Name: a step-by-step method for the reconstitution of an abc transporter into nanodisc lipid particles
Uploaded: 2012-08-31T12:00:00
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इस काम की कनाडा के स्वास्थ्य अनुसंधान संस्थान द्वारा समर्थित किया गया. सीएससी प्राकृतिक विज्ञान और कनाडा के इंजीनियरिंग रिसर्च काउंसिल से एक postdoctoral फैलोशिप द्वारा वित्त पोषित किया गया था. एफडी एक द्वितीय श्रेणी कनाडा अनुसंधान चेयर है.

<html> कुल मिलाकर पुनर्गठन प्रक्रिया पुनर्गठन प्रक्रिया शुद्ध MalFGK 2 जटिल साथ डिटर्जेंट solubilized phospholipids की उपस्थिति में झिल्ली पाड़ प्रोटीन (एमएसपी) के मिश्रण से शुरू होता है. कदम जैव मोती या Amberlite (1 ...

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	<li>Denisov, I. G., Ginkova, Y. V., Lazarides, A. A., Sligar, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+self-assembly+of+monodisperse+phospholipid+bilayer+Nanodiscs+with+controlled+size.">Directed self-assembly of monodisperse phospholipid bilayer Nanodiscs with controlled size.</a> J. Am. Chem. Soc. 126, 3477-3487 (2004).</li><li>Boldog, T., Grimme, S., Li, M., Sligar, S. G., Hazelbauer, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanodiscs+separate+chemoreceptor+oligomeric+states+and+reveal+their+signaling+properties.">Nanodiscs separate chemoreceptor oligomeric states and reveal their signaling properties.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 103, 11509-11514 (2006).</li><li>Bass, B. J., Denisov, I. G., Sligar, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homotropic+cooperativity+of+monomeric+cytochrome+P450+3A4+in+a+nanoscale+native+bilayer+environment.">Homotropic cooperativity of monomeric cytochrome P450 3A4 in a nanoscale native bilayer environment.</a> J. Biol. Chem. 282, 7066-7076 (2007).</li><li>Alami, M., Dalal, K., Lelj-Garolla, B., Sligar, S. G., Duong, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanodiscs+unravel+the+interaction+between+the+SecYEG+channel+and+its+cytosolic+partner+SecA.">Nanodiscs unravel the interaction between the SecYEG channel and its cytosolic partner SecA.</a> EMBO J. 26, 1995-2004 (2007).</li><li>Mi, L. -. Z., Grey, M. J., Nishida, N., Walz, T., Lu, C., Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+and+structural+stability+of+the+epidermal+growth+factor+receptor+in+detergent+micelles+and+phospholipid+nanodiscs.">Functional and structural stability of the epidermal growth factor receptor in detergent micelles and phospholipid nanodiscs.</a> Biochemistry. 47, 10314-10323 (2008).</li><li>Sch&#228;gger, H., Cramer, W. A., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+molecular+masses+and+oligomeric+states+of+protein+complexes+by+blue+native+electrophoresis+and+isolation+of+membrane+protein+complexes+by+two-dimensional+native+electrophoresis.">Analysis of molecular masses and oligomeric states of protein complexes by blue native electrophoresis and isolation of membrane protein complexes by two-dimensional native electrophoresis.</a> Anal. Biochem. 217, 220-230 (1994).</li><li>Dalal, K., Duong, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+the+SecY+translocon+in+Nanodiscs.">Reconstitution of the SecY translocon in Nanodiscs.</a> Methods Mol. Biol. 619, 145-156 (2010).</li><li>Lanzetta, P. A., Alvarez, L. J., Reinach, P. S., Candia, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+assay+for+nanomole+amounts+of+inorganic+phosphate.">An improved assay for nanomole amounts of inorganic phosphate.</a> Anal. Biochem. 100, 95-97 (1979).</li><li>Davidson, A. L., Dassa, E., Orelle, C., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure,+function+and+evolution+of+bacterial+ATP-binding+cassette+systems.">Structure, function and evolution of bacterial ATP-binding cassette systems.</a> Microbiol. Mol. Biol. Rev. 72, 317-364 (2008).</li><li>Bordignon, E., Grote, M., Schneider, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+maltose+ATP-binding+cassette+transporter+in+the+21st+century-towards+a+structural+dynamic+perspective+on+its+mode+of+action.">The maltose ATP-binding cassette transporter in the 21st century-towards a structural dynamic perspective on its mode of action.</a> Mol. Microbiol. 77, 1354-1366 (2010).</li><li>Alvarez, F. J., Orelle, C., Davidson, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+reconstitution+of+an+ABC+transporter+for+use+in+electron+paramagnetic+resonance+spectroscopy.">Functional reconstitution of an ABC transporter for use in electron paramagnetic resonance spectroscopy.</a> J. Am. Chem. Soc. 132, 9513-9515 (2010).</li><li>Ritchie, T. K., Grinkova, Y. V., Bayburt, T. H., Denisov, I. G., Zolnerciks, J. K., Atkins, W. M., Sligar, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+membrane+proteins+in+phospholipid+bilayer+Nanodiscs.">Reconstitution of membrane proteins in phospholipid bilayer Nanodiscs.</a> Methods Enzymol. 464, 211-231 (2009).</li><li>Gl&#252;ck, J. M., Koenig, B. W., Willbold, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanodiscs+allow+the+use+of+integral+membrane+proteins+as+analytes+in+surface+plasmon+resonance+studies.">Nanodiscs allow the use of integral membrane proteins as analytes in surface plasmon resonance studies.</a> Anal. Biochem. 408, 46-52 (2011).</li><li>Wan, C. -. P. L., Chiu, M. H., Wu, X., Lee, S. K., Prenner, E. J., Weers, P. M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apolipoprotein-induced+conversion+of+phosphatidylcholine+bilayer+vesicles+into+nanodisks.">Apolipoprotein-induced conversion of phosphatidylcholine bilayer vesicles into nanodisks.</a> Biochim. Biophys. Acta (BBA). 1808, 606-613 (2011).</li><li>Nath, A., Trexler, A. J., Koo, P. K., Miranker, A. D., Atkins, W. M., Rhoades, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+fluorescence+spectroscopy+using+phospholipid+bilayer+Nanodiscs.">Single-molecule fluorescence spectroscopy using phospholipid bilayer Nanodiscs.</a> Methods Enzymol. 472, 89-117 (2010).</li><li>Denisov, I. G., Sligar, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytochromes+P450+in+Nanodiscs.">Cytochromes P450 in Nanodiscs.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1814, 223-229 (2011).</li><li>Zhang, X. X., Chan, C. S., Bao, H., Fang, Y., Foster, L. J., Duong, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanodiscs+and+SILAC-based+mass+spectrometry+to+identify+a+membrane+protein+interactome.">Nanodiscs and SILAC-based mass spectrometry to identify a membrane protein interactome.</a> J. Proteome Res. , (2011).</li></ol>

हम nanodiscs में maltose ट्रांसपोर्टर के पुनर्गठन के लिए एक सरल प्रक्रिया का वर्णन करता है. ट्रांसपोर्टर ATPase सक्रिय है और घुलनशील बाध्यकारी साथी पुरुष के साथ बातचीत (3 चित्रा) निर्मित किया जा सकता है. nanodiscs में ...

<table border="1"><tbody><tr><td> अभिकर्मक के नाम </td><td> कंपनी </td><td> सूचीपत्र संख्या </td><td> टिप्पणियां </td></tr><tr><td> Amicon अल्ट्रा 4-50K केन्द्रापसारक फिल्टर </td><td> Millipore </td><td> UFC805008 </td><td> समुचित उपयोग के लिए निर्माता प्रोटोकॉल का पालन करें </td></tr><tr><td> जैव मोती SM-2 Adsorbent </td><td> जैव रेड </td><td> 152-3920 </td><td></td></tr><tr><td> ई. कोलाई कुल lipids </td><td> अवंती ध्रुवीय Lipids </td><td> 100500C </td><td> क्लोरोफॉर्म में भंग, एक कार्बनिक विलायक के लिए उपयुक्त के रूप में संभाल </td></tr><tr><td> नी sepharose अश्वशक्ति राल </td><td> जीई हेल्थकेयर </td><td> 17-5268-01 </td><td></td></tr><tr><td> फॉस्फोरस मानक समाधान </td><td>सिग्मा Aldrich </td><td> P3869 </td><td></td></tr><tr><td> pMSP1D1 </td><td> Addgene </td><td> 20061 </td><td></td></tr><tr><td> Superdex 200/300 10 मानव संसाधन </td><td> जीई हेल्थकेयर </td><td> 17-5172-01 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> टेबल मैं विशिष्ट अभिकर्मकों. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><table border="1"><tbody><tr><td> नाम </td><td> रचना </td><td> टिप्पणियां </td></tr><tr><td> DDM स्टॉक </td><td> 10% w / v DDM </td><td> -20 डिग्री सेल्सियस पर milliQ पानी और दुकान में Resuspend </td></tr><tr><td> MalFGK 2 स्टॉक </td><td> 1-2 मिग्रा / मिली 50 मिमी Tris एचसीएल, pH7.9 100 मिमी NaCl 10% ग्लिसरॉल v / v 0.03% DDM w / v </td><td> -70 पर स्टोर ° C शुद्धि के बाद </td></tr><tr><td> एमएसपी स्टॉक </td><td> 10-15 मिलीग्राम / एमएल 50 मिमी Tris एचसीएल, pH7.9 100 मिमी NaCl 10% ग्लिसरॉल v / v </td><td> -70 पर स्टोर ° C &lt;1 मिलीलीटर aliquots में शुद्धिकरण के बाद और अत्यधिक स्थिर / गल चक्र से बचने </td></tr><tr><td> फॉस्फोलिपिड स्टॉक </td><td> 5 एनएम ई. कोलाई lipids कुल 0.5% w / v DDM (10 मिमी) 50 मिमी Tris एचसीएल, 7.9 पीएच 50 मिमी NaCl </td><td> 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 सप्ताह के लिए स्टोर </td></tr><tr><td> टीएस बफर </td><td> 50 मिमी Tris एचसीएल, 7.9 पीएच 50 मिमी NaCl </td><td> 4 में स्टोर डिग्री सेल्सियस </td></tr><tr><td> TSG10 बफर </td><td> 50 मिमी Tris एचसीएल, pH7.9 100 मिमी NaCl 10% ग्लिसरॉल v / v </td><td> 4 में स्टोर डिग्री सेल्सियस </td></tr><tr><td> TSG20 बफर </td><td> 50 मिमी Tris एचसीएल, PH8 100 मिमी NaCl 20% ग्लिसरॉल v / v </td><td> 4 में स्टोर डिग्री सेल्सियस </td></tr><tr><td> TSGD बफर </td><td> 50 मिमी Tris एचसीएल, pH7.9 100 मिमी NaCl 10% ग्लिसरॉल v / v 0.03% DDM w / v </td><td> 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर और उपयोग करने से पहले सिर्फ DDM जोड़ने </td></tr><tr><td colspan="3"> तालिका II समाधान व्यंजनों. </td></tr></tbody></table></td></tr></tbody></table>

a step-by-step method for the reconstitution of an abc transporter into nanodisc lipid particles

nanodisc एक चक्रिकाभ (बड़े ~ 10-12 एनएम) कण कि फॉस्फोलिपिड bilayer के एक छोटे पैच में जाल झिल्ली प्रोटीन. nanodisc झिल्ली प्रोटीन ligand-रिसेप्टर बातचीत के संदर्भ में विशेष रूप से, के अध्ययन के लिए एक विशेष रूप से आकर्षक विकल्प है. विधि Sligar ने बीड़ा उठाया है और उनके सहयोगियों ने एक इंजीनियर अत्यधिक एक पेचदार पाड़ अपोलीपोप्रोटीन A1 से व्युत्पन्न प्रोटीन के amphipathic गुणों पर आधारित है. पाड़ प्रोटीन की hydrophobic चेहरे फैटी लिपिड bilayer के एसाइल पक्ष श्रृंखला के साथ बातचीत जबकि ध्रुवीय क्षेत्रों जलीय वातावरण का सामना करना पड़ता है. Nanodiscs में झिल्ली प्रोटीन का विश्लेषण liposome अधिक महत्वपूर्ण लाभ है, क्योंकि छोटे कणों, सजातीय और पानी में घुलनशील हैं. इसके अलावा, जैव रासायनिक और biophysical घुलनशील प्रोटीन के लिए सामान्य रूप से सुरक्षित तरीके लागू किया जा सकता है और झिल्ली के दोनों ओर से. इस दृश्य प्रोटोकॉल में, हम एक अच्छी तरह से चरित्र की एक पुनर्गठन कदम दर कदम उपस्थितterized बैक्टीरियल एबीसी ट्रांसपोर्टर, पुरुष MalFGK 2 जटिल. डिस्क के गठन प्रक्रिया विधानसभा स्वयं कि hydrophobic डिटर्जेंट के प्रगतिशील हटाने के दौरान जगह लेने के बातचीत पर निर्भर करता है. हम आवश्यक कदम का वर्णन है और हम एक सही अनुपात प्रोटीन लिपिड चुनने के क्रम में करने के लिए समुच्चय और बड़े polydisperse liposome कणों की तरह के निर्माण को सीमा के महत्व पर प्रकाश डाला. सरल जेल निस्पंदन क्रोमैटोग्राफी, देशी जेल वैद्युतकणसंचलन और गतिशील प्रकाश बिखरने स्पेक्ट्रोस्कोपी के रूप में यह सुनिश्चित करें कि डिस्क ठीक से पुनर्गठन किया गया है गुणवत्ता को नियंत्रित करता है.

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A Step-by-step Method for the Reconstitution of an ABC Transporter into Nanodisc Lipid Particles

Nanodiscs छोटे चक्रिकाभ कणों कि फॉस्फोलिपिड bilayer के एक छोटे पैच में झिल्ली प्रोटीन को शामिल कर रहे हैं. हम एक दृश्य प्रोटोकॉल है कि एक डिस्क में MalFGK2 ट्रांसपोर्टर के समावेश कदम दर कदम से पता चलता है प्रदान करते हैं.

Nanodisc लिपिड कणों में एक एबीसी ट्रांसपोर्टर के पुनर्गठन के लिए एक विधि कदम दर कदम

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