Name: a step-by-step method for the reconstitution of an abc transporter into nanodisc lipid particles
Uploaded: 2012-08-31T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Step-by-step Method for the Reconstitution of an ABC Transporter into Nanodisc Lipid Particles at JoVE.com

وأيد هذا العمل من قبل المعهد الكندي للبحوث الصحية. وقد تم تمويل CSC زمالة ما بعد الدكتوراه من من العلوم الطبيعية والهندسة مجلس البحوث كندا. FD هو المستوى الثاني للبحوث كندا الرئاسة.

<html> وعموما عملية إعادة إعماره عملية إعادة خلط يبدأ الغشاء سقالة البروتين (MSP) مع مجمع تنقية 2 MalFGK في وجود المنظفات الفوسفاتية-solubilized. ويتبع الخطوة عن طريق إزالة البطيء للالمنظفات من مادة البوليسترين الممتزات دعا بيو الخرز أو Amb...

<ol>
	<li>Denisov, I. G., Ginkova, Y. V., Lazarides, A. A., Sligar, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+self-assembly+of+monodisperse+phospholipid+bilayer+Nanodiscs+with+controlled+size.">Directed self-assembly of monodisperse phospholipid bilayer Nanodiscs with controlled size.</a> J. Am. Chem. Soc. 126, 3477-3487 (2004).</li><li>Boldog, T., Grimme, S., Li, M., Sligar, S. G., Hazelbauer, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanodiscs+separate+chemoreceptor+oligomeric+states+and+reveal+their+signaling+properties.">Nanodiscs separate chemoreceptor oligomeric states and reveal their signaling properties.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 103, 11509-11514 (2006).</li><li>Bass, B. J., Denisov, I. G., Sligar, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homotropic+cooperativity+of+monomeric+cytochrome+P450+3A4+in+a+nanoscale+native+bilayer+environment.">Homotropic cooperativity of monomeric cytochrome P450 3A4 in a nanoscale native bilayer environment.</a> J. Biol. Chem. 282, 7066-7076 (2007).</li><li>Alami, M., Dalal, K., Lelj-Garolla, B., Sligar, S. G., Duong, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanodiscs+unravel+the+interaction+between+the+SecYEG+channel+and+its+cytosolic+partner+SecA.">Nanodiscs unravel the interaction between the SecYEG channel and its cytosolic partner SecA.</a> EMBO J. 26, 1995-2004 (2007).</li><li>Mi, L. -. Z., Grey, M. J., Nishida, N., Walz, T., Lu, C., Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+and+structural+stability+of+the+epidermal+growth+factor+receptor+in+detergent+micelles+and+phospholipid+nanodiscs.">Functional and structural stability of the epidermal growth factor receptor in detergent micelles and phospholipid nanodiscs.</a> Biochemistry. 47, 10314-10323 (2008).</li><li>Sch&#228;gger, H., Cramer, W. A., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+molecular+masses+and+oligomeric+states+of+protein+complexes+by+blue+native+electrophoresis+and+isolation+of+membrane+protein+complexes+by+two-dimensional+native+electrophoresis.">Analysis of molecular masses and oligomeric states of protein complexes by blue native electrophoresis and isolation of membrane protein complexes by two-dimensional native electrophoresis.</a> Anal. Biochem. 217, 220-230 (1994).</li><li>Dalal, K., Duong, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+the+SecY+translocon+in+Nanodiscs.">Reconstitution of the SecY translocon in Nanodiscs.</a> Methods Mol. Biol. 619, 145-156 (2010).</li><li>Lanzetta, P. A., Alvarez, L. J., Reinach, P. S., Candia, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+assay+for+nanomole+amounts+of+inorganic+phosphate.">An improved assay for nanomole amounts of inorganic phosphate.</a> Anal. Biochem. 100, 95-97 (1979).</li><li>Davidson, A. L., Dassa, E., Orelle, C., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure,+function+and+evolution+of+bacterial+ATP-binding+cassette+systems.">Structure, function and evolution of bacterial ATP-binding cassette systems.</a> Microbiol. Mol. Biol. Rev. 72, 317-364 (2008).</li><li>Bordignon, E., Grote, M., Schneider, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+maltose+ATP-binding+cassette+transporter+in+the+21st+century-towards+a+structural+dynamic+perspective+on+its+mode+of+action.">The maltose ATP-binding cassette transporter in the 21st century-towards a structural dynamic perspective on its mode of action.</a> Mol. Microbiol. 77, 1354-1366 (2010).</li><li>Alvarez, F. J., Orelle, C., Davidson, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+reconstitution+of+an+ABC+transporter+for+use+in+electron+paramagnetic+resonance+spectroscopy.">Functional reconstitution of an ABC transporter for use in electron paramagnetic resonance spectroscopy.</a> J. Am. Chem. Soc. 132, 9513-9515 (2010).</li><li>Ritchie, T. K., Grinkova, Y. V., Bayburt, T. H., Denisov, I. G., Zolnerciks, J. K., Atkins, W. M., Sligar, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+membrane+proteins+in+phospholipid+bilayer+Nanodiscs.">Reconstitution of membrane proteins in phospholipid bilayer Nanodiscs.</a> Methods Enzymol. 464, 211-231 (2009).</li><li>Gl&#252;ck, J. M., Koenig, B. W., Willbold, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanodiscs+allow+the+use+of+integral+membrane+proteins+as+analytes+in+surface+plasmon+resonance+studies.">Nanodiscs allow the use of integral membrane proteins as analytes in surface plasmon resonance studies.</a> Anal. Biochem. 408, 46-52 (2011).</li><li>Wan, C. -. P. L., Chiu, M. H., Wu, X., Lee, S. K., Prenner, E. J., Weers, P. M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apolipoprotein-induced+conversion+of+phosphatidylcholine+bilayer+vesicles+into+nanodisks.">Apolipoprotein-induced conversion of phosphatidylcholine bilayer vesicles into nanodisks.</a> Biochim. Biophys. Acta (BBA). 1808, 606-613 (2011).</li><li>Nath, A., Trexler, A. J., Koo, P. K., Miranker, A. D., Atkins, W. M., Rhoades, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+fluorescence+spectroscopy+using+phospholipid+bilayer+Nanodiscs.">Single-molecule fluorescence spectroscopy using phospholipid bilayer Nanodiscs.</a> Methods Enzymol. 472, 89-117 (2010).</li><li>Denisov, I. G., Sligar, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytochromes+P450+in+Nanodiscs.">Cytochromes P450 in Nanodiscs.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1814, 223-229 (2011).</li><li>Zhang, X. X., Chan, C. S., Bao, H., Fang, Y., Foster, L. J., Duong, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanodiscs+and+SILAC-based+mass+spectrometry+to+identify+a+membrane+protein+interactome.">Nanodiscs and SILAC-based mass spectrometry to identify a membrane protein interactome.</a> J. Proteome Res. , (2011).</li></ol>

وصفنا إجراء بسيط لإعادة تشكيل المالتوز في نقل nanodiscs. الناقل هو أتباز نشطة ويمكن أن يعاد التفاعل مع شريك ذكر ملزمة للذوبان (الشكل 3). إعادة تشكيل ناجحة للنقل في nanodiscs فتح الطريق لتحليل إضافية البيوفيزيائية والكيميائية الحيوية. سوف تكون ذات أهمية خاصة في التحلي?...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم كاشف </td><td> شركة </td><td> كتالوج رقم </td><td> تعليقات </td></tr><tr><td> Amicon الترا-4 50K تصفية الطرد المركزي </td><td> ميليبور </td><td> UFC805008 </td><td> اتبع بروتوكول الشركة المصنعة للاستخدام السليم </td></tr><tr><td> الحيوي الخرز SM-2 الممتزات </td><td> بيو راد </td><td> 152-3920 </td><td></td></tr><tr><td> كولاي E. الدهون الكلية </td><td> افانتي الدهون القطبية </td><td> 100500C </td><td> المذاب في الكلوروفورم، والتعامل مع يتناسب مع مذيب عضوي </td></tr><tr><td> ني sepharose و HP الراتنج </td><td> GE للرعاية الصحية </td><td> 17-5268-01 </td><td></td></tr><tr><td> الفوسفور القياسية الحل </td><td>سيغما الدريخ </td><td> P3869 </td><td></td></tr><tr><td> pMSP1D1 </td><td> Addgene </td><td> 20061 </td><td></td></tr><tr><td> Superdex 200 HR 10/300 </td><td> GE للرعاية الصحية </td><td> 17-5172-01 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> الجدول الكواشف I. محددة. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم </td><td> تركيب </td><td> تعليقات </td></tr><tr><td> DDM الأسهم </td><td> 10٪ ث / ت DDM </td><td> resuspend في المياه وتخزينها في milliQ -20 ° C </td></tr><tr><td> 2 MalFGK الأسهم </td><td> 1-2 مغ / مل 50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، pH7.9 100 ملي مول كلوريد الصوديوم 10٪ ت / ت الجلسرين 0.03٪ W / V DDM </td><td> المحل في -70 درجة مئوية بعد تنقيتها </td></tr><tr><td> MSP الأسهم </td><td> 10-15 ملغ / مل 50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، pH7.9 100 ملي مول كلوريد الصوديوم 10٪ ت / ت الجلسرين </td><td> المحل في -70 درجة مئوية بعد تنقيتها في مأخوذة &lt;1 مل وتجنب الإفراط في تجميد / الذوبان دورات </td></tr><tr><td> فسفوليبيد الأسهم </td><td> 5 نانومتر E. القولونية مجموع الدهون 0.5٪ وزن / حجم (10 ملم) DDM 50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 7.9 50 ملي كلوريد الصوديوم </td><td> متجر في C ° 4 ل 1 الاسبوع </td></tr><tr><td> TS العازلة </td><td> 50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 7.9 50 ملي كلوريد الصوديوم </td><td> تخزين عند 4 ° C </td></tr><tr><td> TSG10 العازلة </td><td> 50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، pH7.9 100 ملي مول كلوريد الصوديوم 10٪ ت / ت الجلسرين </td><td> تخزين عند 4 ° C </td></tr><tr><td> TSG20 العازلة </td><td> 50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، pH8 100 ملي مول كلوريد الصوديوم 20٪ ت / ت الجلسرين </td><td> تخزين عند 4 ° C </td></tr><tr><td> TSGD العازلة </td><td> 50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، pH7.9 100 ملي مول كلوريد الصوديوم 10٪ ت / ت الجلسرين 0.03٪ W / V DDM </td><td> متجر في C ° 4 و إضافة DDM قبل استخدام </td></tr><tr><td colspan="3"> الجدول الثاني. الحل صفات. </td></tr></tbody></table></td></tr></tbody></table>

a step-by-step method for the reconstitution of an abc transporter into nanodisc lipid particles

وnanodisc هو الجسيمات قريصي (~ 10-12 نانومتر الكبيرة) أن البروتينات الغشاء فخ في قطعة صغيرة من طبقة ثنائية فسفوليبيد. وnanodisc هو خيارا جذابا بشكل خاص لدراسة البروتينات الغشاء، وخاصة في سياق يجند مستقبلات التفاعلات. رائدا في الطريقة التي Sligar ويقوم الزملاء على خصائص متقابلة الزمر من المهندسة عالية A-حلزونية سقالة البروتين المستمد من A1 ئي. وجوه مسعور من البروتين سقالة التفاعل مع سلاسل جانبية أسيل الدهنية من طبقة ثنائية المادة الدهنية في حين أن المناطق القطبية تواجه البيئة المائية. تحليل البروتينات الغشاء في nanodiscs لها مزايا هامة على الحويصلية لأن جزيئات صغيرة، متجانسة وللذوبان في الماء. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن تطبيق أساليب الكيمياء الحيوية والفيزياء الحيوية التي عادة ما تحجز للبروتينات قابلة للذوبان، ومن جانبي الغشاء. في هذا البروتوكول البصرية، فإننا نقدم إعادة خطوة بخطوة من charac جيداterized نقل ABC البكتيرية، والذكور 2 MalFGK المعقدة. تشكيل القرص هو عملية التجميع الذاتي التي تعتمد على التفاعلات التي تحدث أثناء مسعور في الإزالة التدريجية للمواد التنظيف. نحن وصف الخطوات الأساسية ونسلط الضوء على أهمية اختيار الصحيح البروتين إلى الدهون نسبة للحد تشكيل المجاميع والجسيمات الأكبر حجما polydisperse الحويصلية مثل. نوعية بسيطة مثل اللوني يتحكم الترشيح هلام، هلام الكهربائي الأصلي وديناميكية تشتت الضوء الطيفي ضمان أنه تم تشكيل الأقراص بشكل صحيح.

Watch this Scientific Journal Video about A Step-by-step Method for the Reconstitution of an ABC Transporter into Nanodisc Lipid Particles at JoVE.com

A Step-by-step Method for the Reconstitution of an ABC Transporter into Nanodisc Lipid Particles

Nanodiscs هي جسيمات صغيرة القرصية التي تتضمن البروتينات الغشاء في قطعة صغيرة من طبقة ثنائية فسفوليبيد. نحن نقدم بروتوكول البصرية التي تظهر إدماج خطوة بخطوة من نقل MalFGK2 إلى القرص.

A أسلوب الخطوة بخطوة لإعادة تشكيل ناقلة الى جزيئات الدهون ABC Nanodisc

The nanodisc is a discoidal particle (~ 10-12 nm large) that trap membrane proteins into a small patch of phospholipid bilayer. The nanodisc is a ...

Research

JoVE Journal

Biology

Expression, Detergent Solubilization, and Purification of a Membrane Transporter, the MexB Multidrug Resistance Protein

التعبير ، Solubilization منظفات ، وتنقية من الناقل الأغشية ، ومقاومة الأدوية المتعددة MexB البروتين

Multidrug resistance (MDR), the ability of a cancer cell or pathogen to be resistant to a wide range of structurally and functionally unrelated ...

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting (LIMACS): a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting LIMACS: a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

الكروماتوجراف الدهون تقارب الحويصلة بوساطة الفرز المغناطيسي باستخدام خلية المنشط (LIMACS) : طريقة جديدة لتحليل البروتين الدهني التفاعل

The analysis of lipid protein interaction is difficult because lipids are embedded in cell membranes and therefore, inaccessible to most purification ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

إعادة إعماره في المختبر من أحدث T. castaneum تيلوميراز

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

A Simple Method for Imaging Arabidopsis Leaves Using Perfluorodecalin as an Infiltrative Imaging Medium

A Simple Method for Imaging Arabidopsis Leaves Using Perfluorodecalin as an Infiltrative Imaging Medium

طريقة بسيطة للتصوير Arabidopsis يغادر طريق Perfluorodecalin كوسيط التصوير إختراقي

The problem of acquiring high-resolution images deep into biological samples is widely acknowledged1. In air-filled tissue such as the spongy mesophyll of ...

Reconstitution of a Kv Channel into Lipid Membranes for Structural and Functional Studies

إعادة تشكيل قناة كيلو فولت في الأغشية الدهنية للدراسات الهيكلية والوظيفية

To study the lipid-protein interaction in a reductionistic fashion, it is necessary to incorporate the membrane proteins into membranes of well-defined ...

Reconstitution of a Transmembrane Protein, the Voltage-gated Ion Channel, KvAP, into Giant Unilamellar Vesicles for Microscopy and Patch Clamp Studies

إعادة تشكيل البروتين عبر الغشاء، وايون القناة بوابات الجهد، KvAP، إلى العملاق Unilamellar الحويصلات للفحص المجهري وتصحيح الدراسات المشبك

Giant Unilamellar Vesicles (GUVs) are a popular biomimetic system for studying membrane associated phenomena. However, commonly used protocols to grow ...

Procedure to Evaluate the Efficiency of Flocculants for the Removal of Dispersed Particles from Plant Extracts

إجراءات لتقييم كفاءة المرسب لإزالة فرقت الجسيمات من المستخلصات النباتية

Plants are important to humans not only because they provide commodities such as food, feed and raw materials, but increasingly because they can be used ...

An Efficient In Vitro Transposition Method by a Transcriptionally Regulated Sleeping Beauty System Packaged into an Integration Defective Lentiviral Vector

An Efficient In Vitro Transposition Method by a Transcriptionally Regulated Sleeping Beauty System Packaged into an Integration Defective Lentiviral Vector

أسلوب نقل تتسم بكفاءة في المختبر بنظام جمال النوم ترانسكريبتيونالي الخاضعة للتنظيم في متجه تكامل لينتيفيرال معيبة وتعبئتها

The Sleeping Beauty (SB) transposon is a non-viral integrating system with proven efficacy for gene transfer and functional genomics. To optimize the SB ...

An Air-liquid Interface Bronchial Epithelial Model for Realistic, Repeated Inhalation Exposure to Airborne Particles for Toxicity Testing

نموذج ظهاري لواجهة هوائية-سائلة لتعرض واقعي ومكرر للاستنشاق للجسيمات المحمولة جواً لاختبار السمية

For toxicity testing of airborne particles, air-liquid interface (ALI) exposure systems have been developed for in vitro tests in order to mimic realistic ...

Tethered Bilayer Lipid Membranes to Monitor Heat Transfer between Gold Nanoparticles and Lipid Membranes

الأغشية الدهنية ثنائية الطبقات المربوطة لمراقبة نقل الحرارة بين الجسيمات النانوية الذهبية والأغشية الدهنية

Here we report a protocol to investigate the heat transfer between irradiated gold nanoparticles (GNPs) and bilayer lipid membranes by electrochemistry ...