Name: monitoring changes in the intracellular calcium concentration and synaptic efficacy in the mollusc aplysia
Uploaded: 2012-07-15T14:00:00
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A PHS Grant (MH51393) apoiaram este trabalho. Alguns dos Aplysia usamos são fornecidas pelo Nacional de Recursos para Aplysia, da Universidade de Miami, Grant RR10294 do Centro Nacional de Pesquisa de Recursos, NIH.

1. Preparação <ol><li> Anestesiar os animais por injecção de 75-100 ml de solução isotónica de cloreto de magnésio. O Aplysia usamos para imagiologia são geralmente 150-200 gramas e são obtidos a partir Marinus Scientific. </li><li> Pin o animal anestesiado para um prato coberto de cera. Agulhas de seringa funcionam bem para esta finalidade; técnicas estéreis não são necessárias. Utilizando uma pinça e tesouras brutas padrão fazer uma incisão no pé do animal e expor a massa bucal. Localizar...

<ol>
	<li>Zucker, R. S., Regehr, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-term+synaptic+plasticity.">Short-term synaptic plasticity.</a> Annu. Rev. Physiol. 64, 355-405 (2002).</li><li>Eberhard, M., Erne, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+binding+to+fluorescent+calcium+indicators:+Calcium+green,+calcium+orange+and+calcium+crimson.">Calcium binding to fluorescent calcium indicators: Calcium green, calcium orange and calcium crimson.</a> Biochem. Biophysical Res. Comm. 180, 209-215 (1991).</li><li>Escobar, A. L., Velez, P., Kim, A. M., Cifuentes, F., Fill, M., Vergata, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+properties+of+DM-nitrophen+and+calcium+indicators:+rapid+transient+response+to+flash+photolysis.">Kinetic properties of DM-nitrophen and calcium indicators: rapid transient response to flash photolysis.</a> Eur. J. Physiol. 434, 615-631 (1997).</li><li>Ivanov, A. I., Calabrese, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+spike-mediated+synaptic+transmission+by+presynaptic+background+Ca2++in+leech+heart+interneurons.">Modulation of spike-mediated synaptic transmission by presynaptic background Ca2+ in leech heart interneurons.</a> J. Neurosci. 23, 1206-1218 (2003).</li><li>Rosen, S. C., Miller, M. W., Evans, C. G., Cropper, E. C., Kupfermann, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+synaptic+connections+between+peptidergic+radula+mechanoafferent+neurons+and+neurons+in+the+feeding+system+of+Aplysia.">Diverse synaptic connections between peptidergic radula mechanoafferent neurons and neurons in the feeding system of Aplysia.</a> J. Neurophysiol. 83, 1605-1620 (2000).</li><li>Ludwar, B. C. h., Evans, C. G., Jing, J., Cropper, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+distinct+mechanisms+mediate+potentiating+effects+of+depolarization+on+synaptic+transmission.">Two distinct mechanisms mediate potentiating effects of depolarization on synaptic transmission.</a> J. Neurophysiol. 102, 1976-1983 (2009).</li><li>Evans, C. G., Ludwar, B. C. h., Askansas, J., Cropper, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+holding+potential+on+the+dynamics+of+homosynaptic+facilitation.">Effect of holding potential on the dynamics of homosynaptic facilitation.</a> J. Neurosci. 31, 11039-11043 (2011).</li><li>Haugland, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Handbook. , (2005).</li><li>Borovikov, D., Evans, C. G., Jing, J., Rosen, S. C., Cropper, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+proprioceptive+role+for+an+exteroceptive+mechanoafferent+neuron+in+Aplysia.">A proprioceptive role for an exteroceptive mechanoafferent neuron in Aplysia.</a> J. Neurosci. 20, 1990-2002 (2000).</li><li>Goldberg, J. H., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+38:+A+practical+guide:+Two-photon+calcium+imaging+of+spines+and+dendrites.">Chapter 38: A practical guide: Two-photon calcium imaging of spines and dendrites.</a> Imaging in Neuroscience and Development. , (2005).</li></ol>

Nós demonstramos técnicas que podem ser usadas para controlar simultaneamente a concentração de cálcio intracelular e avaliar a eficácia da transmissão sináptica. Estas técnicas são úteis para determinar o modo como diversas formas de plasticidade de curto prazo são mediados. A formação de imagens é realizada com um microscópio de fluorescência e câmara CCD. Estes requisitos equipamentos são relativamente modestos quando comparados com a maioria funcionais de imagem set-up...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de Catálogo </td><td> Comentário </td></tr><tr><td> Cálcio Laranja </td><td> Invitrogen </td><td> C-3013 </td><td></td></tr><tr><td> EGTA </td><td> Sigma </td><td> E-4378 </td><td></td></tr><tr><td> Cálcio kit padrão de calibração </td><td> Invitrogen </td><td> C-3008MP </td><td> útil para testar a sensibilidade e a gama dinâmica do sinal </td></tr><tr><td> Hexa-hidrato de cloreto de magnésio </td><td> Sigma </td><td> M0250 </td><td> utilizado em solução 0,33 M de anestesiar animais </td></tr></tbody></table> Reagentes Tabela 1. Usado. <table border="1"><tbody><tr><td> Nome Equipamento </td><td> Companhia </td><td> Comentário </td></tr><tr><td> FN-1 microscópio vertical fluorescência </td><td> Nikon Instruments </td><td> com Narishige ITS-FN1 etapa </td></tr><tr><td> NMN-21 manipuladores </td><td> Narishige </td><td> montado no palco com ímãs </td></tr><tr><td> CoolSNAP HQ 2 câmera CCD </td><td> Fotometria </td><td></td></tr><tr><td> NIS elementos AR (Versão 3.22) </td><td> Nikon Instruments </td><td> software de imagem usado para adquirir dados de fluorescência </td></tr><tr><td> 10X/0.3w Plano Fluor objetivo </td><td> Nikon Instruments </td><td> esta lente de imersão em água tem uma longa distância de trabalho de 3,5 mm </td></tr><tr><td> X-Cite 120 lâmpadas de metal haleto PC </td><td> EXFO </td><td> utilizado para imagiologia de fluorescência </td></tr><tr><td> LS-DWL lâmpada halógena </td><td> Sumica </td><td></td></tr><tr><td> ET-CY3 conjunto de filtros </td><td> Tecnologia Chroma </td><td>; </td></tr><tr><td> Poder 1401 conversor A / D </td><td> Cambridge Electronic Design </td><td> amostragem foi feita em 3 kHz </td></tr><tr><td> Ponto II (Versão 7.07) </td><td> Cambridge Electronic Design </td><td> software usado para adquirir dados de eletrofisiologia </td></tr><tr><td> SEC-10 LX amplificador </td><td> NPI eletrônica </td><td> usado com um andar de entrada 10X </td></tr><tr><td> Amplificador modelo 410 </td><td> Brownlee precisão </td><td> utilizado para amplificar e filtrar o sinal </td></tr><tr><td> WS-4 </td><td> menos k Tecnologia </td><td> isolamento de vibração para imagens </td></tr><tr><td> plataforma de resfriamento </td><td> feitos </td><td> placa de metal através do qual é bombeada água gelada, a uma taxa variável </td></tr></tbody></table> Tabela 2. Equipamento utilizado.

monitoring changes in the intracellular calcium concentration and synaptic efficacy in the mollusc aplysia

Tem sido sugerido que alterações no cálcio intracelular mediar a indução de um certo número de importantes formas de plasticidade sináptica (facilitação, por exemplo homossináptica significa) 1. Estas hipóteses podem ser testadas simultaneamente monitorizar alterações de cálcio intracelular e alterações na eficácia sináptica. Nós demonstrar como este pode ser realizado através da combinação de imagens com as técnicas de gravação de cálcio intracelulares. Nossos experimentos são realizados em um gânglio vestibular do molusco Aplysia californica. Esta preparação tem um número de características vantajosas, experimentalmente: Ganglia pode ser facilmente removido do Aplysia e experimentos usar neurónios adultos que fazem conexões sinápticas normais e têm uma distribuição normal do canal de iões. Devido à baixa taxa metabólica do animal, e as temperaturas relativamente baixas (14-16 ° C) que são naturais para Aplysia, as preparações são estáveis ​​durante longos períodos de tempo. &gt; ent &quot;Para detectar alterações de cálcio intracelular livre, vamos utilizar a versão celular impermeante de cálcio Orange 2, que é facilmente&quot; carregado &quot;em um neurônio através de iontoforese. Quando este corante fluorescente de comprimento de onda longo liga ao cálcio, aumenta a intensidade de fluorescência. cálcio Orange tem rápidas propriedades cinéticas 3 e, ao contrário de corantes raciométrica (por exemplo, Fura 2), não requer nenhuma roda de filtros para imagens. É bastante foto estável e menos fototóxica do que outros corantes (por exemplo, fluo-3) 2,4. Assim como todos os não-raciométrica corantes, cálcio Laranja indica alterações relativas na concentração de cálcio. Mas, uma vez que não é possível em conta as variações na concentração de corante, devido às operações de carga e de difusão, que não pode ser calibrado para proporcionar as concentrações de cálcio absolutos. Uma posição vertical, fixo platina do microscópio composto, foi utilizado para os neurónios de imagem com uma câmara CCD capaz de gravação de cerca de 30 quadros por segundo. Em Aplysia esta resolução temporalé mais do que adequada para detectar mesmo um único pico de alteração induzida na concentração de cálcio intracelular. Eletrodos pontiagudos são simultaneamente usado para induzir e gravar a transmissão sináptica em neurônios identificados pré e pós-sináptica. Na conclusão de cada teste, um script personalizado combina eletrofisiologia e dados de imagem. A fim de assegurar a sincronização adequada usamos um pulso de luz a partir de um diodo emissor de luz montado na porta da câmara do microscópio. Manipulação dos níveis de cálcio pré-sinápticos (por exemplo, através da injeção intracelular EGTA) nos permite testar hipóteses específicas, sobre o papel do cálcio intracelular na mediação de várias formas de plasticidade.

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Monitoring Changes in the Intracellular Calcium Concentration and Synaptic Efficacy in the Mollusc Aplysia

Demonstramos como alterações na concentração do cálcio intracelular livre e eficácia sináptica podem ser monitorizados simultaneamente num gânglio de preparação<em&gt; Aplysia</em&gt;. Nós imagem de cálcio intracelular utilizando um corante fluorescente, o laranja de cálcio, e induzir e controlar a transmissão sináptica, com cortantes (intracelular) eléctrodos.

Alterações de monitoramento da concentração de cálcio intracelular e eficácia sináptica no Molusco<em&gt; Aplysia</em

It has been suggested that changes in intracellular calcium mediate the induction of a number of important forms of synaptic plasticity (e.g., ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Monitoring Changes in the Intracellular Calcium Concentration and Synaptic Efficacy in the Mollusc Aplysia

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Visualização de Propriocepção em<em&gt; Drosophila</em&gt; As larvas e pupas

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other ...

Neurociência

Electroporation of the Hindbrain to Trace Axonal Trajectories and Synaptic Targets in the Chick Embryo

Eletroporação do rombencéfalo rastrear Trajetórias axonal e Metas Synaptic no embrião de galinha

Electroporation of  the chick embryonic neural tube has many advantages such as being quick and efficient  for the expression of foreign genes into ...

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

Vivo em dois fótons de imagem de experiência dependentes de alterações moleculares em neurônios corticais

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

Rápido Micro-iontoforese de glutamato e GABA: uma ferramenta útil para investigar Integração Synaptic

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

The Neuromuscular Junction: Measuring Synapse Size, Fragmentation and Changes in Synaptic Protein Density Using Confocal Fluorescence Microscopy

A Junção Neuromuscular: Synapse Medir o tamanho, Mudanças de fragmentação e em Synaptic Density proteína utilizando microscopia de fluorescência confocal

The neuromuscular junction (NMJ) is the large, cholinergic relay synapse through which mammalian motor neurons control voluntary muscle contraction. ...

Utilizing Combined Methodologies to Define the Role of Plasma Membrane Delivery During Axon Branching and Neuronal Morphogenesis

Utilizando metodologias combinadas para definir o papel do Plasma Membrane entrega durante Axon Ramificação e Neuronal morfogênese

During neural development, growing axons extend to multiple synaptic partners by elaborating axonal branches. Axon branching is promoted by extracellular ...

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

Gravação induzida pela temperatura actividade neuronal através de monitoramento das alterações de cálcio no bulbo olfativo de<em&gt; Xenopus laevis</em

The olfactory system, specialized in the detection, integration and processing of chemical molecules is likely the most thoroughly studied sensory system. ...

Loading a Calcium Dye into Frog Nerve Endings Through the Nerve Stump: Calcium Transient Registration in the Frog Neuromuscular Junction

Carregando uma tintura de cálcio em terminação de nervo de sapo através do coto nervoso: Registro de transientes de cálcio na união neuromuscular de sapo

One of the most feasible methods of measuring presynaptic calcium levels in presynaptic nerve terminals is optical recording. It is based on using ...

Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System

Gravação de plasticidade sináptica em fatias Hippocampal agudas, mantidas em um pequeno volume reciclagem - perfusão- e sistema de câmara de submersão-tipo

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...

Culturing In Vivo-like Murine Astrocytes Using the Fast, Simple, and Inexpensive AWESAM Protocol

Culturing In Vivo-like Murine Astrocytes Using the Fast, Simple, and Inexpensive AWESAM Protocol

Cultivo In Vivo-gosto murino astrócitos usando o protocolo AWESAM rápida, simples e barato

The AWESAM (a low-cost easy stellate astrocyte method) protocol entails a fast, simple, and inexpensive way to generate large quantities of in vivo-like ...