Name: a step-by-step method for the reconstitution of an abc transporter into nanodisc lipid particles
Uploaded: 2012-08-31T12:00:00
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Ce travail a été soutenu par l&#39;Institut canadien de recherche en santé. SCC a été financé par une bourse de recherche postdoctorale en sciences naturelles et en génie du Canada. FD est une chaire de recherche du Canada.

<html> Processus de reconstitution globale Le processus de reconstitution commence par mélanger la protéine d&#39;échafaudage membranaire (MSP) avec le complexe purifié MalFGK 2 en présence d&#39;un détergent-solubilisées phospholipides. L&#39;étape est suivie de l&#39;élimination lente de la lessive par un matériau adsorbant en polystyrène appelé Bio-Beads ou Amberlite (figure 1). Le processus d&#39;auto-assemblage se produit probablement en raison des in...

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	<li>Denisov, I. G., Ginkova, Y. V., Lazarides, A. A., Sligar, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+self-assembly+of+monodisperse+phospholipid+bilayer+Nanodiscs+with+controlled+size.">Directed self-assembly of monodisperse phospholipid bilayer Nanodiscs with controlled size.</a> J. Am. Chem. Soc. 126, 3477-3487 (2004).</li><li>Boldog, T., Grimme, S., Li, M., Sligar, S. G., Hazelbauer, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanodiscs+separate+chemoreceptor+oligomeric+states+and+reveal+their+signaling+properties.">Nanodiscs separate chemoreceptor oligomeric states and reveal their signaling properties.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 103, 11509-11514 (2006).</li><li>Bass, B. J., Denisov, I. G., Sligar, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homotropic+cooperativity+of+monomeric+cytochrome+P450+3A4+in+a+nanoscale+native+bilayer+environment.">Homotropic cooperativity of monomeric cytochrome P450 3A4 in a nanoscale native bilayer environment.</a> J. Biol. Chem. 282, 7066-7076 (2007).</li><li>Alami, M., Dalal, K., Lelj-Garolla, B., Sligar, S. G., Duong, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanodiscs+unravel+the+interaction+between+the+SecYEG+channel+and+its+cytosolic+partner+SecA.">Nanodiscs unravel the interaction between the SecYEG channel and its cytosolic partner SecA.</a> EMBO J. 26, 1995-2004 (2007).</li><li>Mi, L. -. Z., Grey, M. J., Nishida, N., Walz, T., Lu, C., Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+and+structural+stability+of+the+epidermal+growth+factor+receptor+in+detergent+micelles+and+phospholipid+nanodiscs.">Functional and structural stability of the epidermal growth factor receptor in detergent micelles and phospholipid nanodiscs.</a> Biochemistry. 47, 10314-10323 (2008).</li><li>Sch&#228;gger, H., Cramer, W. A., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+molecular+masses+and+oligomeric+states+of+protein+complexes+by+blue+native+electrophoresis+and+isolation+of+membrane+protein+complexes+by+two-dimensional+native+electrophoresis.">Analysis of molecular masses and oligomeric states of protein complexes by blue native electrophoresis and isolation of membrane protein complexes by two-dimensional native electrophoresis.</a> Anal. Biochem. 217, 220-230 (1994).</li><li>Dalal, K., Duong, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+the+SecY+translocon+in+Nanodiscs.">Reconstitution of the SecY translocon in Nanodiscs.</a> Methods Mol. Biol. 619, 145-156 (2010).</li><li>Lanzetta, P. A., Alvarez, L. J., Reinach, P. S., Candia, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+assay+for+nanomole+amounts+of+inorganic+phosphate.">An improved assay for nanomole amounts of inorganic phosphate.</a> Anal. Biochem. 100, 95-97 (1979).</li><li>Davidson, A. L., Dassa, E., Orelle, C., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure,+function+and+evolution+of+bacterial+ATP-binding+cassette+systems.">Structure, function and evolution of bacterial ATP-binding cassette systems.</a> Microbiol. Mol. Biol. Rev. 72, 317-364 (2008).</li><li>Bordignon, E., Grote, M., Schneider, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+maltose+ATP-binding+cassette+transporter+in+the+21st+century-towards+a+structural+dynamic+perspective+on+its+mode+of+action.">The maltose ATP-binding cassette transporter in the 21st century-towards a structural dynamic perspective on its mode of action.</a> Mol. Microbiol. 77, 1354-1366 (2010).</li><li>Alvarez, F. J., Orelle, C., Davidson, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+reconstitution+of+an+ABC+transporter+for+use+in+electron+paramagnetic+resonance+spectroscopy.">Functional reconstitution of an ABC transporter for use in electron paramagnetic resonance spectroscopy.</a> J. Am. Chem. Soc. 132, 9513-9515 (2010).</li><li>Ritchie, T. K., Grinkova, Y. V., Bayburt, T. H., Denisov, I. G., Zolnerciks, J. K., Atkins, W. M., Sligar, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+membrane+proteins+in+phospholipid+bilayer+Nanodiscs.">Reconstitution of membrane proteins in phospholipid bilayer Nanodiscs.</a> Methods Enzymol. 464, 211-231 (2009).</li><li>Gl&#252;ck, J. M., Koenig, B. W., Willbold, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanodiscs+allow+the+use+of+integral+membrane+proteins+as+analytes+in+surface+plasmon+resonance+studies.">Nanodiscs allow the use of integral membrane proteins as analytes in surface plasmon resonance studies.</a> Anal. Biochem. 408, 46-52 (2011).</li><li>Wan, C. -. P. L., Chiu, M. H., Wu, X., Lee, S. K., Prenner, E. J., Weers, P. M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apolipoprotein-induced+conversion+of+phosphatidylcholine+bilayer+vesicles+into+nanodisks.">Apolipoprotein-induced conversion of phosphatidylcholine bilayer vesicles into nanodisks.</a> Biochim. Biophys. Acta (BBA). 1808, 606-613 (2011).</li><li>Nath, A., Trexler, A. J., Koo, P. K., Miranker, A. D., Atkins, W. M., Rhoades, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+fluorescence+spectroscopy+using+phospholipid+bilayer+Nanodiscs.">Single-molecule fluorescence spectroscopy using phospholipid bilayer Nanodiscs.</a> Methods Enzymol. 472, 89-117 (2010).</li><li>Denisov, I. G., Sligar, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytochromes+P450+in+Nanodiscs.">Cytochromes P450 in Nanodiscs.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1814, 223-229 (2011).</li><li>Zhang, X. X., Chan, C. S., Bao, H., Fang, Y., Foster, L. J., Duong, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanodiscs+and+SILAC-based+mass+spectrometry+to+identify+a+membrane+protein+interactome.">Nanodiscs and SILAC-based mass spectrometry to identify a membrane protein interactome.</a> J. Proteome Res. , (2011).</li></ol>

Nous décrivons une procédure simple pour la reconstitution du transporteur maltose en NANODISQUES. Le transporteur est ATPase active et l&#39;interaction avec le mâle partenaire de liaison soluble peut être recréé (figure 3). La reconstitution réussie du transporteur en NANODISQUES ouvrir la voie à l&#39;analyse biophysique et biochimique supplémentaire. D&#39;un intérêt particulier sera l&#39;analyse systématique de l&#39;ATPase MalK et de l&#39;activité de transport du maltose dans du dé...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> Amicon Ultra-4 50K filtre centrifuge </td><td> Millipore </td><td> UFC805008 </td><td> Suivre le protocole du fabricant pour une utilisation correcte </td></tr><tr><td> Bio-Beads SM-2 Adsorbant </td><td> Bio-Rad </td><td> 152-3920 </td><td></td></tr><tr><td> E. coli lipides totaux </td><td> Avanti Polar Lipids </td><td> 100500C </td><td> Dissous dans du chloroforme, gérer comme il convient pour un solvant organique </td></tr><tr><td> Ni Sepharose HP résine </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-5268-01 </td><td></td></tr><tr><td> Solution étalon de phosphore </td><td>Sigma-Aldrich </td><td> P3869 </td><td></td></tr><tr><td> pMSP1D1 </td><td> Addgene </td><td> 20061 </td><td></td></tr><tr><td> Superdex 200 HR 10/300 </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-5172-01 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tableau I. réactifs spécifiques. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><table border="1"><tbody><tr><td> Nom </td><td> Composition </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> DDM actions </td><td> 10% v / v DDM </td><td> Remettre en suspension dans l&#39;eau milliQ et conserver à -20 ° C </td></tr><tr><td> MalFGK 2 stock </td><td> 1-2 mg / ml 50 mM Tris-HCl, pH 7,9 NaCl 100 mM 10% v / v de glycérol 0,03% p / v DDM </td><td> Conserver à -70 ° C après purification </td></tr><tr><td> MSP actions </td><td> 10-15 mg / ml 50 mM Tris-HCl, pH 7,9 NaCl 100 mM 10% v / v de glycérol </td><td> Conserver à -70 ° C après purification en aliquotes de 1 ml et &lt;éviter de trop cycles gel / dégel </td></tr><tr><td> Actions phospholipides </td><td> 5 nM E. coli en lipides totaux 0,5% p / v (10 mM) DDM 50 mM Tris-HCl, pH 7,9 50 mM de NaCl </td><td> Conserver à 4 ° C pendant 1 semaine </td></tr><tr><td> TS tampon </td><td> 50 mM Tris-HCl, pH 7,9 50 mM de NaCl </td><td> Stocker à 4 ° C </td></tr><tr><td> TSG10 tampon </td><td> 50 mM Tris-HCl, pH 7,9 NaCl 100 mM 10% v / v de glycérol </td><td> Stocker à 4 ° C </td></tr><tr><td> TSG20 tampon </td><td> 50 mM Tris-HCl, pH8 NaCl 100 mM 20% v / v de glycérol </td><td> Stocker à 4 ° C </td></tr><tr><td> Tampon TSGD </td><td> 50 mM Tris-HCl, pH 7,9 NaCl 100 mM 10% v / v de glycérol 0,03% p / v DDM </td><td> Conserver à 4 ° C et ajouter DDM juste avant l&#39;utilisation </td></tr><tr><td colspan="3"> Tableau II. Solution recettes. </td></tr></tbody></table></td></tr></tbody></table>

a step-by-step method for the reconstitution of an abc transporter into nanodisc lipid particles

Le nanodisc est une particule en forme de disque (~ 10-12 nm grande) que les protéines membranaires piège dans une petite parcelle de bicouche phospholipidique. Le nanodisc est une option particulièrement intéressante pour l&#39;étude des protéines membranaires, en particulier dans le contexte de interactions ligand-récepteur. Le procédé mis au point par Sligar et ses collaborateurs est basée sur les propriétés amphipathiques d&#39;une ingénierie très une hélice protéine extraite de l&#39;échafaudage apolipoprotéines A1. Les faces hydrophobes de la protéine d&#39;échafaudage interagir avec les acyles gras des chaînes latérales de la bicouche lipidique, alors que les régions polaires face à l&#39;environnement aqueux. L&#39;analyse des protéines membranaires ont NANODISQUES avantages significatifs par rapport liposome, car les particules sont petites, homogène et soluble dans l&#39;eau. En outre, les méthodes biochimiques et biophysiques normalement réservés à des protéines solubles peuvent être appliqués, et de part et d&#39;autre de la membrane. Dans ce protocole visuelle, nous présentons une reconstitution étape par étape, d&#39;un caractère bientérisée transporteur ABC bactérien, le mâle-MalFGK complexe 2. La formation du disque est un processus d&#39;auto-assemblage qui dépend des interactions hydrophobes qui ont lieu au cours de l&#39;élimination progressive du détergent. Nous décrivons les étapes essentielles et nous soulignons l&#39;importance de choisir un bon protéine-lipide rapport afin de limiter la formation d&#39;agrégats et les grands polydisperses liposomes comme des particules. Contrôle qualité simples telles que la chromatographie de filtration sur gel, l&#39;électrophorèse sur gel natif et dynamique spectroscopie de diffusion de lumière en sorte que les disques ont été correctement reconstitué.

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A Step-by-step Method for the Reconstitution of an ABC Transporter into Nanodisc Lipid Particles

NANODISQUES sont de petites particules discoïdes qui incorporent des protéines membranaires dans un petit lopin de bicouche phospholipidique. Nous fournir un protocole visuelle montre que l&#39;incorporation étape par étape du transporteur MalFGK2 dans un disque.

Une méthode étape par étape pour la reconstitution d&#39;un transporteur ABC dans des particules lipidiques Nanodisc

The nanodisc is a discoidal particle (~ 10-12 nm large) that trap membrane proteins into a small patch of phospholipid bilayer. The nanodisc is a ...

Research

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