Name: monitoring changes in the intracellular calcium concentration and synaptic efficacy in the mollusc aplysia
Uploaded: 2012-07-15T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Monitoring Changes in the Intracellular Calcium Concentration and Synaptic Efficacy in the Mollusc Aplysia at JoVE.com

En PHS Grant (MH51393) stött detta arbete. Några av Aplysia vi använder tillhandahålls av nationell resurs för Aplysia vid universitetet i Miami i Grant RR10294 från National Center for Research Resources, NIH.

1. Förberedelser <ol><li> Söva djuret genom att injicera 75-100 ml isoton lösning magnesiumklorid. Det Aplysia vi använder för avbildning är i allmänhet 150-200 gram och erhålls från Marinus Scientific. </li><li> Nåla fast sövda djur till ett vax täckta skålen. Sprutnålar fungera bra för detta ändamål, sterila tekniker är inte nödvändiga. Använda grova pincett och standard sax gör ett snitt i djurets fot och exponera den buckala massan. Leta reda på buckala ganglion. Med Spring sax och ...

<ol>
	<li>Zucker, R. S., Regehr, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-term+synaptic+plasticity.">Short-term synaptic plasticity.</a> Annu. Rev. Physiol. 64, 355-405 (2002).</li><li>Eberhard, M., Erne, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+binding+to+fluorescent+calcium+indicators:+Calcium+green,+calcium+orange+and+calcium+crimson.">Calcium binding to fluorescent calcium indicators: Calcium green, calcium orange and calcium crimson.</a> Biochem. Biophysical Res. Comm. 180, 209-215 (1991).</li><li>Escobar, A. L., Velez, P., Kim, A. M., Cifuentes, F., Fill, M., Vergata, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+properties+of+DM-nitrophen+and+calcium+indicators:+rapid+transient+response+to+flash+photolysis.">Kinetic properties of DM-nitrophen and calcium indicators: rapid transient response to flash photolysis.</a> Eur. J. Physiol. 434, 615-631 (1997).</li><li>Ivanov, A. I., Calabrese, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+spike-mediated+synaptic+transmission+by+presynaptic+background+Ca2++in+leech+heart+interneurons.">Modulation of spike-mediated synaptic transmission by presynaptic background Ca2+ in leech heart interneurons.</a> J. Neurosci. 23, 1206-1218 (2003).</li><li>Rosen, S. C., Miller, M. W., Evans, C. G., Cropper, E. C., Kupfermann, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+synaptic+connections+between+peptidergic+radula+mechanoafferent+neurons+and+neurons+in+the+feeding+system+of+Aplysia.">Diverse synaptic connections between peptidergic radula mechanoafferent neurons and neurons in the feeding system of Aplysia.</a> J. Neurophysiol. 83, 1605-1620 (2000).</li><li>Ludwar, B. C. h., Evans, C. G., Jing, J., Cropper, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+distinct+mechanisms+mediate+potentiating+effects+of+depolarization+on+synaptic+transmission.">Two distinct mechanisms mediate potentiating effects of depolarization on synaptic transmission.</a> J. Neurophysiol. 102, 1976-1983 (2009).</li><li>Evans, C. G., Ludwar, B. C. h., Askansas, J., Cropper, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+holding+potential+on+the+dynamics+of+homosynaptic+facilitation.">Effect of holding potential on the dynamics of homosynaptic facilitation.</a> J. Neurosci. 31, 11039-11043 (2011).</li><li>Haugland, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Handbook. , (2005).</li><li>Borovikov, D., Evans, C. G., Jing, J., Rosen, S. C., Cropper, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+proprioceptive+role+for+an+exteroceptive+mechanoafferent+neuron+in+Aplysia.">A proprioceptive role for an exteroceptive mechanoafferent neuron in Aplysia.</a> J. Neurosci. 20, 1990-2002 (2000).</li><li>Goldberg, J. H., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+38:+A+practical+guide:+Two-photon+calcium+imaging+of+spines+and+dendrites.">Chapter 38: A practical guide: Two-photon calcium imaging of spines and dendrites.</a> Imaging in Neuroscience and Development. , (2005).</li></ol>

Vi visar tekniker som kan användas för att samtidigt övervaka den intracellulära kalciumkoncentrationen och utvärdera effektiviteten av synaptisk transmission. Dessa tekniker är användbara för att bestämma hur olika former av kortfristiga plasticitet förmedlas. Den avbildning utföres med ett fluorescensmikroskop och CCD-kamera. Dessa krav på utrustning är relativt blygsamma jämfört med de flesta funktionella avbildning-etableringar. Tekniken är enkel och lätt att lära sig. ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagens Namn </td><td> Företag </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentar </td></tr><tr><td> Kalcium Orange </td><td> Invitrogen </td><td> C-3013 </td><td></td></tr><tr><td> EGTA </td><td> Sigma </td><td> E-4378 </td><td></td></tr><tr><td> Kalcium kalibrering buffert kit </td><td> Invitrogen </td><td> C-3008MP </td><td> användbar för att testa känsligheten och dynamiska området för signalen </td></tr><tr><td> Magnesiumkloridhexahydrat </td><td> Sigma </td><td> M0250 </td><td> används i 0,33 M lösning att bedöva djuret </td></tr></tbody></table> Tabell 1. Reagenser som används. <table border="1"><tbody><tr><td> Utrustning Namn </td><td> Företag </td><td> Kommentar </td></tr><tr><td> FN-1 upprätt fluorescensmikroskop </td><td> Nikon Instruments </td><td> med Narishige ITS-FN1 steg </td></tr><tr><td> NMN-21 manipulatorer </td><td> Narishige </td><td> monterade på scenen med magneter </td></tr><tr><td> CoolSNAP HQ 2 CCD-kamera </td><td> Ljustekniska </td><td></td></tr><tr><td> NIS elementen AR (Version 3,22) </td><td> Nikon Instruments </td><td> bildbehandlingsprogram som används för att skaffa fluorescensdata </td></tr><tr><td> 10X/0.3w Plan Fluor mål </td><td> Nikon Instruments </td><td> detta vatten nedsänkning lins har en mycket lång arbetsdag avstånd av 3,5 mm </td></tr><tr><td> X-Cite 120 PC metallhalogen lampa </td><td> EXFO </td><td> används för fluorescensavbildning </td></tr><tr><td> LS-DWL halogenlampa </td><td> Sumica </td><td></td></tr><tr><td> ET-CY3 filteruppsättningen </td><td> Chroma Technology </td><td>; </td></tr><tr><td> Ström 1401 A / D-omvandlare </td><td> Cambridge Electronic Design </td><td> provtagningen utfördes vid 3 kHz </td></tr><tr><td> Spike II (Version 7,07) </td><td> Cambridge Electronic Design </td><td> programvara som används för att förvärva elektrofysiologi uppgifter </td></tr><tr><td> SEC-10 LX förstärkare </td><td> NPI elektronik </td><td> används med en 10X huvudsteg </td></tr><tr><td> Modell 410 förstärkare </td><td> Brownlee precision </td><td> användes för att amplifiera och filtrera signalen </td></tr><tr><td> WS-4 </td><td> minus k Teknik </td><td> vibrationsisolering för avbildning </td></tr><tr><td> kyla plattform </td><td> måttbeställda </td><td> mässingsplåt genom vilken isvatten pumpas vid en variabel hastighet </td></tr></tbody></table> Tabell 2. Utrustning som används.

monitoring changes in the intracellular calcium concentration and synaptic efficacy in the mollusc aplysia

Det har föreslagits att förändringar i intracellulärt kalcium förmedlar induktion av ett antal viktiga former av synaptisk plasticitet (t.ex. homosynaptic underlättande) 1. Dessa hypoteser kan testas genom samtidig övervakning av förändringar i intracellulärt kalcium och ändringar i synaptisk effekt. Vi visar hur detta kan åstadkommas genom att kombinera kalcium avbildning med intracellulära inspelningstekniker. Våra experiment utförs i en buckal ganglion av blötdjur Aplysia californica. Denna beredning har ett antal experimentellt fördelaktiga egenskaper: Ganglia kan lätt avlägsnas från Aplysia och experiment använder vuxna neuroner som gör normala synaptiska anslutningar och har en normal fördelning jonkanal. På grund av den låga ämnesomsättning av djuret och de relativt låga temperaturer (14-16 ° C) som är naturligt för Aplysia, förberedelser är stabila under långa tidsperioder. ENT &quot;&gt; För att upptäcka förändringar i intracellulärt fritt kalcium vi kommer att använda cellen ogenomträngligt versionen av kalcium Orange 2 som är lätt&quot; laddad &quot;i ett neuron via jontofores. När denna långa våglängd fluorescerande färg binder till kalcium, fluorescens intensiteten ökar. Kalcium Orange har snabba kinetiska egenskaper 3 och, till skillnad kvotmetriska färgämnen (t.ex. Fura 2), kräver inget filter hjul för avbildning. Det är ganska foto stabil och mindre fototoxisk än andra färgämnen (t.ex. fluo-3) 2,4. Liksom alla icke-ratiometrisk färgämnen, indikerar Kalcium orange relativa förändringar i kalciumkoncentration. Men, eftersom det inte är möjligt att ta hänsyn till förändringar i färgkoncentration på grund av lastning och diffusion, kan det inte kalibreras för att tillhandahålla absoluta kalciumkoncentrationer. En upprättstående, fast fas, sammansatt mikroskop användes för att bilden neuroner med en CCD-kamera kan registrera omkring 30 bilder per sekund. I Aplysia detta tidsupplösningär mer än tillräcklig för att upptäcka även en enda spik inducerad förändring i den intracellulära kalciumkoncentrationen. Skarpa elektroder samtidigt används för att inducera och registrera synaptisk transmission i identifierade pre-och postsynaptiska neuroner. Vid slutet av varje försök, kombinerar en anpassad manus elektrofysiologi och bilddata. För att säkerställa korrekt synkronisering använder vi en ljuspuls från en lysdiod monterad i kamerans port mikroskop. Manipulering av presynaptiska kalciumnivåer (t.ex. genom intracellulär EGTA injektion) ger oss möjlighet att testa specifika hypoteser, om uppgifterna för intracellulärt kalcium i medla olika former av plasticitet.

Watch this Scientific Journal Video about Monitoring Changes in the Intracellular Calcium Concentration and Synaptic Efficacy in the Mollusc Aplysia at JoVE.com

Monitoring Changes in the Intracellular Calcium Concentration and Synaptic Efficacy in the Mollusc Aplysia

Vi visar hur förändringar i den intracellulära fri kalciumkoncentrationen och synaptisk effektivitet samtidigt kan övervakas på ett ganglion beredning av<em&gt; Aplysia</em&gt;. Vi bilden intracellulärt kalcium med hjälp av en fluorescerande färg, kalcium apelsin och framkalla och övervaka synaptisk transmission med skarpa (intracellulär) elektroder.

Övervakning av förändringar i den intracellulära kalciumkoncentrationen och synaptisk effekt i Blötdjur<em&gt; Aplysia</em

It has been suggested that changes in intracellular calcium mediate the induction of a number of important forms of synaptic plasticity (e.g., ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Monitoring Changes in the Intracellular Calcium Concentration and Synaptic Efficacy in the Mollusc Aplysia

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Visualisering av proprioceptorer i<em&gt; Drosophila</em&gt; Larver och puppor

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other ...

Electroporation of the Hindbrain to Trace Axonal Trajectories and Synaptic Targets in the Chick Embryo

Elektroporering av hindbrain att spåra axonal Trajectories och Synaptic Mål i Chick Embryo

Electroporation of  the chick embryonic neural tube has many advantages such as being quick and efficient  for the expression of foreign genes into ...

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

In vivo Två-foton avbildning av erfarenhet beroende molekylära förändringar i kortikala neuron

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

Snabb Micro-iontophoresis av glutamat och GABA: Ett användbart verktyg för att undersöka Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

The Neuromuscular Junction: Measuring Synapse Size, Fragmentation and Changes in Synaptic Protein Density Using Confocal Fluorescence Microscopy

Den neuromuskulära förbindelsen: Mäta Synapse Storlek, fragmentering och Förändringar i Synaptic Protein Densitet Använda Confocal fluorescensmikroskopi

The neuromuscular junction (NMJ) is the large, cholinergic relay synapse through which mammalian motor neurons control voluntary muscle contraction. ...

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

Inspelning Temperatur-inducerad neuronal aktivitet genom att övervaka Kalcium Förändringar i luktbulben av<em&gt; Xenopus laevis</em

The olfactory system, specialized in the detection, integration and processing of chemical molecules is likely the most thoroughly studied sensory system. ...

Loading a Calcium Dye into Frog Nerve Endings Through the Nerve Stump: Calcium Transient Registration in the Frog Neuromuscular Junction

Fylla på en kalciumfärg i fröens nervändamål via nervstubben: Kalciumtransientregistrering i Neuromuskulär Junction

One of the most feasible methods of measuring presynaptic calcium levels in presynaptic nerve terminals is optical recording. It is based on using ...

Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System

Inspelning synaptisk plasticitet i akut Hippocampus skivor underhålls i en små volymer återvinning - Perfusion- och nedsänkning-typ kammaresystem

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...

Culturing In Vivo-like Murine Astrocytes Using the Fast, Simple, and Inexpensive AWESAM Protocol

Culturing In Vivo-like Murine Astrocytes Using the Fast, Simple, and Inexpensive AWESAM Protocol

Odling i Vivo-gillar murina astrocyter med snabb, enkel och billig AWESAM-protokollet

The AWESAM (a low-cost easy stellate astrocyte method) protocol entails a fast, simple, and inexpensive way to generate large quantities of in vivo-like ...

In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster

In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster

In vivo optisk kalcium avbildning av Inlärningsinducerad synaptisk plasticitet i Drosophila melanogaster

Decades of research in many model organisms have led to the current concept of synaptic plasticity underlying learning and memory formation. ...