C-terminal protein koder som følger (Fig. 2B). <ol><li> Agn: En kode som inneholder domener 3 og 4 av Rat CD4 (Cd4d3 4) protein etterfulgt av et peptid sekvens som er et substrat for E.coli Bira enzymet og kan derfor monobiotinylated på en bestemt lysin rest (Fig. 2B) . Den Cd4d3 4 tag er anerkjent av OX68 monoklonalt antistoff og brukes til å kvantifisere uttrykk for agnet proteiner ved ELISA. Agnet proteiner er derfor monomerisk og monobiotinylated. Ytterligere agn protein vektorer der biotinylatable peptid er erstattet av en 6-hans tag for rensing er tilgjengelig. </li><li> Preys: De jakter også inneholde en rotte Cd4d3 4 tag etterfulgt av en peptidsekvens fra rotte brusken oligomeric matrix protein (COMP) og en C-terminal β-lactamase enzymet. Den COMP peptid sikrer byttedyr former pentamers gang uttrykte (Fig. 2B). </li></ol></li></ol> 2. Prey-og agn-protein Expression Vi brukeren praktisk høyt nivå uttrykk systemet med suspensjon kultur HEK293E cellelinje 4 for å produsere våre protein bibliotekene, men alle pattedyr uttrykk system skal være egnet. En kommersielt tilgjengelig alternativ er Freestyle-systemet. Cellene blir rutinemessig dyrkes på en skjelvende plattform (125 rpm) ved 37 ° C, 5% CO 2 ved 70% relativ luftfuktighet. Både positive og negative kontroll proteiner må også komme til uttrykk. Rotta Cd4d3 4 tag-bare fragment er tilgjengelig som både en agn og byttedyr og er egnet negative kontroller. Tilsvarende agn og byttedyr vektorer som koder en positiv kontroll er tilgjengelige (Addgene), vi bruker vanligvis rotte CD200-Cd200R interaksjon 8. <ol><li> Seed de HEK293E cellene dagen før transfeksjon med en tetthet på 2,5 x 10 5 celler ml -1. Vi rutinemessig kultur cellene i volum på 50 ml i Freestyle293 media etter produsentens anbefalinger. For å sikre effektiv biotinylation, supplere than cellekultur medium som brukes til å produsere agn proteiner med D-biotin til en endelig konsentrasjon på 100 mikrometer. Medium brukes til å uttrykke byttedyr proteiner trenger ikke å bli supplert med ytterligere D-biotin. </li><li> Dagen etter, transfektere celler ved hjelp av en egnet transfections reagens (f.eks 293fectin). Bruk 25 mikrogram av agn eller byttedyr Plasmid konstruerer å transfektere en 50 ml kultur. Å produsere biotinylated baits, co-transfektere plasmidet kodingen agnet konstruere med et plasmid som koder for et utskilt form av E.coli protein-biotin ligase ( Bira) som er tilgjengelig fra Addgene. Co-transfektere agn plasmider på en 10:1 ratio (2,5 mikrogram) av plasmid kodingen det skilles Bira protein. </li><li> Harvest kulturer fem dager etter transfeksjon ved første pelletering cellene ved sentrifugering ved 3000 x g i 20 minutter, etterfulgt av filtrering av supernatanten gjennom et 0,22 mM filter. </li></ol> [Tips: Agn og byttedyr proteins bør lagres ufortynnet ved 4 ° C og som en generell retningslinje bør brukes innen ett år. Legg bacteriostatics som 50 mikrogram / ​​ml polymyxin B sulfat eller 10 mm NaN 3 for å hindre bakteriell kontaminering av supernatants.] 3. Normalisering av agn og byttedyr Prøver En av de viktigste funksjonene i AVEXIS analysen er at fordi rekombinante proteinene skilles de kan bli utvannet eller konsentrert (normalisert) til innenfor etablerte terskel aktiviteter før det brukes i analysen. Vi har funnet at nivåene der de rekombinante proteinene er uttrykt spenner over et bredt spekter - opp til 4 størrelsesordener - og så normalisering steget betydelig reduserer antall falske positiver under skjermene. 3.1 Bait normalisering Merk: ukonjugert D-biotin må fjernes fra media (typisk ved dialyse) siden det vil konkurrere med biotinylated bait protein for å binde seg til streptavidin bindingssteder. <ol><li> Overfør agn supernatants inn dialyse rør, etikett, klippe sikkert og dialyse mye mot en egnet buffer som PBS å fjerne fri biotin. </li></ol> [Tips: Vi har funnet at tilstrekkelig dialyse oppnås normalt for 6 x 50 ml agn supernatants mot et volum på 4,5 L av PBS med 4 endringer over en 24 timers periode. Utilstrekkelig dialyse kan observeres ved en hemming av protein binding til lave fortynninger i agnet normalisering trinn (Fig. 3A). <ol start="2"><li> Utfør en ELISA å bestemme den relative nivåer der agnet proteinene er uttrykt. Klargjør en fortynning rekke av de biotinylated agn proteiner og fange dem på en streptavidin-belagt microtitre plate. Bruk rotte Cd4d3 4 tag for å oppdage og kvantifisere de fangede agn proteiner med et monoklonalt antistoff (OX68). Konsentrer eller fortynne agn proteiner til det minimum som kreves for å mette alle Bioti bindingssteder i brønnen av en streptavidin-belagt plate. </li><li> Blokkere brønner på en streptavidin-belagt plate med fosfatbufret saline/0.1% Tween-20 (PBST) / 2% bovint serumalbumin (BSA) i 15 minutter. </li><li> I en egen plate, lage en fortynning serien (fire 1:3 fortynninger er vanligvis tilstrekkelig) av agn proteiner i PBST / 2% BSA og overføring til brønner av en streptavidin-belagt plate. Inkuber i 1 time ved romtemperatur. </li><li> Vask 3x i PBST. Tilsett 100 mL av 2 mikrogram / ml mus anti-rotte Cd4d3 fire IgG (OX68) inkuber i 1 time ved romtemperatur. </li><li> Vask 3x i PBST. Tilsett 100 mL av anti-mus alkalisk fosfatase ved 1:5,000 fortynning i PBST / 2% BSA og inkuber i 1 time ved romtemperatur. </li><li> Vask 3x i PBST og utføre en siste vask i PBS for å fjerne eventuelle rester av vaskemiddel. Tilsett 100 mL av 1 mg / ml Substrat 104 i dietanolamin buffer (10% dietanolamin (v / v), 0.5mm MgCl 2, 10 mM NaN 3, pH9.8, oppbevares beskyttet mot lys ved 4° C). </li><li> Etter en time, måle absorbansen ved 405 nm. Representative agn normalisering Resultatene er vist i Figur 3A. </li><li> Bait proteiner som er uttrykt på et nivå som er tilstrekkelig til å mette alle de biotin-bindende områder av en streptavidin-belagt plate, når det brukes ufortynnet, bør konsentreres hjelp Vivaspin konsentratorer (Vivascience, 10kDa MWCO). Som en guide, anslår vi at ~ 5 mikrogram av en typisk agn protein (~ 80 kDa) er tilstrekkelig til å mette en plate med 96 brønner. <ol><li> Bait proteiner uttrykt ved høye nivåer kan fortynnes i PBST / 2% BSA til en konsentrasjon nok til å mette streptavidin-belagt plate. Aktiviteten til de baits bør kontrolleres på nytt etter fortynning eller konsentrasjon for å sikre at de mette alle de biotin bindingssteder i streptavidin-belagt plate. </li></ol></li></ol> 3,2 Prey normalisering <ol><li> Kvantifisere de relative nivåer som byttet proteinene er uttrykt ved hjelp av β-lactamaseenzymaktivitet. </li><li> Først må en fortynning serie av supernatanten som inneholder byttedyr proteiner i PBST / 2% BSA buffer. Deretter legger 20 mL av fortynninger til 60 mL av en 242 mM (0,125 mg / ml) nitrocefin løsning (Calbiochem). </li><li> Umiddelbart overføre plate til en microtitre plateavleseren som tar en absorbans måling på 485 nm hvert minutt i 20 minutter ved romtemperatur. Representative byttedyr normalisering Resultatene er vist i Figur 3B. </li><li> Konsentrer prøver ved hjelp sentrifugal konsentratorer eller fortynne dem i PBST / 2% BSA å nå en terskel aktivitet av ~ 2 nmol min -1 omsetning på nitrocefin. Praktisk talt, dette oppnås hvis alle nitrocefin hydrolyseres innen ~~~HEAD=NNS 7 minutter. </li></ol> 4. AVEXIS Screening Procedure <ol><li> Vask en streptavidin-belagt plate i PBST. </li><li> Tilsett 100 mL av PBST / 2% BSA til hver brønn og inkuberes i 30 minutter for å blokkere eventuelle falske proteinbindingsseter innenfor hver brønn. </li&gt; </ol> [Tips: for å fjerne vaskebuffer etter vask trinn, er platen bankes - kraftig - på papirhåndklær] <ol start="3"><li> Fjern blokkering løsningen med en smart flikk av platen over vasken og tilsett 100 mL normalisert biotinylated monomerisk agn til de aktuelle brønnene og inkuber i 1 time ved romtemperatur. </li><li> Fjern agn prøver fra platen ved upturning platen og smart smekke over en vask, og vaske 3 ganger i PBST. </li><li> Tilsett 100 mL av normaliserte pentamerized byttedyr konstruere til hver brønn og inkuber ved romtemperatur i 1 time, vask som i trinn 4,4 og utføre en siste vask med PBS bare. </li><li> Legg 60 mL av 242 mM nitrocefin løsning (løse opp 5 mg nitrocefin i 500 mL av DMSO, bland godt og deretter videre fortynne nitrocefin i 40 mL PBS og passerer gjennom et 0,22 mM filter før du legger til de platene) og inkuber ved romtemperatur . Positive interaksjoner kan observeresav øyet siden den gule nitrocefin hydrolyseres til en rød farge. Kvantifisere ved å lese absorbans ved 485 nm ved hjelp av en plate leser. En typisk plate og kvantifisering er vist i fig. 4. </li></ol> [Tips: Positive interaksjoner er vanligvis observert innen 2 timer ved romtemperatur selv om platene bør plasseres ved 4 ° C i 16 timer for å sikre at alle potensielle interaksjoner er oppdaget. Vi har også funnet ut at utfelt nitrocefin og ujevnheter på plast av microtitre plate som riper / fingeravtrykk kan noen ganger føre til artefactual falske positiver ved 485 nm til tross for ingen åpenbar nitrocefin hydrolyse. Det er derfor tilrådelig å ta bilder av platene til visuelt registrere nitrocefin omsetning i brønnene.] 5. Representative Resultater Et eksempel på en representant AVEXIS screening plate er vist i Figur 4. Man bør observere hydrolyse (gult til rødt) av nitrocefin underlaget ipositiv kontroll brønner (både antistoff-mediert byttedyr fangst kontroll og også positiv kontroll interaksjon) innen ca ti minutter. Noen interaksjoner innenfor skjermen er også observert innen denne tid skala, men andre kan ta lengre tid (noen timer) skal vises. Vanligvis er en hit-rate på rundt 0.4 til 0.6% (en positiv samhandling for hver 150-250 interaksjoner bli screenet) typisk, avhengig av protein bibliotekene bli screenet. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/3881/3881fig1.jpg" /> Figur 1. Identifisering av reseptor-ligand interaksjoner medierende cellulære anerkjennelse prosesser ved hjelp AVEXIS. Skjematisk viser to samhandlende celler (A og B) utveksle informasjon gjennom interaksjon gjort mellom membran-embedded reseptor proteiner. AVEXIS er en skalerbar protein interaksjon analysen spesielt utviklet for å identifisere nye reseptor-ligand par som er preget av svært svake interaksjon styrker. Rekombinant såluble protein bibliotekene representerer hele ectodomain av cellen overflate reseptor repertoar av både celler lages enten som pentameric β-lactamase-merket preys (celle type A) eller monomere biotin-merket agn (for celle type B). Den pentamerisation av preys øker den lokale konsentrasjonen av ectodomains å effektuere en helhetlig grådighet gevinst slik at selv svært forbigående interaksjoner kan oppdages. Agnet biblioteket er kledd på streptavidin-belagte plater og systematisk analysert for interaksjoner med byttedyr proteiner. Etter en kort vask, blir eventuelle tatt preys oppdages ved hjelp av β-lactamase aktivitet knyttet til byttedyr. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/3881/3881fig2.jpg" /> Figur 2. Agn og byttedyr konstruere design. (A) rotte CD200 reseptorprotein gis som et eksempel på hvordan hele ectodomains i celle overflate reseptor proteiner bestemmes og primere er designet for å gjøre både agnog byttedyr uttrykk konstruksjoner. Den cDNA og oversatt protein sekvens vises fra N-terminal signal peptid til membranen-spenner transmembrane region rotte CD200. En følelse primer er laget for å inkludere en 5 &#39;Noti restriksjonsenzym hotellet og optimal Kozak sekvens etterfulgt av 25 baser av nøyaktig samsvar sekvens til CD200 cDNA sekvensen. Den antisens primer inneholder en ASCI området og 25 baser av eksakt match sekvensen lokalisert rett oppstrøms av den valgte ectodomain trunkering rester. For å holde ectodomain i rammen med rotte Cd4d3 4 tag, bør ASCI nettstedet oversette som Gly-Ala-Pro. (B) Skjematiske representasjoner av agnet og byttedyr uttrykk konstruksjoner. Hver inneholder reseptor ectodomains flankert av Noti og ASCI områder og en Cd4d3 4 tag. De agn inneholder en C-terminal peptidsekvens som kan være spesielt monobiotinylated av cotransfection med et plasmid som uttrykker et utskilt Bira enzym. De jakter følges av pentamerisation sekvensenfra brusk oligomeric matrix protein (COMP) og β-lactamase enzymet. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/3881/3881fig3.jpg" /> Figur 3. Normalisering av agn og byttedyr proteiner. (A) Representative eksempler på agn normalisering. En utvanning serie på fire forskjellige dialysert agn supernatants ble oppdaget av ELISA hjelp av en anti-CD4 tag monoklonalt antistoff. De fire agn er uttrykt på ulike nivåer 1&gt; 2&gt; 3&gt; 4. Agn bør normaliseres til en terskel nivå som gjennomsyrer biotin bindingssteder i hver brønn. Svært uttrykt agn kan fortynnes å spare protein (f.eks agn en kunne bli utvannet ~ 1:100), og dårlig uttrykt baits konsentrert. Redusert avlesninger ved lave fortynninger er ofte observert i noen baits (f.eks agn 2) som er knyttet til tilstedeværelsen av ukonjugert D-biotin på grunn av ufullstendig dialyse. (B) De nivåer som utnytter proteinene er exkamstål kvantifiseres hydrolyse rate av en β-lactamase substrat, nitrocefin. I eksemplet er de tre preys uttrykt på ulike nivåer: byttedyr 1&gt; 2&gt; 3. Preys bør normaliseres til en aktivitet av ~ 2 nmol min -1, noe som tilsvarer fullføre hydrolyse av 14,5 nmol nitrocefin på ~~~HEAD=NNS 7 minutter (f.eks byttedyr 1). De andre jakter i dette eksempelet bør konsentreres før bruk i screening. <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/3881/3881fig4.jpg" /> Figur 4. Representative AVEXIS screening resultater. (A) Et fotografi av en representant AVEXIS screening plate. En byttedyr protein er analysert mot 41 forskjellige agn og en positiv samhandling er oppdaget i godt E2. Kontroller som brukes i screening platene er: en biotinylated anti-CD4 antistoff å fange alle byttet protein lagt til brønnen (G6), en kontroll interaksjon: rat CD200 (agn)-Cd200R (byttedyr) med Cd200R byttedyr brukes ved terskel fortynning (H3), 1:10 (H4) og 1:100 (H5). Negative kontroller var: en Cd4d3 4 agn probed med byttet proteinet blir screenet (H1) og Cd200R byttedyr (H2). (B) Kvantifisering av de absorbansavlesninger verdier av det samme skjermbildet utført i tre eksemplarer. Datapunktene er gjennomsnitt ± SD.

<ol>
	<li>Fagerberg, L., Jonasson, K., von Heijne, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prediction+of+the+human+membrane+proteome.">Prediction of the human membrane proteome.</a> Proteomics. 10, 1141-1141 (2010).</li><li>Wright, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+initiation+in+biological+systems:+the+properties+and+detection+of+transient+extracellular+protein+interactions.">Signal initiation in biological systems: the properties and detection of transient extracellular protein interactions.</a> Molecular bioSystems. 5, 1405-1405 (2009).</li><li>Bushell, K. M., Sollner, C., Schuster-Boeckler, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+screening+for+novel+low-affinity+extracellular+protein+interactions.">Large-scale screening for novel low-affinity extracellular protein interactions.</a> Genome research. 18, 622-622 (2008).</li><li>Durocher, Y., Perret, S., Kamen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-level+and+high-throughput+recombinant+protein+production+by+transient+transfection+of+suspension-growing+human+293-EBNA1+cells.">High-level and high-throughput recombinant protein production by transient transfection of suspension-growing human 293-EBNA1 cells.</a> Nucleic acids research. 30, e9-e9 (2002).</li><li>Bendtsen, J. D., Nielsen, H., von Heijne, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+Prediction+of+Signal+Peptides:+SignalP+3.0.">Improved Prediction of Signal Peptides: SignalP 3.0.</a> Journal of molecular biology. 340, 783-783 (2004).</li><li>Krogh, A., Larsson, B., von Heijne, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predicting+transmembrane+protein+topology+with+a+hidden+markov+model:+application+to+complete+genomes.">Predicting transmembrane protein topology with a hidden markov model: application to complete genomes.</a> Journal of molecular biology. 305, 567-567 (2001).</li><li>Brown, M. H., Barclay, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+immunoglobulin+and+scavenger+receptor+superfamily+domains+as+chimeric+proteins+with+domains+3+and+4+of+CD4+for+ligand+analysis.">Expression of immunoglobulin and scavenger receptor superfamily domains as chimeric proteins with domains 3 and 4 of CD4 for ligand analysis.</a> Protein engineering. 7, 515-515 (1994).</li><li>Wright, G. J., Puklavec, M. J., Willis, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphoid/neuronal+cell+surface+OX2+glycoprotein+recognizes+a+novel+receptor+on+macrophages+implicated+in+the+control+of+their+function.">Lymphoid/neuronal cell surface OX2 glycoprotein recognizes a novel receptor on macrophages implicated in the control of their function.</a> Immunity. 13, 233-23 (2000).</li><li>Dustin, M. L., Golan, D. E., Zhu, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+affinity+interaction+of+human+or+rat+T+cell+adhesion+molecule+CD2+with+its+ligand+aligns+adhering+membranes+to+achieve+high+physiological+affinity.">Low affinity interaction of human or rat T cell adhesion molecule CD2 with its ligand aligns adhering membranes to achieve high physiological affinity.</a> The Journal of biological chemistry. 272, (1997).</li><li>Wright, G. J., Martin, S., Bushell, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+identification+of+transient+extracellular+protein+interactions.">High-throughput identification of transient extracellular protein interactions.</a> Biochemical Society transactions. 38, (2010).</li><li>de Wildt, R. M., Tomlinson, I. M., Ong, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+receptor-ligand+pairs+by+capture+of+long-lived+multivalent+interaction+complexes.">Isolation of receptor-ligand pairs by capture of long-lived multivalent interaction complexes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, (2002).</li><li>Jiang, L., Barclay, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+leucocyte+surface+protein+interactions+by+high-throughput+screening+with+multivalent+reagents.">Identification of leucocyte surface protein interactions by high-throughput screening with multivalent reagents.</a> Immunology. 129, 55-55 (2010).</li><li>Urech, D. M., Lichtlen, P., Barberis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+growth+selection+system+to+detect+extracellular+and+transmembrane+protein+interactions.">Cell growth selection system to detect extracellular and transmembrane protein interactions.</a> Biochimica et biophysica acta. 1622, 117-117 (2003).</li><li>Voulgaraki, D., Mitnacht-Kraus, R., Letarte, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multivalent+recombinant+proteins+for+probing+functions+of+leucocyte+surface+proteins+such+as+the+CD200+receptor.">Multivalent recombinant proteins for probing functions of leucocyte surface proteins such as the CD200 receptor.</a> Immunology. 115, 337-337 (2005).</li><li>Wojtowicz, W. M., Wu, W., Andre, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+vast+repertoire+of+Dscam+binding+specificities+arises+from+modular+interactions+of+variable+Ig+domains.">A vast repertoire of Dscam binding specificities arises from modular interactions of variable Ig domains.</a> Cell. 130, 1134-1134 (2007).</li><li>Martin, S., Sollner, C., Charoensawan, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+a+Large+Extracellular+Protein+Interaction+Network+and+Its+Resolution+by+Spatiotemporal+Expression+Profiling.">Construction of a Large Extracellular Protein Interaction Network and Its Resolution by Spatiotemporal Expression Profiling.</a> Mol. Cell. Proteomics. 9, 2654-2654 (2010).</li><li>Crosnier, C., Bustamante, L. Y., Bartholdson, S. J., Bei, A. K., Theron, M., Uchikawa, M., Mboup, S., Ndir, O., Kwiatkowski, D. P., Duraisingh, M. T., Rayner, J. C., Wright, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basigin+is+a+receptor+essential+for+erythrocyte+invasion+by+Plasmodium+falciparum.">Basigin is a receptor essential for erythrocyte invasion by Plasmodium falciparum.</a> Nature. 480, 534-537 (2011).</li><li>Sollner, C., Wright, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cell+surface+interaction+network+of+neural+leucine-rich+repeat+receptors.">A cell surface interaction network of neural leucine-rich repeat receptors.</a> Genome biology. 10, R99-R99 (2009).</li></ol>

Forfatterne har ikke noe å avsløre.

Når levende celler er observert in vivo, deres plasmamembranen utvise svært dynamiske atferd: utvide og skuf membranprosesser som de kontakt og kommunisere med sine naboer to. De fysiske interaksjoner mellom membran-embedded reseptor proteiner som formidler mange av disse kontaktene har utviklet seg til å være ekstremt svak, slik som å tillate denne svært bevegelige oppførsel. Det har blitt anslått at monomere samhandling styrker like svak som 50 mikrometer kan være tilstrekkelig til å kjøre spontane interaksjoner på fysiologiske receptor tettheter 9 som gjør oppdage nye interaksjoner ekstremt utfordrende 2,10. Den AVEXIS Metoden er beskrevet her gir en sensitiv metode for å påvise forbigående ekstracellulært protein: protein interaksjoner som kan implementeres i en skalerbar måte med en lav falsk positiv rate. Mens andre skalerbare metoder har blitt utviklet for å oppdage ekstracellulære interaksjoner 11-15,En fordel med AVEXIS er at de eksperimentelle parametere som agn og byttedyr aktiviteter har blitt kvantifisert å oppdage selv den svakeste av interaksjoner (t 1/2 ≤ 0,1 s) og samtidig beholde en lav falske positive tre. I tillegg har strømlinjeformet og robust prøveopparbeidelse prosedyrer aktivert denne analysen skal implementeres på en mye større skala enn andre analyser, og vi har nylig beskrevet en systematisk samhandling skjerm på over ~~~HEAD=NNS 16.500 potensielle interaksjoner 16. Analysen kan utføres på ethvert protein som det er mulig å uttrykke en løselig rekombinant protein fragment. Dette inkluderer derfor proteiner som inneholder en N-terminal signal peptid som type I, GPI-koblede og utskilt proteiner. Vi har nylig laget en pakke med vektorer som nå gjør oss i stand til å uttrykke type II proteiner som agn 17. Den analysen er vanligvis ikke egnet for MultiPASS membran proteiner som ion transporters eller pumper, siden de er lite sannsynlig å være korrekt brettes utenfor rammen av en plasma membran. Vi har brukt denne til en rekke ulike systemer og har nå uttrykt ekstracellulære proteiner fra 3,16,18 sebrafisk, menneskelige, mus og P. falciparum for interaksjon skjermer. I forhold til de ressurser som kreves for å sette opp en AVEXIS skjerm, har vi funnet at en betydelig flaskehals er utvalget, konstruksjon, og full sekvensering av uttrykket plasmider. Dette aspektet av metoden kan ta opptil et år å lage ~ 100 agn og byttedyr konstruerer, men med redusere kostnadene for genet syntese, har vi nå favorisere kommersielt outsourcing dette aspektet av prosjektet. Hos pattedyr uttrykket systemet sammen med en stor skjelvende vev kulturinkubatoren (vi bruker en INFORS HT Multitron Cell) muliggjør en enkelt forsker å uttrykke og normalisere opp til ~ 100 agn og byttedyr proteiner en måned. Når proteiner er produsert og normalisert, screening for interaksjoner er rask med opptil tolv 96-brønns plater blir gunstig behandlet per dag. Den eneste skreddersydd utstyr som vi har utviklet for å forenkle produksjonen av et så stort antall proteiner er en komprimert luft-drevet stempel som brukes til å passere opptil fem supernatants gjennom et 0.22μm filter parallelt. Den største klassen av interaksjoner som kan være savnet i forhold til interaksjoner forventet fra litteraturen (falske negative) er homophilic interaksjoner, selv om noen av disse interaksjonene kan oppdages tre. I de tilfeller der forventede interaksjoner ikke er oppdaget, mener vi at dette skyldes dannelse av homophilic interaksjon ved byttet proteiner (en bytte &quot;maskering&quot; effekt) som igjen hindrer ytterligere samhandling med immobilisert agn proteiner. Frekvensen der samhandling er oppdaget avhenger av innholdet av protein biblioteket bli screenet. Som en veiledning til leseren, en skjerm på&gt; 30Resulterte 000 interaksjoner i sebrafisk immunglobulin superfamily i 188 positiver - en frekvens på 0,6% 3,16,18. En veldig rask sjekk som kan utføres for å kontrollere eventuelle positive treff er å avgjøre om interaksjon kan påvises i både agn-byttedyr orientering, som er, kan den samme interaksjonen bli oppdaget uavhengig av om proteiner er til stede enten som agn eller et bytte. Når vi har observert dette gjensidighetsavtaler atferd, har den bindende senere vist seg å være spesifikk ved å demonstrere direkte mettbar binding av renset proteiner med overflaten plasmon resonans. Det bør understrekes at fordi vi øke bindingen grådighet ved å kunstig pentamerising byttet proteinene vi ikke anser at analysen egnet for kvantitativt sammenlikne interaksjon styrker. For å oppnå biofysiske bindende parametere for interaksjon vi bruker monomere proteiner og overflate plasmon resonans. Til slutt, når en interaksjon har blitt identifisert, hiGH gjennomstrømning natur analysen gjør det relativt enkelt å tilpasse analysen til skjermen for reagenser som antistoffer eller små molekyler som blokkerer interaksjon.

<table border="1"><tbody><tr><td> Navn på reagens </td><td> Firma </td><td> Cat. Antall </td><td> Kommentarer </td></tr><tr><td> Freestyle media </td><td> Invitrogen </td><td> 12338018 </td><td></td></tr><tr><td> Nitrocefin </td><td> Calbiochem </td><td> 484400 </td><td></td></tr><tr><td> SA-belagte mikrotiterplater </td><td> Nunc </td><td> 734-1284 </td><td></td></tr><tr><td> OX68 antistoff </td><td> AbDSerotec </td><td> MCA1022R </td><td></td></tr><tr><td> Dialyse tubing </td><td> Pierce </td><td> PN68100 </td><td></td></tr><tr><td> Polymyxin B </td><td> Sigma </td><td> P4932 </td><td></td></tr><tr><td> D-biotin </td><td> Sigma </td><td> B4639-5G </td><td></td></tr><tr><td> Substrat-104 </td><td> Sigma </td><td> 1040-506 </td><td></td></tr><tr><td> Vivaspin-20 sentrifugal konsentratorer </td><td> Sartorius </td><td> VS2002 </td><td></td></tr><tr><td> 0,22 mikrometer filtre </td><td> Nalgene </td><td> 190-2520 </td><td></td></tr></tbody></table>

avidity-based extracellular interaction screening (avexis) for the scalable detection of low-affinity extracellular receptor-ligand interactions

Ekstracellulært protein: protein interaksjoner mellom skilles eller membran-bundet proteiner er avgjørende for både å initiere intercellulær kommunikasjon og sikre samhold innen flercellede organismer. Proteiner spådd å danne ekstracellulære samhandling kodes med cirka en fjerdedel av menneskets gener 1, men til tross for deres betydning og overflod, har de fleste av disse proteinene ingen dokumentert bindende partner. Primært er dette grunnet deres biokjemiske intractability: membran-innebygde proteiner er vanskelig å solubilise i sitt eget eksteriør og inneholder strukturelt viktige posttranslational modifikasjoner. Dessuten er samspillet slektskap mellom reseptor proteiner ofte preget av ekstremt lave samhandling styrker (halveringstider &lt;1 sekund) utelukker deres deteksjon med mange vanlig brukte høy gjennomstrømning metoder 2. Her beskriver vi en analyse, AVEXIS (grådighet-basert EXtracelluLar Interaction Screen) som overvinner disse tekniske utfordringene som muliggjør påvisning av svært svake protein interaksjoner (t 1/2 ≤ 0,1 sek) med en lav falske positive tre. Analysen er vanligvis implementert i en høy gjennomstrømning format for å muliggjøre systematisk screening av mange tusen interaksjoner i en praktisk microtitre plate format (Fig. 1). Det er avhengig av produksjon av løselige rekombinante protein biblioteker som inneholder ectodomain fragmenter av reseptorer på celleoverflaten eller utskilt proteiner innen hvilke til skjermen for samhandling, og derfor er denne tilnærmingen passer for type I, type II, GPI-koblede reseptorer på celleoverflaten og skilles proteiner, men ikke for MultiPASS membran proteiner som ionekanaler eller transportører. De rekombinante protein bibliotekene er produsert ved hjelp av en praktisk og høyt nivå pattedyr uttrykk system 4, for å sikre at viktige posttranslational modifikasjoner som glycosylasjon og disulfid obligasjoner legges. Uttrykte rekombinante proteiner utskilles i medium og produsert i to former: en biotinylated agn som kan fanges på en streptavidin-belagt fast fase egnet for screening, og en pentamerised enzym-merket (β-laktamase) byttedyr. Agnet og byttedyr proteiner blir presentert for hverandre i en binær måte å oppdage direkte interaksjoner mellom dem, tilsvarende en konvensjonell ELISA (Fig. 1). Den pentamerisation av proteiner i byttedyr oppnås gjennom en peptidsekvens fra brusk oligomeric matrix protein (COMP) og øker den lokale konsentrasjonen av ectodomains dermed gi betydelige grådighet gevinster å aktivere selv svært forbigående interaksjoner å bli oppdaget. Ved å normalisere virksomhet både agn og byttedyr til forhåndsbestemte nivåer før screening, har vi vist at samhandling har monomere halveringstider på 0,1 sek kan oppdages med lave falske positive priser 3.

Watch this Scientific Journal Video about Avidity-based Extracellular Interaction Screening AVEXIS for the Scalable Detection of Low-affinity Extracellular Receptor-Ligand Interactions at JoVE.com

Avidity-based Extracellular Interaction Screening AVEXIS for the Scalable Detection of Low-affinity Extracellular Receptor-Ligand Interactions

AVEXIS er en høy gjennomstrømning protein interaksjon analyse utviklet til systematisk skjermen for romanen ekstracellulære reseptor-ligand par involvert i cellulære anerkjennelse prosesser. Den er spesielt designet for å oppdage forbigående protein interaksjoner som er vanskelig å identifisere ved hjelp av andre med høy gjennomstrømning tilnærminger.

Grådighet-basert Ekstracellulær Interaction Screening (AVEXIS) for Scalable Detection of Low-affinitet ekstracellulære Receptor-ligand interaksjoner

Extracellular protein:protein interactions between secreted or membrane-tethered proteins are critical for both initiating intercellular communication and ...

Research

JoVE Journal

Biology

Avidity-based Extracellular Interaction Screening (AVEXIS) for the Scalable Detection of Low-affinity Extracellular Receptor-Ligand Interactions

OLIgo Mass Profiling (OLIMP) of Extracellular Polysaccharides

OLIgo Mass Profiling OLIMP of Extracellular Polysaccharides

The direct contact of cells to the environment is mediated in many organisms by an extracellular matrix. One common aspect of extracellular matrices is ...

Techniques for the Analysis of Extracellular Vesicles Using Flow Cytometry

Teknikker for analyse av Ekstracellulær Blemmer ved hjelp av flowcytometri

Extracellular Vesicles (EVs) are small, membrane-derived vesicles found in bodily fluids that are highly involved in cell-cell communication and help ...

Measurement of Extracellular Ion Fluxes Using the Ion-selective Self-referencing Microelectrode Technique

Måling av Ekstracellulær Ion Flukser Bruke Ion-selektive selvreferanser microelectrode Technique

Cells from animals, plants and single cells are enclosed by a barrier called the cell membrane that separates the cytoplasm from the outside. Cell layers ...

Efficient Mammalian Cell Expression and Single-step Purification of Extracellular Glycoproteins for Crystallization

Effektiv pattedyrcelle Expression og Single-step Rensing av Ekstracellulær Glykoproteiner for Krystallisering

Production of secreted mammalian proteins for structural and biophysical studies can be challenging, time intensive, and costly. Here described is a time ...

Scanning Electron Microscopy of Macerated Tissue to Visualize the Extracellular Matrix

Skanning elektronmikroskopi av oppmalte Tissue å visualisere den ekstracellulære matriks

Fibrosis is a component of all forms of heart disease regardless of etiology, and while much progress has been made in the field of cardiac matrix ...

A Rapid, Scalable Method for the Isolation, Functional Study, and Analysis of Cell-derived Extracellular Matrix

A Rapid, skalerbar fremgangsmåte for isolering, Functional Study, og analyse av celle-avledet ekstracellulær matriks

The extracellular matrix (ECM) is recognized as a diverse, dynamic, and complex environment that is involved in multiple cell-physiological and ...

Establishment of an Extracellular Acidic pH Culture System

Etablering av en ekstracellulære surt pH kultur-systemet

Conditions of the tumor microenvironment, such as hypoxia or nutrient starvation, play critical roles in cancer progression and malignancy. However, the ...

A BW Reporter System for Studying Receptor-Ligand Interactions

En BW Reporter System for å studere reseptor-Ligand interaksjoner

Interactions between receptors and ligands constitute a fundamental biological process. However, direct experiments with cells that express the native ...

Nanoparticle Tracking Analysis for the Quantification and Size Determination of Extracellular Vesicles

Nanopartikkelsporingsanalyse for kvantifisering og størrelsesbestemmelse av ekstracellulære vesicles

The physiological and pathophysiological roles of extracellular vesicles (EVs) have become increasingly recognized, making the EV field a quickly evolving ...

Extracellular Vesicle Uptake Assay via Confocal Microscope Imaging Analysis

Extracellular Vesicle Uptake Assay via Confocal Microscope Imaging Analysis

Ekstracellulær vesicle opptak analyse via confocal mikroskop imaging analyse

There is a need for practical assays to visualize and quantify the cells' extracellular vesicle (EV) uptake. EV uptake plays a role in intercellular ...