Name: a step-by-step method for the reconstitution of an abc transporter into nanodisc lipid particles
Uploaded: 2012-08-31T12:00:00
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この作品は、保健研究のカナダの研究所によってサポートされていました。 CSCは、自然科学とカナダの工学研究評議会からのポスドクによって賄われていた。 FDはティアIIカナダリサーチチェアです。

<html>全体の再構築プロセス再構成プロセスは、洗剤で可溶化したリン脂質の存在下で精製MalFGK 2複合体と膜骨格タンパク質（MSP）を混合することによって開始されます。ステップは、Bio-ビーズまたはアンバーライト（ 図1）と呼ばれるポリスチレン系吸着材による洗剤の遅い除去のあとに続いています。自動組立工程が原因疎水性リン脂質、MalFGK 2</...

<ol>
	<li>Denisov, I. G., Ginkova, Y. V., Lazarides, A. A., Sligar, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+self-assembly+of+monodisperse+phospholipid+bilayer+Nanodiscs+with+controlled+size.">Directed self-assembly of monodisperse phospholipid bilayer Nanodiscs with controlled size.</a> J. Am. Chem. Soc. 126, 3477-3487 (2004).</li><li>Boldog, T., Grimme, S., Li, M., Sligar, S. G., Hazelbauer, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanodiscs+separate+chemoreceptor+oligomeric+states+and+reveal+their+signaling+properties.">Nanodiscs separate chemoreceptor oligomeric states and reveal their signaling properties.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 103, 11509-11514 (2006).</li><li>Bass, B. J., Denisov, I. G., Sligar, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homotropic+cooperativity+of+monomeric+cytochrome+P450+3A4+in+a+nanoscale+native+bilayer+environment.">Homotropic cooperativity of monomeric cytochrome P450 3A4 in a nanoscale native bilayer environment.</a> J. Biol. Chem. 282, 7066-7076 (2007).</li><li>Alami, M., Dalal, K., Lelj-Garolla, B., Sligar, S. G., Duong, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanodiscs+unravel+the+interaction+between+the+SecYEG+channel+and+its+cytosolic+partner+SecA.">Nanodiscs unravel the interaction between the SecYEG channel and its cytosolic partner SecA.</a> EMBO J. 26, 1995-2004 (2007).</li><li>Mi, L. -. Z., Grey, M. J., Nishida, N., Walz, T., Lu, C., Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+and+structural+stability+of+the+epidermal+growth+factor+receptor+in+detergent+micelles+and+phospholipid+nanodiscs.">Functional and structural stability of the epidermal growth factor receptor in detergent micelles and phospholipid nanodiscs.</a> Biochemistry. 47, 10314-10323 (2008).</li><li>Sch&#228;gger, H., Cramer, W. A., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+molecular+masses+and+oligomeric+states+of+protein+complexes+by+blue+native+electrophoresis+and+isolation+of+membrane+protein+complexes+by+two-dimensional+native+electrophoresis.">Analysis of molecular masses and oligomeric states of protein complexes by blue native electrophoresis and isolation of membrane protein complexes by two-dimensional native electrophoresis.</a> Anal. Biochem. 217, 220-230 (1994).</li><li>Dalal, K., Duong, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+the+SecY+translocon+in+Nanodiscs.">Reconstitution of the SecY translocon in Nanodiscs.</a> Methods Mol. Biol. 619, 145-156 (2010).</li><li>Lanzetta, P. A., Alvarez, L. J., Reinach, P. S., Candia, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+assay+for+nanomole+amounts+of+inorganic+phosphate.">An improved assay for nanomole amounts of inorganic phosphate.</a> Anal. Biochem. 100, 95-97 (1979).</li><li>Davidson, A. L., Dassa, E., Orelle, C., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure,+function+and+evolution+of+bacterial+ATP-binding+cassette+systems.">Structure, function and evolution of bacterial ATP-binding cassette systems.</a> Microbiol. Mol. Biol. Rev. 72, 317-364 (2008).</li><li>Bordignon, E., Grote, M., Schneider, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+maltose+ATP-binding+cassette+transporter+in+the+21st+century-towards+a+structural+dynamic+perspective+on+its+mode+of+action.">The maltose ATP-binding cassette transporter in the 21st century-towards a structural dynamic perspective on its mode of action.</a> Mol. Microbiol. 77, 1354-1366 (2010).</li><li>Alvarez, F. J., Orelle, C., Davidson, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+reconstitution+of+an+ABC+transporter+for+use+in+electron+paramagnetic+resonance+spectroscopy.">Functional reconstitution of an ABC transporter for use in electron paramagnetic resonance spectroscopy.</a> J. Am. Chem. Soc. 132, 9513-9515 (2010).</li><li>Ritchie, T. K., Grinkova, Y. V., Bayburt, T. H., Denisov, I. G., Zolnerciks, J. K., Atkins, W. M., Sligar, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+membrane+proteins+in+phospholipid+bilayer+Nanodiscs.">Reconstitution of membrane proteins in phospholipid bilayer Nanodiscs.</a> Methods Enzymol. 464, 211-231 (2009).</li><li>Gl&#252;ck, J. M., Koenig, B. W., Willbold, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanodiscs+allow+the+use+of+integral+membrane+proteins+as+analytes+in+surface+plasmon+resonance+studies.">Nanodiscs allow the use of integral membrane proteins as analytes in surface plasmon resonance studies.</a> Anal. Biochem. 408, 46-52 (2011).</li><li>Wan, C. -. P. L., Chiu, M. H., Wu, X., Lee, S. K., Prenner, E. J., Weers, P. M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apolipoprotein-induced+conversion+of+phosphatidylcholine+bilayer+vesicles+into+nanodisks.">Apolipoprotein-induced conversion of phosphatidylcholine bilayer vesicles into nanodisks.</a> Biochim. Biophys. Acta (BBA). 1808, 606-613 (2011).</li><li>Nath, A., Trexler, A. J., Koo, P. K., Miranker, A. D., Atkins, W. M., Rhoades, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+fluorescence+spectroscopy+using+phospholipid+bilayer+Nanodiscs.">Single-molecule fluorescence spectroscopy using phospholipid bilayer Nanodiscs.</a> Methods Enzymol. 472, 89-117 (2010).</li><li>Denisov, I. G., Sligar, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytochromes+P450+in+Nanodiscs.">Cytochromes P450 in Nanodiscs.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1814, 223-229 (2011).</li><li>Zhang, X. X., Chan, C. S., Bao, H., Fang, Y., Foster, L. J., Duong, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanodiscs+and+SILAC-based+mass+spectrometry+to+identify+a+membrane+protein+interactome.">Nanodiscs and SILAC-based mass spectrometry to identify a membrane protein interactome.</a> J. Proteome Res. , (2011).</li></ol>

我々はnanodiscsにマルトーストランスポーターの再構成のための簡単​​な手順を説明します。トランスポーターは、ATPアーゼ活性であり、水溶性の結合パートナーの男性との相互作用が（ 図3）再現することができます。 nanodiscsにトランスポーターの成功した再構成には、追加の生物物理学的および生化学的解析のための道を開く。特に興味深いのは、体系的な分析洗剤、リポ?...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> 注釈 </td></tr><tr><td>アミコンウルトラ-4 50K遠心フィルター</td><td>ミリポア</td><td> UFC805008 </td><td>適切な使用については、製造元のプロトコルに従ってください</td></tr><tr><td>バイオビーズSM-2吸着剤</td><td>バイオ·ラッド</td><td> 152-3920 </td><td></td></tr><tr><td> 大腸菌総脂質</td><td>アヴァンティ極性脂質</td><td> 100500C </td><td>クロロホルムに溶解し、有機溶剤に応じて扱う</td></tr><tr><td> NiセファロースHPの樹脂</td><td> GEヘルスケア</td><td> 17-5268-01 </td><td></td></tr><tr><td>リン標準溶液</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> P3869 </td><td></td></tr><tr><td> pMSP1D1 </td><td> Addgene </td><td> 20061 </td><td></td></tr><tr><td>たSuperdex 200 HR 300分の10 </td><td> GEヘルスケア</td><td> 17-5172-01 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 表Iに特異的な試薬。 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><table border="1"><tbody><tr><td> 名前 </td><td> 構図 </td><td> 注釈 </td></tr><tr><td> DDMの株式</td><td>の10％w / vのDDM </td><td> -20℃でミリQ水とストアに再懸濁</td></tr><tr><td> MalFGK 2株式</td><td> 1から2 mg / mlの 50mMトリス-HCl、pH7.9 100mMのNaCl 10％v / vのグリセロール 0.03パーセントw / vのDDM </td><td> -70℃で保存精製後</td></tr><tr><td> MSPの株式</td><td> 10から15 mg / mlの 50mMトリス-HCl、pH7.9 100mMのNaCl 10％v / vのグリセロール</td><td> -70℃で保存&lt;1mlのアリコートで精製後や過度の凍結/融解サイクルを避ける</td></tr><tr><td>リン脂質株式</td><td> 5nMのE.大腸菌総脂質 0.5パーセントw / vの（10mM）を、DDM 50mMのトリス-HCl、pH 7.9 50mMのNaCl </td><td> 1週間に4℃で保存</td></tr><tr><td> TSバッファ</td><td> 50mMのトリス-HCl、pH 7.9 50mMのNaCl </td><td> 4℃で保存</td></tr><tr><td> TSG10バッファ</td><td> 50mMトリス-HCl、pH7.9 100mMのNaCl 10％v / vのグリセロール</td><td> 4℃で保存</td></tr><tr><td> TSG20バッファ</td><td> 50mMトリス-HCl、PH8 100mMのNaCl 20パーセントv / vグリセロール</td><td> 4℃で保存</td></tr><tr><td> TSGDバッファ</td><td> 50mMトリス-HCl、pH7.9 100mMのNaCl 10％v / vのグリセロール 0.03パーセントw / vのDDM </td><td> 4℃で保存し、使用直前にDDMを追加</td></tr><tr><td colspan="3"> 表II。ソリューションレシピ。 </td></tr></tbody></table></td></tr></tbody></table>

a step-by-step method for the reconstitution of an abc transporter into nanodisc lipid particles

nanodiscは、円盤状の粒子（〜10月12日NM大）リン脂質二重層の小さなパッチにトラップ膜タンパク質ということです。 nanodiscは特にリガンド - 受容体相互作用の文脈では、膜タンパク質を研究するために特に魅力的な選択肢である。 Sligarらによって開拓方法はアポリポタンパク質A1由来組み換え高ヘリカル足場タンパク質の両親媒性の性質に基づいている。極地は、水性環境に直面し、一方足場タンパク質の疎水性面は、脂質二重層の脂肪アシル側鎖と相互作用する。粒子が小さく、均質かつ水溶性であるためnanodiscsにおける膜タンパク質の解析がリポソーム上の重要な利点を持っています。また、通常は水溶性タンパク質に予約生化学的および生物物理学的手法を適用し、膜のいずれかの側からすることができます。この視覚的なプロトコルでは、我々はよく特性のステップ·バイ·ステップの再構成を提示terized細菌のABCトランスポーター、男性MalFGK 2複合体。ディスクの形成は、洗剤の進歩的な除去の際に行われている疎水性相互作用に依存して自己組織化プロセスである。私たちは本質的な手順を説明し、私たちは集合体と大きい多分散リポソーム状粒子の形成を制限するために、正しいタンパク質対脂質比を選択することの重要性を強調。単純な品質は、そのようなディスクが正しく再構成されていることを確認し、ゲル濾過クロマトグラフィー、天然ゲル電気泳動および動的光散乱分光法として制御します。

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A Step-by-step Method for the Reconstitution of an ABC Transporter into Nanodisc Lipid Particles

Nanodiscsはリン脂質二重層の小さなパッチに膜タンパク質を組み込んだ小さな円盤状の粒子である。我々は、ディスクへのMalFGK2ポーターのステップ·バイ·ステップの取り込みを示し視覚プロトコルを提供します。

Nanodisc脂質粒子にABCトランスポーターの再構成のためのステップ·バイ·ステップ方式

The nanodisc is a discoidal particle (~ 10-12 nm large) that trap membrane proteins into a small patch of phospholipid bilayer. The nanodisc is a ...

Research

JoVE Journal

Biology

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