Name: a step-by-step method for the reconstitution of an abc transporter into nanodisc lipid particles
Uploaded: 2012-08-31T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Step-by-step Method for the Reconstitution of an ABC Transporter into Nanodisc Lipid Particles at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי המכון הקנדי לחקר בריאות. CSC מומן על ידי מלגת דוקטורט ממדעי הטבע והנדסת מועצת המחקר של קנדה. FD היא קנדה מחקר קתדרה משנית.

<html> תהליך כינונה מחדש באופן כללי תהליך הבנייה מחדש מתחיל על ידי ערבוב קרום פיגום החלבון (MSP) עם 2 המורכבים MalFGK המטוהר בנוכחות פוספוליפידים דטרגנט-solubilized. הצעד אחריו ההסרה האיטית של חומר הניקוי על ידי חומר הנקרא פוליסטירן סופח-Bi...

<ol>
	<li>Denisov, I. G., Ginkova, Y. V., Lazarides, A. A., Sligar, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+self-assembly+of+monodisperse+phospholipid+bilayer+Nanodiscs+with+controlled+size.">Directed self-assembly of monodisperse phospholipid bilayer Nanodiscs with controlled size.</a> J. Am. Chem. Soc. 126, 3477-3487 (2004).</li><li>Boldog, T., Grimme, S., Li, M., Sligar, S. G., Hazelbauer, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanodiscs+separate+chemoreceptor+oligomeric+states+and+reveal+their+signaling+properties.">Nanodiscs separate chemoreceptor oligomeric states and reveal their signaling properties.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 103, 11509-11514 (2006).</li><li>Bass, B. J., Denisov, I. G., Sligar, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homotropic+cooperativity+of+monomeric+cytochrome+P450+3A4+in+a+nanoscale+native+bilayer+environment.">Homotropic cooperativity of monomeric cytochrome P450 3A4 in a nanoscale native bilayer environment.</a> J. Biol. Chem. 282, 7066-7076 (2007).</li><li>Alami, M., Dalal, K., Lelj-Garolla, B., Sligar, S. G., Duong, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanodiscs+unravel+the+interaction+between+the+SecYEG+channel+and+its+cytosolic+partner+SecA.">Nanodiscs unravel the interaction between the SecYEG channel and its cytosolic partner SecA.</a> EMBO J. 26, 1995-2004 (2007).</li><li>Mi, L. -. Z., Grey, M. J., Nishida, N., Walz, T., Lu, C., Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+and+structural+stability+of+the+epidermal+growth+factor+receptor+in+detergent+micelles+and+phospholipid+nanodiscs.">Functional and structural stability of the epidermal growth factor receptor in detergent micelles and phospholipid nanodiscs.</a> Biochemistry. 47, 10314-10323 (2008).</li><li>Sch&#228;gger, H., Cramer, W. A., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+molecular+masses+and+oligomeric+states+of+protein+complexes+by+blue+native+electrophoresis+and+isolation+of+membrane+protein+complexes+by+two-dimensional+native+electrophoresis.">Analysis of molecular masses and oligomeric states of protein complexes by blue native electrophoresis and isolation of membrane protein complexes by two-dimensional native electrophoresis.</a> Anal. Biochem. 217, 220-230 (1994).</li><li>Dalal, K., Duong, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+the+SecY+translocon+in+Nanodiscs.">Reconstitution of the SecY translocon in Nanodiscs.</a> Methods Mol. Biol. 619, 145-156 (2010).</li><li>Lanzetta, P. A., Alvarez, L. J., Reinach, P. S., Candia, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+assay+for+nanomole+amounts+of+inorganic+phosphate.">An improved assay for nanomole amounts of inorganic phosphate.</a> Anal. Biochem. 100, 95-97 (1979).</li><li>Davidson, A. L., Dassa, E., Orelle, C., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure,+function+and+evolution+of+bacterial+ATP-binding+cassette+systems.">Structure, function and evolution of bacterial ATP-binding cassette systems.</a> Microbiol. Mol. Biol. Rev. 72, 317-364 (2008).</li><li>Bordignon, E., Grote, M., Schneider, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+maltose+ATP-binding+cassette+transporter+in+the+21st+century-towards+a+structural+dynamic+perspective+on+its+mode+of+action.">The maltose ATP-binding cassette transporter in the 21st century-towards a structural dynamic perspective on its mode of action.</a> Mol. Microbiol. 77, 1354-1366 (2010).</li><li>Alvarez, F. J., Orelle, C., Davidson, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+reconstitution+of+an+ABC+transporter+for+use+in+electron+paramagnetic+resonance+spectroscopy.">Functional reconstitution of an ABC transporter for use in electron paramagnetic resonance spectroscopy.</a> J. Am. Chem. Soc. 132, 9513-9515 (2010).</li><li>Ritchie, T. K., Grinkova, Y. V., Bayburt, T. H., Denisov, I. G., Zolnerciks, J. K., Atkins, W. M., Sligar, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+membrane+proteins+in+phospholipid+bilayer+Nanodiscs.">Reconstitution of membrane proteins in phospholipid bilayer Nanodiscs.</a> Methods Enzymol. 464, 211-231 (2009).</li><li>Gl&#252;ck, J. M., Koenig, B. W., Willbold, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanodiscs+allow+the+use+of+integral+membrane+proteins+as+analytes+in+surface+plasmon+resonance+studies.">Nanodiscs allow the use of integral membrane proteins as analytes in surface plasmon resonance studies.</a> Anal. Biochem. 408, 46-52 (2011).</li><li>Wan, C. -. P. L., Chiu, M. H., Wu, X., Lee, S. K., Prenner, E. J., Weers, P. M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apolipoprotein-induced+conversion+of+phosphatidylcholine+bilayer+vesicles+into+nanodisks.">Apolipoprotein-induced conversion of phosphatidylcholine bilayer vesicles into nanodisks.</a> Biochim. Biophys. Acta (BBA). 1808, 606-613 (2011).</li><li>Nath, A., Trexler, A. J., Koo, P. K., Miranker, A. D., Atkins, W. M., Rhoades, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+fluorescence+spectroscopy+using+phospholipid+bilayer+Nanodiscs.">Single-molecule fluorescence spectroscopy using phospholipid bilayer Nanodiscs.</a> Methods Enzymol. 472, 89-117 (2010).</li><li>Denisov, I. G., Sligar, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytochromes+P450+in+Nanodiscs.">Cytochromes P450 in Nanodiscs.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1814, 223-229 (2011).</li><li>Zhang, X. X., Chan, C. S., Bao, H., Fang, Y., Foster, L. J., Duong, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanodiscs+and+SILAC-based+mass+spectrometry+to+identify+a+membrane+protein+interactome.">Nanodiscs and SILAC-based mass spectrometry to identify a membrane protein interactome.</a> J. Proteome Res. , (2011).</li></ol>

אנו מתארים הליך פשוט לכינון מחדש של טרנספורטר מלטוז לnanodiscs. טרנספורטר הוא ATPase הפעיל והאינטראקציה עם זכר השותף מחייב המסיס ניתן ליצור מחדש (איור 3). הכינון מחדש המוצלח של טרנספורטר לnanodiscs לפתוח את הדרך לניתוח biophysical וביוכימיים נוספים. מעניין במיוחד יהיה הניתוח...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם המגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> Amicon Ultra-4 50K מסנן צנטריפוגלי </td><td> Millipore </td><td> UFC805008 </td><td> עקוב הפרוטוקול של היצרן לשימוש נכון </td></tr><tr><td> Bio-חרוזי SM-2 כושר ספיג </td><td> Bio-Rad </td><td> 152-3920 </td><td></td></tr><tr><td> חיידק שומנים כלל </td><td> שומני פולאר AVANTI </td><td> 100500C </td><td> מומס בכלורופורם, לטפל לפי צורך ממס אורגני </td></tr><tr><td> Ni sepharose HP שרף </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-5268-01 </td><td></td></tr><tr><td> פתרון סטנדרטי זרחן </td><td>סיגמה אולדריץ </td><td> P3869 </td><td></td></tr><tr><td> pMSP1D1 </td><td> Addgene </td><td> 20061 </td><td></td></tr><tr><td> Superdex 200 HR 10/300 </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-5172-01 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> ריאגנטים ספציפיים I. טבלה. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם </td><td> הרכב </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> DDM המניות </td><td> 10% w / v DDM </td><td> Resuspend במים וחנות milliQ ב -20 ° C </td></tr><tr><td> 2 מניות MalFGK </td><td> 1-2 מ&quot;ג / מ&quot;ל 50 mM טריס-HCl, pH7.9 100 המ&quot;מימ NaCl 10% גליצרול v / v 0.03% w / v DDM </td><td> חנות ב -70 ° C לאחר טיהור </td></tr><tr><td> MSP המניות </td><td> 10-15 מ&quot;ג / מ&quot;ל 50 mM טריס-HCl, pH7.9 100 המ&quot;מימ NaCl 10% גליצרול v / v </td><td> חנות ב -70 ° C לאחר טיהור ב&lt; 1 aliquots המ&quot;ל ולהימנע ממחזורים מוגזמים הקפאה / פשרה </td></tr><tr><td> מניית פוספוליפידים </td><td> 5 nM E. coli סך שומנים 0.5% w / v (10 מ&quot;מ) DDM 50 mM טריס-HCl, 7.9 pH 50 mM NaCl </td><td> חנות ב 4 מעלות צלזיוס למשך השבוע 1 </td></tr><tr><td> TS חיץ </td><td> 50 mM טריס-HCl, 7.9 pH 50 mM NaCl </td><td> לאחסן ב 4 ° C </td></tr><tr><td> TSG10 חיץ </td><td> 50 mM טריס-HCl, pH7.9 100 המ&quot;מימ NaCl 10% גליצרול v / v </td><td> לאחסן ב 4 ° C </td></tr><tr><td> TSG20 חיץ </td><td> 50 mM טריס-HCl, pH8 100 המ&quot;מימ NaCl 20% גליצרול v / v </td><td> לאחסן ב 4 ° C </td></tr><tr><td> חיץ TSGD </td><td> 50 mM טריס-HCl, pH7.9 100 המ&quot;מימ NaCl 10% גליצרול v / v 0.03% w / v DDM </td><td> חנות ב 4 ° C ולהוסיף DDM ממש לפני השימוש </td></tr><tr><td colspan="3"> טבלה השנייה. פתרון מתכונים. </td></tr></tbody></table></td></tr></tbody></table>

a step-by-step method for the reconstitution of an abc transporter into nanodisc lipid particles

Nanodisc הוא חלקיק discoidal (~ 10-12 ננומטר גדול) שחלבוני קרום מלכודת תיקון קטן של bilayer פוספוליפידים. Nanodisc היא אופציה אטרקטיבית במיוחד ללימוד חלבונים בממברנה, במיוחד בהקשר של יחסי גומלין יגנד לרצפטור. השיטה החלוצית שSligar ועמיתים מתבססים על המאפיינים של amphipathic מהונדס מאוד סליל חלבון פיגום נגזר מאפוליפופרוטאין A1. הפנים ההידרופובי של חלבון פיגום אינטראקציה עם רשתות הלוואי acyl השומן של bilayer השומנים ואילו אזורי הקוטב להתמודד בסביבה המימית. אנליזות של חלבוני קרום בnanodiscs יש יתרונות משמעותיים על פני יפוזום מפני החלקיקים קטנים, הומוגנית ומסיסים במים. בנוסף, שיטות ביוכימיות וbiophysical השמורים בדרך כלל לחלבונים מסיסים יכולות להיות מיושם, ומשני הצדדים של הקרום. בפרוטוקול החזותי הזה, אנו מציגים כינון מחדש צעד אחר צעד וגם characטרנספורטר terized חיידקי ABC, 2 המורכב גברי MalFGK. ההיווצרות של הדיסק היא תהליך הרכבה עצמית שתלוי באינטראקציות הידרופוביות המתרחשות במהלך ההסרה ההדרגתית של חומר הניקוי. אנו מתארים את הצעדים החיוניים ואנו מדגישים את החשיבות של בחירה נכון יחס חלבון לשומנים בדם, במטרה לצמצם את ההיווצרות של אגרגטים וחלקיקים גדולים יותר polydisperse יפוזום דמויים. איכות פשוט שולטת כגון כרומטוגרפיה ג&#39;ל סינון, ג&#39;ל אלקטרופורזה יליד וספקטרוסקופיה פיזור האור דינאמי להבטיח כי את הדיסקים כבר מחדש כראוי.

Watch this Scientific Journal Video about A Step-by-step Method for the Reconstitution of an ABC Transporter into Nanodisc Lipid Particles at JoVE.com

A Step-by-step Method for the Reconstitution of an ABC Transporter into Nanodisc Lipid Particles

Nanodiscs הם חלקיקי discoid קטנים המשלבים חלבונים בממברנה לתיקון קטן של bilayer פוספוליפידים. אנו מספקים פרוטוקול חזותי המציג את שילוב צעד אחר הצעד של טרנספורטר MalFGK2 לתוך דיסק.

שיטת צעד אחר צעד לכינונה מחדש של טרנספורטר ABC לחלקיקי ליפידים Nanodisc

The nanodisc is a discoidal particle (~ 10-12 nm large) that trap membrane proteins into a small patch of phospholipid bilayer. The nanodisc is a ...

Research

JoVE Journal

Biology

Expression, Detergent Solubilization, and Purification of a Membrane Transporter, the MexB Multidrug Resistance Protein

הביטוי, solubilization דטרגנט, ועל טיהור Transporter ממברנה, חלבון ההתנגדות MexB Multidrug

Multidrug resistance (MDR), the ability of a cancer cell or pathogen to be resistant to a wide range of structurally and functionally unrelated ...

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting (LIMACS): a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting LIMACS: a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

שלפוחיות בתיווך זיקה ליפידים כרומטוגרפיה באמצעות Cell מגנטי מיון פעיל (LIMACS): שיטה חדשה לנתח חלבון, שומנים אינטראקציה

The analysis of lipid protein interaction is difficult because lipids are embedded in cell membranes and therefore, inaccessible to most purification ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

ב הכינון במבחנה של ט פעילים castaneum שהטלומרז

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

A Simple Method for Imaging Arabidopsis Leaves Using Perfluorodecalin as an Infiltrative Imaging Medium

A Simple Method for Imaging Arabidopsis Leaves Using Perfluorodecalin as an Infiltrative Imaging Medium

שיטה פשוטה הדמיה ארבידופסיס מותיר שימוש Perfluorodecalin כנושאת הדמיה Infiltrative

The problem of acquiring high-resolution images deep into biological samples is widely acknowledged1. In air-filled tissue such as the spongy mesophyll of ...

Reconstitution of a Kv Channel into Lipid Membranes for Structural and Functional Studies

כינונה מחדש של ערוץ Kv לממברנות שומנים בדם למבני ותפקודיים ללימודים

To study the lipid-protein interaction in a reductionistic fashion, it is necessary to incorporate the membrane proteins into membranes of well-defined ...

Reconstitution of a Transmembrane Protein, the Voltage-gated Ion Channel, KvAP, into Giant Unilamellar Vesicles for Microscopy and Patch Clamp Studies

כינונה מחדש של חלבון טראנסממברנלי, יון ערוץ מתח מגודרת, KvAP, לענק Unilamellar שלפוחית ​​למיקרוסקופי וצמד תיקון ללימודים

Giant Unilamellar Vesicles (GUVs) are a popular biomimetic system for studying membrane associated phenomena. However, commonly used protocols to grow ...

Procedure to Evaluate the Efficiency of Flocculants for the Removal of Dispersed Particles from Plant Extracts

נוהל כדי להעריך את היעילות של flocculants להרחקת מפוזרי חלקיקים מן תמציות צמחים

Plants are important to humans not only because they provide commodities such as food, feed and raw materials, but increasingly because they can be used ...

An Efficient In Vitro Transposition Method by a Transcriptionally Regulated Sleeping Beauty System Packaged into an Integration Defective Lentiviral Vector

An Efficient In Vitro Transposition Method by a Transcriptionally Regulated Sleeping Beauty System Packaged into an Integration Defective Lentiviral Vector

שיטת טרנספוזיציה יעיל במבחנה על-ידי מערכת יופי ישן Transcriptionally מוסדרים הארוזים לתוך וקטור Lentiviral פגומים אינטגרציה

The Sleeping Beauty (SB) transposon is a non-viral integrating system with proven efficacy for gene transfer and functional genomics. To optimize the SB ...

An Air-liquid Interface Bronchial Epithelial Model for Realistic, Repeated Inhalation Exposure to Airborne Particles for Toxicity Testing

מודל אפיתל ממשק נוזלי אוויר לחשיפה מציאותית וחוזרת ונשנית לחלקיקים מוטסים לבדיקות רעילות

For toxicity testing of airborne particles, air-liquid interface (ALI) exposure systems have been developed for in vitro tests in order to mimic realistic ...

Tethered Bilayer Lipid Membranes to Monitor Heat Transfer between Gold Nanoparticles and Lipid Membranes

ממברנות שומנים דו-שכבתיות קשורות לניטור העברת חום בין חלקיקי זהב וממברנות שומנים

Here we report a protocol to investigate the heat transfer between irradiated gold nanoparticles (GNPs) and bilayer lipid membranes by electrochemistry ...