Name: monitoring changes in the intracellular calcium concentration and synaptic efficacy in the mollusc aplysia
Uploaded: 2012-07-15T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Monitoring Changes in the Intracellular Calcium Concentration and Synaptic Efficacy in the Mollusc Aplysia at JoVE.com

PHS Грант (MH51393) поддержали эту работу. Некоторые из Aplysia которые мы используем, предоставляемых Национальным ресурсов для Aplysia из университета Майами по гранту RR10294 из Национального центра исследовательских ресурсов, NIH.

1. Подготовка <ol><li> Анестезию животного путем введения 75-100 мл изотонический раствор хлорида магния. Aplysia мы используем для работы с изображениями, как правило, 150-200 граммов и получаются из Маринус Scientific. </li><li> Pin наркозом животным воском покрыты блюдо. Шприц иглы хорошо работать для ...

<ol>
	<li>Zucker, R. S., Regehr, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-term+synaptic+plasticity.">Short-term synaptic plasticity.</a> Annu. Rev. Physiol. 64, 355-405 (2002).</li><li>Eberhard, M., Erne, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+binding+to+fluorescent+calcium+indicators:+Calcium+green,+calcium+orange+and+calcium+crimson.">Calcium binding to fluorescent calcium indicators: Calcium green, calcium orange and calcium crimson.</a> Biochem. Biophysical Res. Comm. 180, 209-215 (1991).</li><li>Escobar, A. L., Velez, P., Kim, A. M., Cifuentes, F., Fill, M., Vergata, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+properties+of+DM-nitrophen+and+calcium+indicators:+rapid+transient+response+to+flash+photolysis.">Kinetic properties of DM-nitrophen and calcium indicators: rapid transient response to flash photolysis.</a> Eur. J. Physiol. 434, 615-631 (1997).</li><li>Ivanov, A. I., Calabrese, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+spike-mediated+synaptic+transmission+by+presynaptic+background+Ca2++in+leech+heart+interneurons.">Modulation of spike-mediated synaptic transmission by presynaptic background Ca2+ in leech heart interneurons.</a> J. Neurosci. 23, 1206-1218 (2003).</li><li>Rosen, S. C., Miller, M. W., Evans, C. G., Cropper, E. C., Kupfermann, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+synaptic+connections+between+peptidergic+radula+mechanoafferent+neurons+and+neurons+in+the+feeding+system+of+Aplysia.">Diverse synaptic connections between peptidergic radula mechanoafferent neurons and neurons in the feeding system of Aplysia.</a> J. Neurophysiol. 83, 1605-1620 (2000).</li><li>Ludwar, B. C. h., Evans, C. G., Jing, J., Cropper, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+distinct+mechanisms+mediate+potentiating+effects+of+depolarization+on+synaptic+transmission.">Two distinct mechanisms mediate potentiating effects of depolarization on synaptic transmission.</a> J. Neurophysiol. 102, 1976-1983 (2009).</li><li>Evans, C. G., Ludwar, B. C. h., Askansas, J., Cropper, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+holding+potential+on+the+dynamics+of+homosynaptic+facilitation.">Effect of holding potential on the dynamics of homosynaptic facilitation.</a> J. Neurosci. 31, 11039-11043 (2011).</li><li>Haugland, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Handbook. , (2005).</li><li>Borovikov, D., Evans, C. G., Jing, J., Rosen, S. C., Cropper, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+proprioceptive+role+for+an+exteroceptive+mechanoafferent+neuron+in+Aplysia.">A proprioceptive role for an exteroceptive mechanoafferent neuron in Aplysia.</a> J. Neurosci. 20, 1990-2002 (2000).</li><li>Goldberg, J. H., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+38:+A+practical+guide:+Two-photon+calcium+imaging+of+spines+and+dendrites.">Chapter 38: A practical guide: Two-photon calcium imaging of spines and dendrites.</a> Imaging in Neuroscience and Development. , (2005).</li></ol>

Мы продемонстрируем методы, которые могут быть использованы для одновременного контроля внутриклеточной концентрации кальция и оценить эффективность синаптической передачи. Эти методы полезны для определения того, как различные формы краткосрочного пластичности опосредовано. <p ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Реагент Имя </td><td> Компания </td><td> Номер по каталогу </td><td> Комментировать </td></tr><tr><td> Кальций Оранжевый </td><td> Invitrogen </td><td> C-3013 </td><td></td></tr><tr><td> EGTA </td><td> Сигма </td><td> E-4378 </td><td></td></tr><tr><td> Кальций калибровки буфера комплект </td><td> Invitrogen </td><td> C-3008MP </td><td> полезно для тестирования чувствительность и динамический диапазон сигнала </td></tr><tr><td> Гексагидрат Хлорид магния </td><td> Сигма </td><td> M0250 </td><td> использовать в 0,33 М раствора, чтобы обезболить животных </td></tr></tbody></table> Таблица 1. Используемых реагентов. <table border="1"><tbody><tr><td> Название оборудования </td><td> Компания </td><td> Комментировать </td></tr><tr><td> FN-1 вертикально флуоресцентного микроскопа </td><td> Nikon Instruments </td><td> с Narishige ITS-FN1 этапе </td></tr><tr><td> NMN-21 манипуляторы </td><td> Narishige </td><td> установлен на сцене с магнитами </td></tr><tr><td> CoolSNAP HQ 2 CCD камеры </td><td> Фотометрия </td><td></td></tr><tr><td> NIS элементов AR (Версия 3.22) </td><td> Nikon Instruments </td><td> изображений программное обеспечение используется для получения данных флуоресценции </td></tr><tr><td> 10X/0.3w Plan Fluor цели </td><td> Nikon Instruments </td><td> этот объектив погружения в воду имеет очень большое рабочее расстояние 3,5 мм </td></tr><tr><td> X-Cite 120 PC металлогалогенные лампы </td><td> EXFO </td><td> используется для флуоресцентной микроскопии </td></tr><tr><td> LS-DWL галогенные лампы </td><td> Sumica </td><td></td></tr><tr><td> ET-CY3 набор фильтров </td><td> Chroma технологии </td><td>; </td></tr><tr><td> Мощность 1401 A / D конвертер </td><td> Cambridge Electronic Design </td><td> выборка была сделана на 3 кГц </td></tr><tr><td> Спайк II (Версия 7.07) </td><td> Cambridge Electronic Design </td><td> Программное обеспечение используется для получения данных электрофизиологии </td></tr><tr><td> SEC-10 LX усилителем </td><td> НПИ электроники </td><td> использовать с 10-кратным headstage </td></tr><tr><td> Модель 410 Усилитель </td><td> Браунли точности </td><td> используется для усиления и фильтрации сигнала </td></tr><tr><td> WS-4 </td><td> минус к технологиям </td><td> виброизоляции для работы с изображениями </td></tr><tr><td> охлаждение платформы </td><td> заказ </td><td> латунные пластины, через которые ледяную воду закачивают с переменной скоростью </td></tr></tbody></table> Таблица 2. Оборудования.

monitoring changes in the intracellular calcium concentration and synaptic efficacy in the mollusc aplysia

It has been suggested that changes in intracellular calcium mediate the induction of a number of important forms of synaptic plasticity (e.g., homosynaptic facilitation) 1. These hypotheses can be tested by simultaneously monitoring changes in intracellular calcium and alterations in synaptic efficacy. We demonstrate how this can be accomplished by combining calcium imaging with intracellular recording techniques. Our experiments are conducted in a buccal ganglion of the mollusc Aplysia californica. This preparation has a number of experimentally advantageous features: Ganglia can be easily removed from Aplysia and experiments use adult neurons that make normal synaptic connections and have a normal ion channel distribution. Due to the low metabolic rate of the animal and the relatively low temperatures (14-16 &deg;C) that are natural for Aplysia, preparations are stable for long periods of time. 
To detect changes in intracellular free calcium we will use the cell impermeant version of Calcium Orange 2 which is easily 'loaded' into a neuron via iontophoresis. When this long wavelength fluorescent dye binds to calcium, fluorescence intensity increases. Calcium Orange has fast kinetic properties 3 and, unlike ratiometric dyes (e.g., Fura 2), requires no filter wheel for imaging. It is fairly photo stable and less phototoxic than other dyes (e.g., fluo-3) 2,4. Like all non-ratiometric dyes, Calcium Orange indicates relative changes in calcium concentration. But, because it is not possible to account for changes in dye concentration due to loading and diffusion, it can not be calibrated to provide absolute calcium concentrations. 
An upright, fixed stage, compound microscope was used to image neurons with a CCD camera capable of recording around 30 frames per second. In Aplysia this temporal resolution is more than adequate to detect even a single spike induced alteration in the intracellular calcium concentration. Sharp electrodes are simultaneously used to induce and record synaptic transmission in identified pre- and postsynaptic neurons. At the conclusion of each trial, a custom script combines electrophysiology and imaging data. To ensure proper synchronization we use a light pulse from a LED mounted in the camera port of the microscope. Manipulation of presynaptic calcium levels (e.g. via intracellular EGTA injection) allows us to test specific hypotheses, concerning the role of intracellular calcium in mediating various forms of plasticity.

Watch this Scientific Journal Video about Monitoring Changes in the Intracellular Calcium Concentration and Synaptic Efficacy in the Mollusc Aplysia at JoVE.com

Monitoring Changes in the Intracellular Calcium Concentration and Synaptic Efficacy in the Mollusc Aplysia

Мы демонстрируем, как изменения во внутриклеточной концентрации свободного кальция и синаптической эффективности могут быть одновременно контролировать в ганглии подготовки<em&gt; Aplysia</em&gt;. Мы изображений внутриклеточного кальция с помощью флуоресцентного красителя, кальций Orange, и вызывать и контролировать синаптической передачи с острыми (внутриклеточные) электроды.

Мониторинг изменений в внутриклеточной концентрации кальция и синаптической эффективности в Моллюск<em&gt; Aplysia</em

It has been suggested that changes in intracellular calcium mediate the induction of a number of important forms of synaptic plasticity (e.g., ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Monitoring Changes in the Intracellular Calcium Concentration and Synaptic Efficacy in the Mollusc Aplysia

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Визуализация проприорецепторов в<em&gt; Drosophila</em&gt; Личинки и куколки

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other ...

Electroporation of the Hindbrain to Trace Axonal Trajectories and Synaptic Targets in the Chick Embryo

Электропорации Hindbrain Трейс аксонов траектории и Synaptic Цели у эмбрионов кур

Electroporation of  the chick embryonic neural tube has many advantages such as being quick and efficient  for the expression of foreign genes into ...

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

В Vivo Двухфотонные изображений зависящие от опыта молекулярные изменения в корковых нейронов

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

Быстрый Micro-ионтофорезом глутамата и ГАМК: полезный инструмент по расследованию Synaptic интеграции

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

The Neuromuscular Junction: Measuring Synapse Size, Fragmentation and Changes in Synaptic Protein Density Using Confocal Fluorescence Microscopy

Нервно-мышечном соединении: Synapse размер измерение, фрагментации и изменения в синаптической белка плотности с использованием конфокальной флуоресцентной микроскопии

The neuromuscular junction (NMJ) is the large, cholinergic relay synapse through which mammalian motor neurons control voluntary muscle contraction. ...

Utilizing Combined Methodologies to Define the Role of Plasma Membrane Delivery During Axon Branching and Neuronal Morphogenesis

Использование Комбинированные методики для определения роли плазмалеммы доставкой в ​​Axon ветвление и морфогенеза нейронов

During neural development, growing axons extend to multiple synaptic partners by elaborating axonal branches. Axon branching is promoted by extracellular ...

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

Запись температурное нейронную активность посредством мониторинга изменений кальция в обонятельной луковицы<em&gt; Xenopus Laevis</em

The olfactory system, specialized in the detection, integration and processing of chemical molecules is likely the most thoroughly studied sensory system. ...

Loading a Calcium Dye into Frog Nerve Endings Through the Nerve Stump: Calcium Transient Registration in the Frog Neuromuscular Junction

Загрузка кальциевой красителя в нервные окончания лягушек через нервный культи: регистрация переходного процесса кальция в нервно-мышечном соединении лягушки

One of the most feasible methods of measuring presynaptic calcium levels in presynaptic nerve terminals is optical recording. It is based on using ...

Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System

Запись синаптической пластичности в острой гиппокампа ломтики в малообъемной рециркуляции-, перфузии и погружения типа камерная система

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...

Culturing In Vivo-like Murine Astrocytes Using the Fast, Simple, and Inexpensive AWESAM Protocol

Culturing In Vivo-like Murine Astrocytes Using the Fast, Simple, and Inexpensive AWESAM Protocol

Культивирование в естественных условиях-как мышиных астроциты, используя протокол быстрый, простой и недорогой AWESAM

The AWESAM (a low-cost easy stellate astrocyte method) protocol entails a fast, simple, and inexpensive way to generate large quantities of in vivo-like ...